Introduction
リグニン、セルロース、ヘミセルロース（キシラン、グルクロノキシラン、キシログルカン、アラビノキシラン、混合連鎖グルカン、またはグルコマンナン）、およびペクチン：植物細胞壁は、その様々な構成要素内の情報の過多を保持している。組織学的技術は、組織および細胞レベルでの二次細胞壁の中の違いを研究する上で重要な視覚的な手がかりを提供する。様々な組織学的技術が開発されており、文献に記載されていますが、これまでに利用可能な場合、単純な視覚的な指示に非常に詳細なプロトコルはめったにないため、これらの技術は、初心者のために挑戦し、時間がかかる場合があります。本研究の目的は、高品質の画像を得るために組織学的染色技術のための簡単なガイドラインを提供することである。
茎組織を区画すると、細胞壁と細胞形状の可視化の最初のステップです。ハンドカットのセクションでは、安価であり、準備する時間がかからないが、ビブラトームを使用すると、一貫性を提供し、高品質の画像が得られる。ビブラトームを使用すると、シャープな画像を生成するのに役立ち、著しく単純悪い試料調製に起因するサンプル間の不正確な差を生成するリスクを低減し、同じ厚さであってもセクションを生成することにより、より良好なデータ品質を製造することができる。新鮮な標本を修正するために樹脂を使用すると、初心者のための挑戦することができますし、分析を迅速に行う必要があるときもまだ専門家のために、時間がかかる場合があります。また、それは、樹脂中に埋め込まれたときに試料に任意の生物学的活性を測定することができなくなる。アガロース及び自家製の金型を用いたOne簡単な手法は、幹組織を包埋するのに役立ち、それはまた、軟組織の切開を必要とする他の用途に利用することができる。樹脂中に包埋標本を比較すると、この方法は、生きている組織を維持し、サンプル操作を低減するという利点を有する。ビブラトームを経由して組織を切片化することは、非常に正確であるとhomogenを生成研究の目的に応じて、組織単位（OU）のセクションでは、次に、いくつかの異なる染色技術と共に使用することができる。
リグニンおよび他の芳香族化合物を可視化するための最も簡単な方法は、紫外線（UV）光を使用する。 UV光による芳香族系分子の励起は古い技術であるが、それはまだリグニンの可視化のための最速の方法の一つです。 UV光は、他の芳香族化合物を励起するので、UV可視化は、実際にはリグニンを検出するための理想的ではない。 1-3：リグニンは、主に以下の3つのビルディングブロック、モノリグノール（コニフェリルアルコール、シナピルアルコール、およびp-クマリルアルコールhydroxycinnamylアルコール）で構成されている。フロログルシノール染色は木部に存在シンナムアルデヒド、繊維、および気管組織4の範囲で手がかりを提供することができます。フロログルシノールは、一般的なシンナムアルデヒドの良好な指標であり、シンナムアルデヒド、その他の芳香族化合物を区別することができます。シナピルアルコールモノマーは検出することができるとマウレ染色を使用して分化した。トルイジンブルーO多色性染料であり、したがって異なる色5,6における細胞壁の異なる要素を染色する能力を有する。トルイジンブルーOの主な用途は、ペクチンとリグニン5,6を検出することである。トルイジンブルーOを使用する利点は、細胞壁の多くの要素は、単一のステップで可視化することができることである。カルコフロールホワイトおよびコンゴーレッドの両方を作成すると処理が容易であり、セルロースを可視化するために使用することができる。 ·ホワイト汚れセルロース、カロース、および他の非置換または弱置換されたβ-グルカン6-9、コンゴレッド汚れが直接、特に10,11-β（1→4） -グルカンとセルロースにするのに対し。この研究の目的は、A.より高品質の画像を得るために、前述の染色技術を使用するための簡単なガイドラインを提供することであるシロイヌナズナの茎 。
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Protocol
1。埋め込みステム
- 水中の0.7％アガロース溶液（蒸留水100ml中の電気泳動グレードアガロース7 g）を作る。 20分間、または最低強度（ 例えば 、1250ワットのマイクロ波を10％の強度）で20分間マイクロ波処理することによりオートクレーブでアガロースを溶解する。
- プラスチックバイアルを使用した茎埋め込むための手作りの金型を準備します。
- カミソリの刃を使用して、2ミリリットルスクリューキャップマイクロチューブ（A部）の円錐底を切り落とした。注射針と、埋め込むべき幹の直径よりも僅かに大きいチューブキャップに穴を穿刺する。次に、0.6ミリリットルのマイクロ遠心チューブ（パートB）の下部から0.5cmにカット。
- プレカット2ミリリットルの微量遠心チューブに0.6ミリリットルマイクロチューブのカットオフ0.5センチメートル部分を追加します。パラフィルム（ 図1）を使用して、二つの部分を密封する。注意：チューブの底部は、アガロースが固化した後に埋め込まれたサンプルの除去を容易にするために切断される。 T彼は、キャップの穴は茎をアガロースに埋め込まれている場合、安定ステムを保持するのに役立ちます。金型は、アガロースを保持し、埋め込む際に、ステムストレートを保持するのに役立つでしょう。アガロースが設定され、ステムが埋め込まれるまで、パラフィルムは、二つの部分A及びBを保持する。
