Introduction
Les maladies infectieuses causées par des espèces de la bactérie Chlamydia intracellulaire suscitent un fardeau important sur la santé mondiale, y compris les maladies sexuellement transmissibles, la maladie inflammatoire pelvienne, la cécité, la pneumonie et, éventuellement, l'athérosclérose 1-4. La capacité de Chlamydia d'interagir avec la cellule hôte, à partir de l'intérieur d'une vacuole (appelée inclusion), est un facteur déterminant de leur infection réussie de cellules et de l'hôte. L'inclusion est un compartiment pathogène roman qui permet la croissance de la chlamydia et est modifié dynamiquement tout au long du cycle de développement 2-3 jours de Chlamydia 5. La nature intracellulaire obligatoire de Chlamydia présente de nombreux défis à la communauté de la recherche, en particulier pour étudier directement la biologie unique de l'inclusion. Un handicap majeur a été l'incapacité de visualiser efficacement soit Chlamydia intracellulaire ou leur inclusion par l'approche fluorescentees dans les cellules vivantes. Une découverte récente a finalement révélé les moyens de générer exprimant la GFP C. 6 trachomatis; Toutefois, cette constatation n'a pas encore abouti à un étiquetage spécifique de l'inclusion. Certaines techniques ont été décrites pour l'étiquetage des bactéries et des inclusions 7,8, mais ils souffrent de lacunes tels que la non-spécificité, l'éphémère et la susceptibilité à photoblanchiment. Une découverte clé de notre groupe a établi une nouvelle stratégie pour éclairer l'inclusion en utilisant exprimant la GFP cellules hôtes 9. Cette stratégie exploite rationnellement l'imperméabilité intrinsèque de la membrane de l'inclusion de molécules supérieur à 10 520 Da. Lorsque les cellules sont manipulées pour exprimer de façon stable une protéine fluorescente cytosolique particulier (par exemple, la GFP ou mCherry), inclusions à Chlamydia sont visibles avec une clarté remarquable par leur exclusion complète de la fluorescence. Cette stratégie d'imagerie inverse permet la visualisation immédiate des inclusions pour tous Chlespèces amydia et il peut être facilement adaptés pour la plupart des cellules hôtes d'intérêt. Comme une démonstration de son utilité, cette méthode a été utilisée précédemment pour révéler et de définir les voies de sortie cellulaires pour Chlamydia spp 9.
Ici, nous démontrons encore comment cette méthode est effectuée, et peut être exploitée pour obtenir des données quantitatives clés sur la dynamique de croissance de l'inclusion. En outre, il peut effectivement se substituer aux méthodes de dénombrement à base d'anticorps coûteux et peut être utilisé en tandem avec d'autres marqueurs fluorescents, comme mKate2 exprimant Chlamydia 11. Cette puissante combinaison d'outils permet l'exploration des propriétés physiques de la membrane de l'inclusion Chlamydia intérieur des cellules hôtes de vie.
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Protocol
1. Génération de lignées cellulaires hôtes Fluorescent
- Jour 1. Plate cellules 293T (ou autre ligne d'emballage retroviral) sur des plaques à 6 puits à 2 x 10 6 cellules / puits, à ~ 75% de confluence le lendemain. Si on le souhaite, la plaque de puits en double pour chaque rétrovirus à être utilisés.
- Jour 2. Aspirer cellules et ajouter 2 ml de milieu de croissance frais (DMEM + 10% de FBS + 2 mM de L-glutamine). Transfecter des cellules avec 5-8 ug de chaque vecteur retroviral (contenant la GFP) et le vecteur de l'emballage (par ex., PVSVg) en utilisant de la Lipofectamine 2000 ou similaire réactif et en suivant les instructions du fabricant.
- Incuber les cellules avec de l'ADN de 4-6 heures dans un incubateur à CO 2 C 37 ° C, et ensuite remplacer milieu avec 1 ml de milieu de croissance.
- Incuber les cellules pendant 48 heures à 37 ° C CO 2 incubateur.
- Jour 3. cellules de plaques cibles (par ex., HeLa) sur des plaques à 6 puits à une densité approximative de 10 5 cellules / puits, à ~ 50% de confluence lele prochain jour. Vérifier positif transfection dans des cellules 293T en surveillant fluorescence de la GFP sur un microscope inversé.
- Jour 4. Recueillir surnageants hors des cellules 293T aide d'une pipette et filtrer le surnageant à travers un filtre d'acétate de la seringue de 0,45 um de cellulose contenant un rétrovirus.
