Abstract
付臭剤の分子は、正確かつ協調的にそれらの標的受容体に結合する。各受容体は、特定の信号を認識し、脳にその情報を中継します。このように、嗅覚情報が知覚や行動、メリットの調査の両方を修正すること、脳へ転送する方法を決定する。興味深いことに、細胞のシグナル伝達および転写因子が嗅覚受容ニューロンの多様化に関与しているという新たな証拠がある。ここでは、in vivoでの嗅覚受容ニューロン組織をアッセイする免疫学的標識法をマウント堅牢全体を提供する。この方法を用いて、抗ELAV抗体、既知の汎神経マーカー及びOr49a-mCD8 :: GFP、特に抗GFP抗体を用いたNBAのニューロンに発現し嗅覚受容ニューロンを持つすべての嗅覚受容ニューロンを同定した。
Introduction
嗅覚系は臭気分子の巨大な様々な区別するために、その後、高次脳センターに得られた情報を送信するために使用される。この入力は、正確にそのような摂食及び相手1-6のような基本的な動物の行動を制御するために使用される。各嗅覚ニューロンタイプが臭いの特定のセットに関連付けられているように、嗅覚受容ニューロン（ORN）Sの多様化は、適切な嗅覚システム機能7に不可欠である。
ショウジョウバエの遺伝学はORNの開発と生理機能8月16日に関連する分子機構が関与する単一細胞レベルの調査を行うために私達を可能にします。 ショウジョウバエの触角の全マウント免疫染色は、より詳細に嗅覚受容ニューロンの多様化に関わる分子機構（ORN）S 7を理解することができました。ここに我々はACに簡単な方法の包括的な説明を提供これをhieve。
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Protocol
1。アップルのプレートを準備します
- 12.5グラム寒天を混ぜ、125ミリリットル100パーセント市販のリンゴジュース、12.5グラムのグルコース、および375ミリリットルのH 2 O 1〜2分間マイクロ波混合物を3センチ細胞培養皿に注ぐ。 4℃で保存する
2。遺伝的交雑
- 以下の代表的な遺伝的交雑を使用します。
Or49a-mCD8 :: GFP / CYO X 1118ワット
3。切開および染色プロトコール
- ハエを麻酔した後、ピンセットを用いて保持することにより、垂直フライ頭を切った。
- 慎重にリンゴの板の上にアンテナ収納部を配置。
- 細かい解剖ハサミを使用して、アンテナの3番目のセグメントをカットします。
- ガラス底培養皿の中央に固定溶液（0.1％PBST（0.1％トリトンX-100を有するPBS）中4％パラホルムアルデヒド）の90μLを置く。
- やさしく解剖しantennを転送定着液に直接鋭い針でAE。必要に応じて、物理的に針を用いて溶液中にアンテナを沈める。
- 室温（RT）で40分間インキュベートする。同じ料理でそれらを保ち、0.4％PBST（0.4％トリトンX-100を含むPBS）で各3回10分でアンテナを洗う。 PBST溶液を除去し、追加するために、黄色のヒントを参考にしてください。たびに洗浄溶液の90μlを使用する。
注：免疫組織化学の間にシェーカーに料理を置かないでください。皿に液を除去または追加する前に、針を用いて皿の中央にすべてのアンテナを持って、慎重に皿の端からソリューションを追加または削除します。 - 室温で20分間、0.1％PBST中5％正常ウマ血清を90μlのアンテナを遮断する。
- ブロッキング溶液を除去した後、前述のように加湿容器中で4℃で48時間、5％ウマ血清を含有する0.1％PBST中の90μlの一次抗体とインキュベートアンテナ
- 0.4％PBST中10分6Xアンテナを洗う。
- 4℃で48時間、5％ウマ血清を含む0.1％のPBST中の二次抗体を90μlのアンテナをインキュベート0.4％PBSTを使用して洗浄6X 10分。
- アンテナをマウントするには、培養皿から可能な限りPBSTを削除し、徐々にアンテナにグリセロールの2種の異なる濃度をご紹介します。最初の1〜2分間皿に40％グリセロールを加える;その後、これを削除し、80％グリセロールを追加します。
- 慎重に黄色のチップを用いて培養皿から（80％グリセロールを含む）のアンテナを抽出し、スライド上に配置します。そっと上にカバースリップを置き、マニキュアでカバーガラスの端をシールします。アンテナは現在、蛍光顕微鏡で画像化される準備ができている。
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Representative Results
解剖と固定の両方を迅速に行われることを確保することは、このプロトコルで成功を達成する上で重要な要素です。細かいハサミや鉗子を使用しても、非常に重要です。免疫染色後、蛍光ラベルされたアンテナは、共焦点顕微鏡下で調べた。私たちは通常、20倍レンズを使用して1μm以下のセクションを取る。我々はNBAのをOr49a-mCD8 :: GFPを使用して7 ORN類を標識して、野生型のアンテナではNBAのORN類の数を数えた。 mCD8-GFPレポーターは、細胞膜に局在しているので、式は、図GFPを発現OR49a ORN類の2呈する細胞膜に見られる。図2に抗GFP抗体と抗ELAVを使用してNBAのORN類式は汎神経マーカーとして使用されたを示しています。アンテナ毎のNBAのORN類の平均数は、20（n = 8）になる。
図1：dissectioの一般的な概要N手続き。
図2：正常解剖し、アンテナの共焦点Zシリーズの投影 。ニューロンを検出するための抗ELAV抗体（C）に示すように、特定の臭気物質受容体の発現（B）とマージされた画像を検出するための汎神経マーカー（A）および抗-GFP抗体として使用した。
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Discussion
我々は説明しショウジョウバエのアンテナの解剖は、簡単で実験室環境で実行するのは簡単です。成功した切開を確保するためには、微細なエッジのはさみを利用することが不可欠である。解剖アンテナ免疫染色が、抗体溶液の蒸発を回避するために、水分で満たされた容器でそれらをインキュベートすることが重要である。解剖アンテナは、溶液中に浮遊する傾向がある。定着時にPBS中の0.1％トリトンを使用してステップを遮断することは、溶液中、アンテナの水没を促進し、より良い染色を確実にするために。 「ガラス底培養皿」を使用した免疫染色時のアンテナの損失を低減し、各実験に用いた抗体溶液の少量（90μl）を確保することができる。
神経細胞のクラスの多様化は、神経新生の中心的な機能です。この生理学的なプロセスは、嗅覚受容ニューロンの大規模な配列を利用して嗅覚系、（ORN）に例示されているクラス。嗅覚受容体の発現と軸索を標的とORN類の多種多様な世代が高次脳機能センターに匂い分子からの情報を伝送するために必要な神経細胞の多様性を生成することが重要です。私たちの全体のアンテナはORNの多様化の基礎となる分子メカニズムの理解を促進におけるプロトコルエイズ免疫染色マウント。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、私立大学の戦略研究財団と私たちは、ビデオクリップを編集する大竹徳仁に感謝したいと思い、HT用の日本学術振興会若手Bの許諾のための文部科学省支援プログラムによってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stemi DV4 dissection microscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Glass bottom culture dishes | MatTek corporation | P35G-0-10-C | |
| Dissection scissor | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Rat anti-ELAV | Developmental Studies Hybridoma Bank | 7E8A10 | Dilution 1:200 |
| Mouse anti-GFP | Invitrogen | A11122 | Dilution 1:400 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-225-152 | Dilution 1:200 |
| Donkey Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 712-165-150 | Dilution 1:200 |
References
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