- カミソリの刃を使用して、関心領域（第1の幹節間の例えば中央）からステム部をカット。注：理想的には、茎はちょうど脱水による破壊を避けるために埋め込む前に切断する必要があります。あるいは、ステムは、一時的に水で湿らせた濾紙を含むプレートに格納することができる。このプレートは、組織の脱水や変形を防止するために埋め込まれる準備ができるまで氷上に配置することができる。高水分のない30分よりも長い期間、ステムを格納すると、茎が乾燥させます。
- 低強度で電子レンジでアガロースを溶かす。注意：アガロースを含むボトルが高温になる場合があります。ボトルを拾うためにミットを使用しています。溶けたアガロースSをしましょう（20°Cと25°Cの間）室温でTANDは、約50℃に冷えるまで
- ゆっくりバイアルを充填する既成のプラスチック金型にアガロースを5mlピペット。注：確かに、金型内に気泡がないことを確認します。気泡がアガロース金型内でのギャップの原因となりますし、完全に、最終的には、サンプルのセクションの不均一な切断につながる幹のサンプルを、カバーしていません。
- アガロースは半固体になるための30から60秒間クールダウンしましょう。それが浸透し、アガロース中で、浮い立ち上がるが、できないことを確認しながら、小さな爪楊枝でテストします。注：ステムが配置されている場合は、アガロースがまだ熱いときには、細胞形態を破壊し、ステムをshrivelingすることにより、試料を損傷します。
- このアガロースに満ちたバイアル中で茎を配置します。茎がまっすぐに留まることを確認してください。茎の先端がキャップによって保持されるように穴のあいたキャップを置きます。ねじ式キャップを回転させないでください。いつか（一種類の）複数の幹がembeすることができます単一バイアルにdded;が、その特定のケースでは、キャップを使用しないでください。注：ねじ式キャップがオンになっている場合、幹がねじれてしまいます。
- それが凝固するまで、10から30分間、室温または4℃でバイアルのままにしておきます。
- 優しくチューブの外にスライドさせて、金型を削除します。パラフィルムを開きます。ガラス顕微鏡スライド上にパートAから固化したアガロースを解放するために親指で軽く金型のパートBの下を押してください。
- 長さ1.2センチ3ほぼ等しいピースにアガロース埋め込ま茎を切った。アガロースではなかった茎の部分を切り取って、それを捨てる。
- 埋め込まれたアガロース、これらの情報を格納するセクションへの準備が整うまで4℃での暗箱に気密2ミリリットルの微量遠心チューブに由来する。代わりに、1週間に最大4℃でチューブを保管してください。注：ストレージは可能ですが、実験者は、組み込み茎がまだ生きていると、実験に依存ことに注意する必要があります、成果物は潜在的に導入することができる。
2。セクステム
- 注意：慎重にビブラトームマニュアルを読み、すべての安全手順に従ってください。
- 試料ディスクを（任意の固体または液体の自由）清潔で完全に乾燥していることを確認します。実験前から残留接着剤を除去し、水で洗浄するかみそりの刃で試料ディスクをクリーニングします。その後、紙タオルで乾燥させます。注：これは、接着剤がうまく機能し、アガロース片に結合することが保証されます。この工程が適切に行われない場合には、試料は、ディスクに付着しない可能性があり、保存試料を切片中にディスクから落下させることが可能である。
- 柔らかい紙は検体を含むアガロースブロックから任意の水分を除去するワイプを使用します。
- 試料ディスク上の組織接着剤の小滴を配置します。ストリーク接着剤ボトルの先端を用いてプレートの中央にある領域をカバーするための接着剤が不足しています。迅速場所アガロースブロック試験片は、それぞれに対して垂直または横方向または縦方向の断面用プレートと平行になるようにのいずれかである。接着剤は10から30分間、室温または4℃での試料ディスクにサンプルを固定することができます。注：これは時間に敏感なステップである。
- バッファトレイまたはトラフ上の所定の位置に試料ディスクを固定します。セクションを持つアガロースブロック/ Sは、かみそりの刃と平行になる必要があります。サンプルが完全に水没するまで室温で蒸留水を用いてバッファトレイを埋める。
- 半分にカミソリの刃を切断し、ブレードが完全に平らに留まるように頑丈なハサミで端をトリミングします。ナイフホルダーにプレカットカミソリの刃の2分の1を取り付けます。
- 50ヘルツ（ビブラトーム上の位置5）に0.90ミリメートル/秒（ビブラトーム上の位置8）と周波数を、84℃にナイフホルダーの速度を角度を設定。 100ミクロンの厚さの部分をカット。連続モードを使用してください。 NOTE：この厚さは組織染色プロトコルのいくつかで使用される様々な酸および塩基の治療に耐えることができることを確実にするために選択した。切片化のためのウィンドウを設定し、セクションにビブラトーム約1.2センチアガロースブロックのための連続モードで15〜20分を許可する。
- バッファトレイに切片中に使い捨てのプラスチックピペットを用いてのセクションを収集します。代替的に、切片をガラスビーカーにバッファトレイから転送され、透明なペトリ皿にすることができる。 2.0ミリリットルのマイクロ遠心管にいくつかのセクションを転送します。注：それは、透明な背景のセクションを見ることが容易であるため、バッファトレイは次の検体のために準備することができるので、試験片をペトリ皿から収集されます。
- 切片は、30〜60分間、4℃で50mlチューブに格納したり、回収し、1.5〜2ミリリットルの微量遠心管に記憶することができる。注：長期間のセクションを格納すると、低画質になります。