- Retirer moyen de cellules HeLa et ajouter du milieu 0,5 ml de croissance contenant 16 pg / ml de polybrène. Ajouter ~ 0,5 ml de rétrovirus filtrée aux cellules goutte à goutte et incuber les cellules dans un C CO 2 incubateur à 37 ° pendant 24 heures. Rangez les éventuels rétrovirus restants (à savoir, à partir du puits en double) à 4 ° C.
- Jour 5. Si les puits en double ont été effectués afin de générer rétrovirus supplémentaire, répétez l'étape 1.7 pour infecter en série avec les particules rétrovirales restants.
- Jour 6. Passage transfectées cellules HeLa 1: 1 dans une boîte de 10 cm contenant le choix des antibiotiques (par exemple, 500 ug / ml de néomycine).
- Attendez suffisamment de temps pour les cellules transduites à repousser en présence de sélection antibiotic, après quoi les cellules peuvent être propagées par des techniques standard avec une concentration plus faible de sélection antibiotique (par ex., 200 pg / ml de néomycine).
Note: Les cellules peuvent également être choisis par clonage pour la luminosité idéale à ce moment, si nécessaire.
2. Génération de la GFP exprimant Chlamydia trachomatis
- Préparer 2x CaCl2 tampon (20 mM Tris pH 7,4, 100 mM de CaCl2) et le tampon 4SP (0,4 M de saccharose, 16 mM de Na 2 HPO 4).
- Jour 1. Décongelez C. trachomatis de stock sur la glace et diluer immédiatement 10 bactéries ul dans 50 pl 2x tampon CaCl 2. Ajouter 3 ADN plasmidique pg (par ex., PASK-GFP-mKate2-L2), bien mélanger et incuber pendant 30 min à 25 ° C.
- Au cours de cette étape, la préparation des cellules hôtes par trypsinisation un flacon T-75 de cellules de McCoy dans un tube de centrifugeuse. Centrifuger la suspension cellulaire à 50 g pendant 5 min et jeter le surnageant. Resuspend culot cellulaire en volume approprié de tampon de CaCl2 1x pour donner une concentration finale de 4 x 10 7 cellules / ml.
- Après l'incubation de 30 minutes (de l'étape 2.2), ajouter 100 ul de cellules de McCoy préparés tube de mélange de transformation (volume total 200 ul) et incuber 20 minutes supplémentaires à 25 ° C. Ajouter 100 ul de ce mélange de cellules transformées à un seul puits d'une plaque à 6 puits avec du milieu de recouvrement et 2 ml de la croissance. Incuber à 37 ° C dans un incubateur à CO 2 pendant 2 jours.
- Jour 3. Lyse cellules McCoy infectées par le C. trachomatis en remplaçant moyenne avec 1 ml dH 2 O et le grattage des cellules avec une pipette de 1000 pi plié. Ajouter 1 ml de tampon 4SP et passer la suspension à travers une aiguille de 27,5 G ~ 5 fois pour la lyse cellulaire efficace et la libération de C. trachomatis.
- Transfer 2 ml de lysat cellulaire contenant C. trachomatis dans un flacon T-75 contenant une monocouche confluente de fraîchement plaqué McCcellules Oy; ajouter 8 ml de DMEM (sans FBS) et incuber pendant 2 heures à 25 ° C pour permettre C. trachomatis à adhérer aux cellules.
- Aspirer les cellules et ajouter milieu de croissance frais supplémenté avec 10 U / ml de pénicilline G et 1 ug / ml de cycloheximide. Incuber pendant 48 h ballon dans un incubateur à 37 ° C de CO 2.
- Jour 4. Vérifiez par microscopie optique que les cellules sont infectées et les inclusions contiennent Chlamydia aberrante. Identifier les inclusions que vacuoles lumineuses sur un microscope optique standard, et les organismes de Chlamydia aberrantes comme des objets en forme d'anneau dans inclusions qui sont supérieures à 2 pm de diamètre.
- Jour 5. Lyse culture en remplaçant moyenne avec 2 ml dH2Û et gratter les cellules en suspension. Ajouter 2 ml de tampon 4SP et passer la suspension à travers une aiguille de 27,5 G ~ 5 fois.