イメージングのための設定3。顕微鏡とカメラ
- 顕微鏡でのケーラー照明を調整します。目的を選択してください。最初の試料に焦点を当てています。半分以下に光強度をもたらす。視野絞り（FD）と絞り（AP）を閉じるか、その特定の目的に可能な限り低い設定にそれを持って来る。
- 倍率が高いほど、より大きなリングになります。として急速に可能な限りフィールドアイリスを集中するコンデンサー焦点ノブを使用しています。
- ゆっくりとコンデンサーセンタリングノブ（コンデンサーを取り巻くピン形状のネジ）を使用して、中央にフィールドアイリス（六角形の小さなリング）のイメージを持って来る。ゆっくりとフィールドアイリスがエッジに到達したことを、振動板（FD）は、このような増加。フィールドアイリスがエッジを通過した直後のFDを増やす停止します。
- ゆっくりとコントラストを調整し、開口（AP）を増やします。必要に応じて光の強度を調整します。 NOTE：ケーラー照明は、すべてのoには調整される必要があるbjective、すべての実験日。その日のために調整した後に得られる数値に注意してください。これらの数字は、目的は、その特定の日の前後に切り替えられるたびに再利用されます。
- アパーチャ、強度、露光時間、ゲイン、 表1に記載したようにフィルタを調整し、この情報は、あくまでも目安として使用されるべきである。
- 蛍光画像をキャプチャするために機械的なシャッターを大判インターラインCCDチップで高解像度のデジタルカメラを使用してください。明視野画像の高解像度、高速カメラ。
- 標準的なソフトウェアを使用してスライドを処理します。ソフトウェアをロードします。 「取得」をクリックして "設定したカメラ/ボード」をして、使用するカメラを選択します。 「OK」をクリックし、続いて「取得」をクリックして "[色]タブ。」の「[色]タブ、"選択 "バイエル法」に続いて「平均4。」を示唆ゲイン（赤、緑、青）のあちこちに追加M 表1。「セーブ·セット」タブを選択し、画像を格納するディレクトリをクリックしてください。 表1の候補から「露出時間」を設定します。 "1"で「ビニング」を設定し、「ライブビニング"関心領域の「1。」焦点にし、をクリックして「ライブ保存します。"
- カメラのソフトウェア上の出力画像は、「TIF」形式になっています。細胞型の組織化学のために画像を分析。プレゼンテーションと出版物の下流で使用する場合は、標準的なコンピュータ·ソフトウェアを使用してください。
4。紫外線明視野イメージング
- のセクションでは、簡単にピペットでできるように、ピペットチップカットで1ミリリットルピペットを使用してください。そっとピペットのセクションチップ内に、顕微鏡のスライドに上。カバーガラスでのセクションをカバーしています。紫外光または明視野照明下のセクションを観察します。
5。フロログルシノール -塩酸（ウィーズナー）染色12
- 3％のフロログルシノールの溶液を調製し10ミリリットルの無水エタノール中のフロログルシノールを0.3g溶解する。エタノール3％フロログルシノールの2ボリュームに濃HCl（37 N）の1量を混ぜる。このソリューションは、フロログルシノール、塩酸（pH塩酸）またはウィーズナー染色である。注：このソリューションは、染色の日に新しく作らなければ、溶液が時間の経過とともに低下しますので、保存することができず、染色は無効となりますです。注意：HClを腐食性が高いので、Phは塩酸染色の処理中に細心の注意を払ってください。
- 2.0ミリリットルマイクロ遠心チューブにステム部分を転送します。セクションを含むチューブにPhは塩酸溶液1mlを加え、Phは塩酸染色中のHClは腐食性が高いので、すぐにキャップ。静かにすべてのセクションが染色されることを保証するためにチューブを移動します。このステップの代わりには、pH-HCl溶液を上下にピペッティングすることができるように、好ましくは、秒を乱すことなく、オープンチューブキャップを維持することですtions。注：これは、それらのセクションを傷める可能性がありますので、ピペットチップにセクションをピペットないように注意してください。
- のセクションでは、損傷を与えることなく、容易にピペットで可能なようにピペットチップカットで1ミリリットルピペットを使用してください。そっと先端に、顕微鏡スライド上のセクションをピペット。カバーガラスでのセクションをカバーしています。明視野照明下のセクションを観察します。 NOTE：Ph-でHCl溶液を試験片の劣化を引き起こす、5〜10分で乾く。そのため、撮像はその期間内に完了しなければならない。
6。マウレ染色13,14
- 0.5％過マンガン酸カリウム溶液を調製し、40 mlの蒸留水に過マンガン酸カリウム0.2gを溶解する。 7日間の最大室温で暗瓶の中に保管してください。
- 9ミリリットルの蒸留水（1:10）に1ミリリットル濃HCl（37 N）を追加することにより、3.7％塩酸溶液を調製する。新鮮な3.7％塩酸溶液を調製実験の日。使用されている37規定塩酸原液が古すぎるではないことを確認してください。濃縮水酸化アンモニウム溶液（14.8 M）が減少するから、飽和溶液のモル濃度を防ぐために4℃で保存すべきである。
- 2.0ミリリットルマイクロ遠心チューブにステム部分を転送します。セクションを含むチューブに0.5％過マンガン酸カリウム溶液1mlを加える。
- 好ましいのセクションを乱すことなく、静かに上下に0.5％の過マンガン酸カリウム溶液をピペット。 2分間インキュベートし、ピペッティングを繰り返します。すべてのセクションが落ち着くまで、マイクロチューブが放置。注：セクションでは、破損する可能性があるピペットチップにセクションをピペットないように注意してください。それは解決策が暗いように茎の節を参照して、その試験管立てのセクションでチューブを保持し、それらを2分のために解決することを可能にするのは難しいかもしれません。
- の1mlピペットを使用して、0.5％過マンガン酸カリウム溶液の700μLを引き出す。過マンガン酸カリウム溶液をすすぐために蒸留水700μLを加える。水溶液が透明のままになるまで3〜4倍を繰り返すか。
- 水を捨てます。深い茶色の色が部分から排出されるまで急速に3％塩酸1ミリリットルを加える。これは3〜5分以内に発生する可能性があり、または5分間ずつの2回の洗浄が必要な場合があります。すべての3％HCl溶液をピペットで、すぐに次のステップに進みます。
- 濃水酸化アンモニウム溶液1mlを加える。のセクションでは、損傷を与えることなく、容易にピペットで可能なように先端カットで1ミリリットルピペットを使用してください。そっと先端に、顕微鏡スライド上のセクションをピペット。カバーガラスでのセクションをカバーしています。明視野照明下のセクションを観察します。注意：水酸化アンモニウムは非常に腐食性があるので、それは顕微鏡やレンズのステージに腐食を起こす原因にもなりますので、余分なケアと注意が必要です。 NOTE：水酸化アンモニウムフュームが困難試料を観察すること、カバースリップを曇ることができ。そのため、カバースリップを追加する前に余分な注意が必要です。ソリューションは、5〜10分で乾くので、撮影がその期間内に完了する必要があります。
7。コンゴレッド染色11,15
- 0.5％コンゴー赤色溶液を調製し、蒸留水100mlにコンゴーレッドを0.5g溶解する。
- 2.0ミリリットルマイクロ遠心チューブにステム部分を転送します。チューブに0.5％コンゴーレッド溶液1mlを加える。そっと0.5％コンゴレッドソリューションをピペット上下のセクションを乱すことなく。注：これはセクションを損傷する可能性があるピペットチップにセクションをピペットないように注意してください。
- 10分間室温でインキュベートし、ピペッティングを繰り返します。室温でのインキュベーションの別の3分に従ってください。
- 0.5％コンゴーレッド溶液を700μLを引き出すために1ミリリットルピペットを使用してください。コンゴ赤色溶液をすすぐために蒸留水700を添加する。洗浄液まで洗浄3〜4倍を繰り返し明らかである。
- のセクションでは、損傷を与えることなく、容易にピペットで可能なように、先端カットで1ミリリットルピペットを使用してください。そっと先端に、顕微鏡スライド上のセクションをピペットし、カバーガラスでそれらをカバーしています。 40分の560のバンドパスのフィルターを使用した青色励起下で顕微鏡スライド上のサンプルを観察します。注：水は10から30分でコンゴレッドを洗い流すよう、電子顕微鏡による分析の前に長い間水にセクションを保管しないでください。
8。·ホワイト染色9
- 0.2％の原液を準備するために蒸留水を10ミリリットル中に蛍光増白28（·ホワイトM2R）の0.02グラムを溶解する。 0.2％溶液を4℃の暗瓶で6ヶ月間保存することができる蒸留水で0.2％の原液を10倍に希釈して0.02％のワーキング溶液を調製します。
- 2.0ミリリットルマイクロ遠心チューブにステム部分を転送します。 0.02％calcofのチューブ1ミリリットルに追加白ソリューションluor。優しく上下に0.02％·ホワイトソリューションをピペット。注：これはセクションを損傷する可能性があるピペットチップにセクションをピペットないように注意してください。
- 5分間室温でインキュベートし、ピペッティングを繰り返します。室温でさらに3分間のセクションをインキュベートします。注：セクションでは、それが簡単にセクションを損傷することなく、ソリューションをピペットするために、チューブの底部に沈殿させる。
- 0.02％·ホワイト溶液を700μLを引き出し、蒸留水700μlのを追加して1ミリリットルピペットを使用してください。 ·ホワイトソリューションをすすぐために5分間待ちます。ウォッシュ3〜4倍を繰り返します。のセクションでは、損傷を与えることなく、容易にピペットでできるような方法などでのピペットチップカットで1ミリリットルピペットを使用してください。
- そっと先端に、顕微鏡スライド上のセクションをピペットし、カバーガラスでそれらをカバーしています。 UV光下のセクションを観察します。
9。トルイジンブルE O染色16,17
- 0.02％の溶液を調製し、100 mlの蒸留水に0.02グラムのトルイジンブルーOに溶解する。 NOTE：トルイジンブルーO溶液を室温で暗所瓶で2週間保存することができる。
- 2.0ミリリットルマイクロ遠心チューブにステム部分を転送します。チューブに0.02％トルイジンブルーO溶液1mlを加える。優しく上下に0.02％トルイジンブルーOソリューションをピペット。その後、5分間室温でインキュベートし、一回ピペッティングを繰り返します。注：これはセクションを損傷する可能性があるピペットチップにセクションをピペットないように注意してください。のセクションでは、落ち着くまではマイクロチューブが静止してみましょう。これにより、ソリューションが暗いように、参照のため、試験管立てに関するセクションを含むチューブを保持し、それらを室温で2分間沈降することを可能にするのは難しいかもしれません。