- Utiliser 2 ml de lysat cellulaire à infecter une monocouche fraîche de cellules de McCoy dans un seul puits dans une plaque à 6 puits. Incuber les cellules avec lysat pendant 2 heures à 25 ° C, aspirer et ajouter croissance fraismilieu contenant de la pénicilline G et cycloheximide.
- Incuber les cellules dans un incubateur à 37 ° C de CO 2 pendant 3-5 jours, en fonction de la santé générale des cellules.
- Répétez les étapes 2.9-2.10 une ou plusieurs fois, selon les besoins, les cultures des passages dans des puits frais dans une plaque à 6 puits jusqu'à ce que les inclusions d'apparence normale (dépourvus de corps aberrantes) ont vu le jour. A ce moment utiliser un microscope inversé à fluorescence pour vérifier que C. trachomatis exprimer mKate2 (rouge).
- Intensifier les cultures infectées pour la production des stocks de Chlamydia de titre élevé, par exemple en récoltant transformants Chlamydia à partir de cellules McCoy ou HeLa infectées cultivées en flacons T-150.
3. infection de cellules avec Chlamydia
- Plate cellules HeLa GFP-sur récipient de culture souhaitée, par exemple des plats de fond de verre ou des diapositives de la chambre pour l'imagerie haute résolution, ou des plaques à 24 puits pour la détermination IFU et le dépistage à puits multiples.
- Décongeler froTube zen contenant C. trachomatis, C. muridarum, ou C. pneumoniae sur de la glace et diluées dans du HBSS à la multiplicité désirée de l'infection (MOI), par exemple MOI = 1.
- Effectuer infections statiques ou assistée par centrifugation en fonction de la souche de Chlamydia particulier qui sera utilisé.
- Pour les infections à C. trachomatis LGV sérotype L2 ou C. muridarum, laver les cellules GFP-HeLa avec HBSS et incuber des bactéries dilué pendant 2 heures à 25 ° C. Aspirer et laver les cellules avec HBSS, et incuber les cellules dans un milieu de croissance de 37 ° C CO 2 incubateur.
- Pour les infections à C. trachomatis serotype D ou C. pneumoniae, laver les cellules GFP-HeLa avec HBSS et ajouter des bactéries aux cellules dilué. Placez plaque multi-puits ou un plat à fond de verre (fixé par un ruban dans un couvercle de plaque multi-puits) dans un support de plaque à puits multiples d'un rotor attachement à godet oscillant dans une centrifugeuse de paillasse.
- Centrifuger les cellules à 900 g à 25 ° C pendant 1 h. Retirer les contenants de la culture d'une centrifugeuse et placer dans un incubateur à 37 ° C CO 2 pendant 1 heure.
- Aspirer cellules dans une enceinte de sécurité biologique, laver les cellules deux fois avec HBSS, et ajouter du milieu de croissance frais. La place des cellules dans un C CO 2 incubateur à 37 °.
4. cellules vivantes Visualisation de Chlamydia Inclusions
- Retirer Chlamydia infectés cellules GFP-HeLa de CO 2 incubateur et remplacer moyenne avec RPMI sans rouge de phénol + 5% de FBS.
- Cellules de montage sur un microscope à fluorescence inversé (Nikon Eclipse Ti-E ou similaire) en utilisant un objectif 20X ou plus d'huile.
- En utilisant un logiciel d'imagerie (Volocity 6 ou similaire), se concentrer sur et identifier les cellules infectées par Chlamydia GFP-HeLa: cellules vertes contenant de grandes trous noirs (inclusions de Chlamydia).
- Marquer les endroits xyz de régions contenant des cellules infectées par Chlamydia d'intérêt en utilisant un logiciel d'imagerie (Volocity 6 ou similaire). Effectuez cette manuellement par «Ajout de points de la tandis que dans le mode d'affichage XY scène. De cette manière, coordonnées XYZ sont enregistrées pour chaque emplacement marqué.
- Dans la boîte de dialogue de configuration d'acquisition, configurer le logiciel pour acquérir verte (GFP, HeLa cytosol) et rouge (mKate2, C. trachomatis) chaînes, et à un taux de nouvelles images par canal toutes les 5 min.
- Acquérir la séquence d'images en utilisant l'acquisition protocole est entré ci-dessus en cliquant sur le "Capture / Enregistrement" bouton.