- 0.02％トルイジンブルーO溶液を700μLを引き出すために1ミリリットルピペットを使用してください。トルイジンブルーOゾルをすすぐために蒸留水を700μl加えution。 3〜4倍を繰り返したり、洗浄溶液が透明になるまで。セクションは、それらを損傷することなく容易にピペッティングすることができるような方法でピペットチップカットながら1 mlピペットを使用する。
- そっと先端に、顕微鏡スライド上のセクションをピペットし、カバーガラスでそれらをカバーしています。明視野照明下のセクションを観察します。
- 顕微鏡でのケーラー照明を調整します。目的を選択してください。最初の試料に焦点を当てています。半分以下に光強度をもたらす。視野絞り（FD）と絞り（AP）を閉じるか、その特定の目的に可能な限り低い設定にそれを持って来る。
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Representative Results
埋め込みと分割幹：
埋め込 むための自家製のプラスチック金型の使用は、アガロース迅速かつ簡単に（ 図1）であることが判明した7％で生じる。二つの部分（AとB、 図1）組み込みバイアルシステムのは、それが簡単な、容易にクリーンなシステムを維持し、アガロースが不活性であるバイアル部分に付着しないようにアガロース中に埋め込 まれた茎を解放すること。バイアルは何年も複数回再使用することができる。埋め込まれた茎を格納する利便性にも次のステップが容易になります。茎組み込み、同様の、いつか節約するために切片化のため、単一の切片板の上に（3まで）にグループ化することができます。
UV下で芳香族化合物の観察：
幹切片をガラススライド上に蒸留水に搭載され、UV光の下で観察した。細胞中のリグニンを含む芳香族化合物は、UV光の下で、それらの自己蛍光により可視化することができる。木部（XY）とfasciclesの間の繊維（FI）リグニン、芳香族ポリマーは、二次細胞壁の生合成の間に堆積されているので、UV照射下ではなく、髄（パイ）および皮質又は表皮（EP）（ 図2）において自己蛍光を示した。植物は、それらの液胞（ 例えば 、アントシアニン）中の芳香族化合物を大量に蓄積するときにいくつかの例では、蛍光は皮質細胞（データは示さず）で観察することができる。良好な幹細胞壁を横切っ芳香分布を可視化する-の断面は5X、10X、20X、40Xおよび倍率（E、それぞれ図2のパネルA、B、C、およびD）で分析した幹細胞。
フロログルシノールとマウレ染色で染色茎切片におけるリグニンの観察：
血管や繊維とfasciclesの間の繊維で構成木部は、リグニンの汚れ（フロログルシノールとマウレで染色した茎の要素だけだった）は、野生型幹切片サンプルを使用して。フロログルシノール染色はピンクや赤紫の色4（ 図3）を得たリグニンのシンナムアルデヒド末端基と反応する。 UV照射下で観察されたように、フクシア着色は木部とfasciclesの間の繊維で観察されたが、（ 図3）髄と皮質や表皮には存在しない。断面は、5X、10X、20X及び40X倍率（ 図3のパネルA、B、C、およびD - Eのそれぞれ）で分析した幹良好幹横切っフロログルシノール染色分布を可視化し、主要な組織を区別するために;木部とfasciclesの間の繊維;髄と皮質;表皮。通常色の強度は、定性的な方法で木質化のレベルと相関する-を分析突然変異体またはトランスジェニックが異常ナムアルデヒド由来のユニット（ 例えば 、CADの変異体）が濃縮されている場合を除いて<> 14 SUP。マウレ染色は木部とfasciclesの間の繊維にシリンリグニン単位を検出するのに固有のものです。赤色着色はリグニン素子（ 図4）18シリンリグニン単位の存在を示す。木部は、Gの単位であるのに対し、より濃縮された繊維がSリグニンのより高いレベルを含有することを示唆している木部組織と比較した場合しかし、明るい赤色の着色は、繊維において観察される。フロログルシノール染色後に観察されたように、赤色の着色は、木部とfasciclesの間の繊維で観察されたが、（ 図4）髄と皮質や表皮には存在しない。また、UV下で観察リグニン分布（ 図2）と相関し、シリンギル単位はこのステムサンプルのすべての木化組織中に存在することを示している。ステムの断面は5X、10X、20Xで分析し、そして40倍の倍率（ 図2のパネルA、B、C、としたD - Eのそれぞれ）より良いステム全体でマウレステイン分布を可視化し、大規模な組織に分化する：木部とfasciclesの間の繊維、髄と皮質、および表皮を。これは、木化組織間シリンギル単位の量と分布は、ステムの年齢によって異なり、若い茎（データは示さず）に存在しなくてもよいことに留意することが重要である。
·ホワイト、コンゴレッド染色で染色茎切片の観察：
·ホワイト汚れセルロース、カロース、および他の非置換または弱置換されたβ-グルカン;一方、コンゴレッド汚れに直接β-TO（1→4） - グルカンであり、特にセルロースに。カルコフロールホワイトで染色された幹切片をUV光下で観察した6-9。コンゴレッド染色切片560/40バンドパスフィルタとを用いて青色光励起下で観察した。どちらも、白とコンゴレッドは、表皮、皮質、および髄染色カルコフロール;目これらの組織の全てが、それらの細胞壁における主要な多糖ポリマー（ 図5および図6のそれぞれ）のセルロースが含まれているためである。白カルコフロールとは対照的に、コンゴは木部とfasciclesの間の繊維に、より良い染色の多糖類を赤とします（ 図5と図6）10,11少ないリグニンの存在によって影響と思われる。断面は、5X、10X、20Xで分析した、（6パネルA、B、C、及びDE、それぞれ図5と）良好ステム及び主要にわたって白とコンゴーレッド染色分布カルコフロール40X倍率可視化するためにステム組織（木部やfasciclesの間の繊維、髄と皮質、および表皮）。
トルイジンブルーOでステンド幹切片の観察：
それは異なる化学が異なり細胞の成分との結果と反応するため、トルイジンブルーOが多色の染料として分類されているマルチカラーの試料（ 図7）。生成された色は、細胞およびその壁の性質に関する情報を提供することができる。トルイジンブルーOがマイナスの5グループを充電するために結合し、カチオン染料である。この色素の水溶液は青ですが、色素が細胞6,9の異なるアニオン性基と結合するときに、異なる色が生成されます。染料は、ペクチン酸などのカルボキシル化多糖類と反応すると、たとえば、ピンクがかった紫の色が表示されます。このようなリグニンやタンニンなどのポリ芳香族物質と緑、緑がかった青、明るい青;および核酸と紫や緑がかった青。幹断面のトルイジンブルーO彼らは緑がかった青または青に着色します（ 図7、パネルC）を示すため、木部やfasciclesの間の繊維は、紫外線及びPh-塩酸染色の観察と一致している、木化していることを明らかにした（ 図2、図3）。対照的に、髄およびそれらが木化していないが、彼らは細胞壁にいくつかのペクチンポリマーを含んでいるため、皮質および表皮組織は緑がかった青色又は青の着色を示す。より良いステムを横切っトルイジンブルーO染色の分布を可視化するために、主要な組織を区別するために-の断面は5X、10X、20X及び40X倍率（E、それぞれ図7のパネルA、B、C、およびD）で分析した幹細胞。
図1左側には茎を埋め込 むための手作りの金型。。; 2ミリリットルのスクリューキャップ付き遠心管（パートA）および0.6 mlのマイクロ遠心チューブ（パートB）から下の上。右側にある;パラフィルムは二つの部分を保持している。最終的な金型を形成するために、AとB。
図2。AのUV蛍光 A.野生型のシロイヌナズナ断面をステム。横断切片のみfasciclesの間の繊維及び木部細胞（ - E A）の壁中のリグニンを含む芳香族化合物の存在を示すUV光下で蛍光シロイヌナズナステム。表皮および皮質（EP）、fasciclesの間の繊維（Fiの）、髄（パイ）、木部（XY）の位置が示されている。倍率： パネルA：5X;パネルB：10X;パネルC：20X、パネルDとE：40X。バー=100μmである。
図3。Aのフロログルシノール塩酸染色シロイヌナズナの茎の断面 。野生型Aのフロログルシノール塩酸染色（ピンクや赤紫の色） fasciclesの間の繊維と木部細胞（E - A）の壁に通常のリグニンの堆積を示すシロイヌナズナの茎部分。表皮および皮質（EP）、fasciclesの間の繊維（Fiの）、髄（パイ）、木部（XY）の位置が示されている。倍率： パネルA：5X;パネルB：10X;パネルC：20X、パネルDとE：40X。バー=100μmである。
図4。Aのマウレ染色シロイヌナズナの茎の断面。野生型Aのマウレ染色（赤色） シロイヌナズナ</ em>のfasciclesの間の繊維と木部細胞（A - E）の壁に通常のリグニンの堆積を示すステム部。表皮および皮質（EP）、fasciclesの間の繊維（Fiの）、髄（パイ）、木部（XY）の位置が示されている。倍率： パネルA：5X;パネルB：10X;パネルC：20X、パネルDとE：40X。バー=100μmである。
図5。Aの·ホワイト染色野生型Aのシロイヌナズナの茎の断面。·ホワイト染色セルロース表皮の細胞の細胞壁に沈着、皮質、髄、fasciclesの間の繊維、木部（ - E A）を示すシロイヌナズナのステム部。 POSITI表皮および皮質（EP）のアドオン、fasciclesの間の繊維（FI）、髄（PI）、および木部（XY）が示されている。倍率： パネルA：5X;パネルB：10X;パネルC：20X、パネルDとE：40X。バー=100μmである。
図6。Aのコンゴレッド染色野生型Aのシロイヌナズナの茎の断面。コンゴレッド染色セルロース表皮の細胞の細胞壁に沈着、皮質、髄、fasciclesの間の繊維、木部（ - E A）を示すシロイヌナズナのステム部。表皮および皮質（EP）、fasciclesの間の繊維（Fiの）、髄（パイ）、木部（XY）の位置が示されている。倍率： パネルA：5X;パネルB パネルC：20X、パネルDとE：40X。バー=100μmである。
Aの図7。トルイジンブルーO染色 A.野生型のシロイヌナズナ断面をステム。トルイジンブルーO染色fasciclesの間の繊維と木部細胞（E - A）の壁に通常のリグニンの堆積を示すシロイヌナズナの茎部分。表皮および皮質（EP）、fasciclesの間の繊維（Fiの）、髄（パイ）、木部（XY）の位置が示されている。倍率： パネルA：5X;パネルB：10X;パネルC：20X、パネルDとE：40X。バー=100μmである。
イメージングのための表1。顕微鏡とカメラの設定。蛍光フィルターと明視野画像を操作するためのガイドライン。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