5. La quantification des paramètres de croissance d'inclusion dans les cellules vivantes
- À certains moments souhaités post-infection (par ex., 24, 48 HPI) éliminer les cellules infectées par Chlamydia GFP-HeLa de l'incubateur et monter sur un microscope à fluorescence inversé. Note: Un objectif 20X ou 40X air avec une haute NA est le mieux adapté pour les plaques à 24 puits, et un objectif de l'huile 40X est recommandé pour les diapositives de la chambre. Cultiver les cellules de chaque substrat pour cet âneAy.
- Focus sur plan médian de cellules, où les inclusions sont à leur diamètre maximum et obtenir des bords nets.
- Acquérir les images pour les nombreux domaines dans chaque puits (au moins 10 par puits); puits représentent généralement les répliques ou les variables expérimentales.
- Énumérer le nombre d'inclusions manuellement, par l'oeil (les inclusions sont compartiments noirs dans les cellules HeLa-GFP) ou utiliser des algorithmes de logiciels d'imagerie pour identifier automatiquement et compter inclusions.
- Trouver cellules GFP-HeLa par l'intensité de fluorescence («Trouvez les objets de la commande) et d'ajuster l'intensité de seuil de fluorescence en fonction des intensités relatives des cellules.
- Filtrer les objets sélectionnés à l'aide des lignes directrices de la taille de garder ceux-là seulement supérieure à 5 pm 2. Ceci est «population 1 '.
- Appliquer "remplir les trous dans les objets de la commande à l'aide de« population 1 'comme entrée. Cette étape génère «population 2 '.
- «Population 1 'Soustraire de' population 2 'pour donner positivement marqué inclusions de Chlamydia, désignés comme «population 3'.
- Appliquer un filtre de taille pour 'population 3' ('Filtrez population' commande), par exemple des objets de maintien supérieure à 25 um 2 pour les inclusions dans les cellules infectées pendant 24 heures ou plus. Pour des temps de début de l'infection, comme avant 18 heures, réglez filtre de taille pour garder les objets de plus de 4 pm 2, que ces inclusions sont beaucoup plus petits. Les résultats de filtrage de taille dans une population d'objets désignés comme des «inclusions».
- Calculer des données à partir d'images quantitative, par exemple, le numéro de l'inclusion, la taille de l'inclusion, et l'inclusion circonférence, en utilisant un logiciel d'imagerie.
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Representative Results
Les cellules de mammifères exprimant des protéines cytosoliques fluorescents (par exemple, GFP) peuvent être conçus pour permettre un éclairage d'inclusions à Chlamydia, dans des cultures de cellules infectées vivantes. Lors de l'infection à Chlamydia, les inclusions sont facilement visibles sous forme de taches noires dans les cellules hôtes (figure 1). La clarté des inclusions de fluorescence manque peut être exploitée pour l'identification automatique des inclusions dans de nombreux champs de vision et / ou des traitements (Figure 1). Une fois les cellules hôtes fluorescents ont été générés, un nouveau puissant workflow est activé pour l'analyse rapide, quantitative des niveaux d'infection à Chlamydia chez les échantillons expérimentaux. Une application importante est la détermination de Chlamydia inclusion unités formant (IFU) dans des cellules vivantes, infectés (figure 2). Cette stratégie expérimentale évite la nécessité de procédures d'immunofluorescence qui sont couramment utilisés dans le domaine, qui sont à la fois beaucoup de temps etcoûteux.
Un autre élément clé de l'approche d'imagerie décrit est qu'il peut être facilement appliquée à toutes les espèces de la chlamydia ou la souche, et, en outre, peut être exploitée pour la dérivation des caractéristiques biologiques importantes inclusions de Chlamydia. A titre d'exemple, une analyse en fonction du temps des cellules HeLa GFP-infectés par C. trachomatis LGV sérotype L2, C. trachomatis serotype D, C. muridarum, et C. pneumoniae a été réalisée à 16, 24, et 48 HPI (Figure 3). Pour chacune de ces espèces et les souches de Chlamydia, inclusions ont été marqués et analysées afin de calculer leur superficie moyenne, le périmètre de longueur, et le nombre par cellule au temps indiqués (Figure 4). Ces attributs fournissent des informations importantes sur la biologie des inclusions à Chlamydia et informent comment ils interagissent avec la cellule hôte. La méthode décrite offre une approche facile pour accéder à cette information d'une manière qui su rpasses ce qui peut être accompli par d'autres techniques expérimentales. Une utilité finale de la stratégie de l'étiquetage est inverse pour l'imagerie en temps réel des inclusions de Chlamydia dans les cellules vivantes. Un exemple de ceci est montré dans Film 1.