シロイヌナズナステム部が広く二次細胞壁中の細胞の組織化を研究し、定性的に、野生型およびトランスジェニック植物の間の差を調べるために使用される。標本を区画するために一般に使用される技術は、直接手で切っている。標本はアガロースまたは固定液に埋め込まれたとき、または、切片をビブラトームまたはミクロトームで行うことができます。手の切断とは対照的に、最後の二つは、単にサンプルと凹凸面との間の厚さの違いに起因する不良試料調製に起因するサンプル間の不正確な差を生成する危険性を低減することを可能にする。これらのメソッドはすべて、彼らの長所と短所を持っている。私たちは、ビブラトームを使用して切片化した後、アガロース中に埋め込むことを選んだ、と次のような理由でそのようにした：新鮮な組織の複雑な処理が不要に埋め込むのしやすさと時間アガロースを使用して過ごした。また、私たちの手作りの金型を作るのは簡単で安価である、目を保持することができますEストレートステム、長年にわたって使用することができ、混乱を行わずに試験片の容易なリリースでは助けることができます。高割合のアガロースを溶解し、均一な溶液（分厚い顆粒を形成することなく、100ミリリットル中のアガロースの7グラムの完全溶解）を取得するための最良の方法は、それをオートクレーブまたは最低強度で、それをマイクロ波することです。これは、新鮮な茎組織を切断するか、あるいは、組織の脱水や変形を防止するために、水で湿らせた濾紙を含む氷上に置き、プレートに保管することが重要である。高水分のない30分よりも長い期間、ステムを格納すると、茎が乾燥させます。ステムが埋め込まれる直前アガロースの温度は約50℃であるべき気泡が型内にギャップを引き起こし、その結果、切片が不均一になるので、アガロースがバイアルに注入された後に気泡の存在を確認することが重要である。気泡が注ぐする以前に、真空下で溶液を配置することによって迅速に除去することができるそれ。それはまだ〜50℃よりも暖かく、ソフトではない場合、ステムは、アガロースに配置する必要があります熱はステムをshrivelingすることにより、試料を損傷し、細胞形態を破壊します。アガロースが寒すぎる場合は、ステムは、アガロースを貫通せず、埋め込みはできません。アガロース包埋した後、ステムサンプルは一週間まで4℃で保存することができる。
代わりに手切片利回りのビブラトームの使用は、正確に試験体とより良い画質を切った。ビブラトームを使用している間、すべての安全上の注意をよく読み、従ってください。これは、試料ディスクは、それが切片中に脱落しないように組織接着剤が所定の位置に強く、検体を保持できるようにするために、清潔で乾燥していることを確認することが重要です。試験片の厚さは、染色手順の間、過酷な酸と塩基の治療に耐えるように指定されている。ビブラトームで使用されるカミソリの刃は、セクションは、EVをカットしていることを確実にするために、完全に平らにしてくださいenly。切片は、サンプルあたり約20分かかります。時間を節約するために、同様の試験片を、単一の試料プレート上のグループに区分けすることができる。切片の間に、切片を、透明な背景に見ることと次の検体のためのバッファトレイを解放するためのセクションを容易にするために、小さなペトリ皿にバッファトレイから転送されています。切片はすぐ下流染色手順のために使用または後で使用するために保存することができる。 2.0ミリリットルマイクロチューブにステム部分を分注すると、染色手順のためのプライミングするのに役立ちます。カメラと顕微鏡の正しい調整や設定を行うと、高品質の画像を実現するために非常に重要である。ケーラー照明を調整すると、顕微鏡の使用されている最も重要なステップの1つです。方法の項で説明したように、絞りと光強度の調整は、あくまで目安としてのものです。彼らは、利用顕微鏡とカメラに応じて変更する必要があるかもしれません。我々は、高分解能を用い大判インターラインCCDチップとUVイメージング、カルコフロールホワイト、コンゴレッド染色のための機械的なシャッターを備えたデジタルカメラ。マウレ、フロログルシノール、トルイジンブルーO染色の明視野画像の高解像度、高速カラーカメラ。画像は、分析され処理され、標準的な画像化ソフトウェアを用いて組み立てた。
フロログルシノールは、リグニンを決定するための最も一般的に使用される染色であり;それが唯一のシンナムアルデヒド末端基を染色として、真のリグニン汚れではありません。またWeisner染色として知られているフロログルシノール染色は、木部、これらのアルデヒド基が4存在fasciclesの間の繊維中の特徴的なチェリーピンクやフクシアの色が得られます。ピンクの色の強度は木質化の程度に応じて変化する。微妙な違いが観察することが困難ですが、それは野生型とそのリグニン含量19にばらつきがあり、変異体幹の節間の違いを見つけることは容易である。また、EASであるこのような組織間の木質化レベルが異なるため、（茎頂に向かって）若いと古い（ベース幹細胞）の組織との違いを観察するY。異所性木質化20が存在しない限り、通常は野生型の幹に、表皮の皮質と髄が（そのために着色されません）シンナムアルデヒドが含まれていません。マウレ汚れは、他の一方で、シリンリグニン単位に向けて具体的なであり、SまたはG単位で異なるリグニン濃縮度（木部組織に対する例ファイバ）14,18を区別するために使用することができます。メトキシカテコールを形成し、その後、水酸化アンモニウムとの反応後に-o-キノンをメトキシ、リグニンのSユニットのシリン核上過マンガン酸カリウムと塩酸行為。マウレの汚れ（ シロイヌナズナF5H変異体と一般裸子植物工場でEG）不足や広範囲にリグニンのS単位で枯渇している突然変異体を区別するための良好な指標である、マウレは黄褐色の着色工大与える木部や厚膜組織21の両方に赤のEAD。同じ理由で、マウレ染色は、主に、典型的にはS部18を欠く裸子植物からSリグニンを含有する、被子植物を区別するために使用することができる。