Figure 1. automatisé de détection de C. inclusions trachomatis. cellules (A) GFP-HeLa ont été infectées avec (B) mKate2 exprimant C. trachomatis L2 et copié en direct à 24 HPI. Un algorithme basé sur un logiciel de formation d'image a été utilisée pour identifier automatiquement les inclusions à Chlamydia par (C) la sélection des trous noirs dans les cellules HeLa-GFP, marquées en orange. (D) une image composite à partir de cellules infectées panneaux A et B est également indiquée. La barre d'échelle = 20 um. .jove.com / files / ftp_upload / 51131 / 51131fig1large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Quantification de Chlamydia inclusion unités formant (IFU) en GFP-cellules HeLa. Cellules GFP-HeLa ont été infectées avec C. trachomatis L2 à deux multiplicités différentes d'infection et imagé à 24 HPI. Inclusions pour 10 champs par l'infection ont été détectés et dénombrés à l'aide un logiciel automatisé et les résultats sont donnés (n = 3). Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 3. Temps cours de C. trachomatis serotype L2, C. trachomatis serotype D, C. muridarum, et C. pneumoniae infection dans les cellules HeLa-GFP. cellules GFP-HeLa ont été infectées avec C. trachomatis LGV sérotype L2 et imagée par microscopie de fluorescence en direct à (A) 16 HPI, (B) 24 HPI, et (C) de 48 HPI. Cellules HeLa GFP-infectés par C. trachomatis serotype D ont été imagée à (D) 16 HPI, (E) 24 HPI, et (F) 48 HPI. Cellules HeLa GFP-infectés par C. muridarum ont été imagées à (G) 16 HPI, (H) 24 HPI, et (I) 48 HPI. Cellules HeLa GFP-infectés par C. pneumoniaeont été imagées à (J) 16 HPI, (K) 24 HPI, et (L) 48 HPI. Images représentatifs sont présentés pour toutes les infections et les temps. Les barres d'échelle = 20 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. données quantitatives représentatifs tirés d'expériences cours du temps. Inclusions de cellules GFP-HeLa infectées avec (A) C. trachomatis LGV sérotype L2, (B) C. trachomatis serotype D, (C) C muridarum, et (D) C. pneumoniae ont été détectés et énuméré à 16, 24, et 48 HPI (5 champs par intervalle de temps, n = 3). Les caractéristiques physiques de Chlaminclusions ydial ont été quantifiés pour l'inclusion surface, l'inclusion périmètre longueur, et nombre d'inclusions par cellule. Les barres d'erreur représentent la SEM. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
S'il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo. Film 1. Time lapse vidéo de cellules mCherry-HeLa infectées avec la GFP C. trachomatis L2, prise à 48 HPI. Vidéo a été compilé à partir d'une série d'images de time-lapse prises à intervalles de 5 minutes pour 125 min. Alterne vidéo en boucle à travers les cellules HeLa-mCherry (rouge), C. trachomatis L2 (vert) et une fusion des deux champs.
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Discussion
Nous décrivons ici la stratégie expérimentale pour générer des cellules hôtes fluorescents pour de vrai visualisation et l'analyse des inclusions de Chlamydia temps. Cette approche vacuole de visualisation confère la capacité puissante pour éclairer, de suivre et de mesurer quantitativement les propriétés dynamiques des inclusions à Chlamydia dans les populations de cellules ou dans des cellules individuelles au fil du temps. Inclusions de Chlamydia dans les cellules de protéine marquée fluorescentes sont remarquablement bien définis, tels qu'ils sont facilement identifiables sans la nécessité d'un traitement supplémentaire par immunofluorescence. En outre, cette approche est suffisamment sensible pour résoudre signature morphologique différences que les différentes espèces et les souches de Chlamydia possèdent, comme les numéros de vacuoles par cellule et l'inclusion courbure. En outre, nous montrons comment un logiciel d'imagerie peut être adapté pour identifier automatiquement les inclusions dans les cellules hôtes exprimant la GFP. Le obviation de mesures d'étiquetage immunofluorescence pour ilassombrissement des inclusions à Chlamydia résultats en temps et de coûts importantes économies à l'utilisateur pour les essais finaux tels que la détermination de l'inclusion d'unités formant (IFU). En outre, la capacité d'inclusions d'image dans des cellules vivantes permet pour la même population de cellules infectées à analyser à des moments précis dans le cycle de développement de Chlamydia, réduisant ainsi le nombre de puits ou des plaques nécessaires pour des études de décours temporel. Cytosolique GFP, mCherry, etc., donné, un signal lumineux stable qui ne souffre pas de photoblanchiment; cette fonctionnalité est essentielle pour de longues expériences d'imagerie time-lapse. Enfin, parce que la technique est indépendante de Chlamydia expression des gènes du développement, il est tout aussi efficace à tous les stades de l'infection cellulaire par la chlamydia.
Comparativement aux stratégies existantes en matière d'étiquetage et les membranes intracellulaires Chlamydia 7,8, cette technique offre la simplicité et la flexibilité pour une expérimentalepplications. Cellules hôtes infectées par Chlamydia fluorescentes peuvent être visualisés immédiatement, sans avoir besoin de charge de colorant, d'étiquetage ou d'autres manipulations cellulaires. Cette approche éclaire et définit clairement les bords de la prise en compte tout en gardant l'espace luminal de la prise en compte (et les bactéries) non marqué. Aux fins d'éclairer et dénombrer les cellules infectées par la chlamydia, l'avantage de cette approche réside principalement dans sa compatibilité avec les cultures vivantes, et donc les gains de temps significatifs qu'il fournit. Cependant, pour le marquage et la dérivation de paramètres quantitatifs de la Chlamydia vacuole contenant lui-même, des anticorps commerciaux pour ce compartiment ne sont pas largement disponibles. Par conséquent, l'approche de la GFP inversé reste le moyen le plus faciles et directes en vue de délimiter la membrane de ce compartiment de l'agent pathogène.
Il ya des considérations clés pour l'application de cette méthode d'imagerie à un visualizat Chlamydiaflux ionique. Il est important que les lignées cellulaires de l'hôte avec une expression stable de la GFP, mCherry, etc, sont générés à l'avance. Bien que les inclusions à Chlamydia sont facilement détectés dans les cellules hôtes qui sont transfectées transitoirement avec des protéines fluorescentes, des cellules préparées de cette manière incomplète souffrent de transfection dans la population, ainsi que les niveaux d'expression variables. En outre, ajoute-t-transfection étapes inutiles à la procédure globale. Une autre limitation du procédé décrit est que les inclusions provenant de différentes Chlamydia spp. peut être remarquablement différentes dans leur aspect morphologique et la manière dont ils interagissent avec la cellule hôte. Cette approche d'imagerie est assez robuste pour la détection et inclusions d'imagerie contenant C. trachomatis, C. muridarum ou C. pneumoniae; Cependant, pour quelques espèces de Chlamydia (notamment C. psittaci et C. caviae) inclusions sont moins capables d'exclure GFP de leur espace luminal. Inclusions contenant C. psittaci ou C. caviae sont facilement accessibles dans les cellules HeLa-GFP, mais l'intrusion de certains GFP dans ces inclusions augmente le taux de détection de logiciel basé sur des inclusions d'erreur.
Une fois la stratégie globale expérimentale a été correctement mis en œuvre, de nouvelles opportunités sont créées pour l'analyse quantitative des inclusions de Chlamydia dans les cellules vivantes. Nous montrons comment cette technique permet un flux de travail optimisé pour inclusion énumération - soit de manière automatisée en utilisant un logiciel d'imagerie, ou par le ballon d'emploi. Une nouvelle application de cette approche est pour la dérivation des données quantitatives significatives quant à l'inclusion, par exemple la zone de l'inclusion, le volume et la forme. Enfin, ce procédé de visualisation est hautement adaptable et peut être utilisé en combinaison avec d'autres marqueurs fluorescents pour révéler des informations supplémentaires sur la biologie de Chlamydia cellules hôtes infectées, par exempleGFP ou mKate2 exprimant Chlamydia 6,11, actine fluorescente GFP 12 ou étiquetés Inc protéines 13.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrentes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 | |
| Opti-Mem | Invitrogen | 31985 | |
| Polybrene | Sigma | H9268 | |
| 0.45 µm filters | Fisher | 09-719D | |
| G418 | Invitrogen | 10131 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025 | |
| DMEM | Invitrogen | 11995 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | |
| RPMI 1640 w/o phenol red | Cellgro | 17-105-CV | |
| Penicillin G | Sigma | 13752 | |
| Cycloheximide | Sigma | C7698 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Chamber slides, Lab-Tek II | Nunc | 154526, 154534 |
References
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