強い酸と塩基は、それぞれ、フロログルシノールとマウレの染色手順の間に使用されているため、いくつかの実験の手順は慎重に実行する必要があります。濃HClおよび水酸化アンモニウムの両方が強い腐食性である。 Phは塩酸とマウレ染色したサンプルを含むスライドが適切に処理されていない場合、彼らは、顕微鏡のステージとレンズを劣化させることができます。彼らはまた、標本が低下する原因となる、5〜10分以内に、すぐに乾燥させることができるので、撮影が急速に行われなければならない。トルイジンブルーO多色染色であり、それはマルチカラーの試料を作製異なった細胞壁の異なる化学成分と反応するように異なる色で細胞壁の異なる成分を染色する。生成された色は、提供します：することができます細胞の性質にE情報。トルイジンブルーOもマイナスのグループを5,6充電に結合するカチオン性色素である。この色素の水溶液は青ですが、色素が細胞内の異なるアニオン性基と結合するときに、異なる色が生成されます。染料は、例えばペクチンなどのカルボキシル化多糖と反応して、例えば、色はピンクがかった紫色であり;このようなリグニンやタンニンなどの芳香物質と緑、緑がかった青、明るい青;および核酸と紫や緑がかった青。染色が容易であり、二日間続くことができる。
·ホワイト汚れセルロース、カロース、および他の非置換または弱置換されたβ-グルカン6-9、およびコンゴレッド汚れに直接β-（1→4） -グルカンであり、特に8,10,11をセルロースに。白い汚れカルコフロール見事表皮、皮質、および髄ますが、その輝きが大幅木部とfasciclesの間の繊維に還元される。 2 Pがあります重く木化組織における·ホワイトの削減蛍光についてossible説明;一方、今度は多糖類を介して適切に拡散するカルコフロールホワイトの能力を低下させるであろう、リグニンの存在に属性。 UV下で興奮白カルコフロールが発する蛍光の部分的な焼入れ第二の説明を指しています。カルコフロールホワイトとは対照的に、コンゴーレッド染色をすることは少ないリグニンの存在によって影響を受けると思われる。それは、赤·ホワイトとコンゴの間の蛍光特性の違いに関連している可能性;コンゴの良い拡散能力は·ホワイトより木質化組織に赤い;または多糖類結合特性22のわずかな違い。これは、コンゴレッドが水に洗い流さ取得する傾向があるため、コンゴレッドで染色した切片は、イメージングの前にあまりにも長い保存されるべきではないことに注意することが重要である。
組織化学的染色は、定量的でもないですが、も絶対に決定的な、それは視覚的な手がかりを通じてそのような組織の整合性や、異常な細胞壁沈着および木質化などの重要な形質に関する豊富な情報を明らかにすることができます。上述の染色技術は、実施が容易であり、そのようなリグニンおよびセルロースのような植物細胞壁において重要な要素に適用可能である。対照的に、特異的な抗血清およびモノクローナル抗体を用いた免疫蛍光はヘミセルロースおよびペクチンの様々な構成要素の検出に必要とされる。本報告書は、Aを使用し、二次細胞壁染色の分野では、初心者のためのプライマーとして機能するように意図されている彼らのモデルシステムとしてシロイヌナズナ 。
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Acknowledgments
我々は編集支援のためのセービンラッセルに感謝しています。この作品は、ローレンス·バークレーとの間の契約DE-AC02-05CH11231を通じてエネルギー省合同バイオエナジー研究所（http://www.jbei.org）米国エネルギー省でサポートされている、科学局、生物環境研究局の一部であった国立研究所と米国エネルギー省。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | EMD | MERC2125 | CAS Number: 9012-36-6 |
| Phloroglucinol | Sigma | P 3502 | 1,3,5-trihydroxybenzene [CAS Number: 108-73-6] |
| Hydrochloric acid | EMD | HX0603-75 | CAS Number: 7647-01-0 |
| Ammonium hydroxide | EMD | AX1303-6 | CAS Number: 1336-21-6 |
| Toulidine Blue O | Sigma | T3260 | Blutene chloride, Tolonium Chloride [CAS Number 92-31-9] |
| Potassium permanganate | Sigma | 223468 | CAS Number 7722-64-7 |
| Ethanol 190 proof | KOPTEC | V1401 | CAS Number: 64-17-5 |
| Congo Red | Sigma | C6277 | Disodium 3,3'-[[1,1'-biphenyl]-4,4'-diylbis(azo)]bis(4-aminonaphthalene 1-sulphonate) [CAS Number 573-58-0] |
| Fluorescent Brightener 28/ Calcofluor White Stain | Sigma | F3543 | 4,4'-Bis[[4-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-6-anilino-1,3,5-triazin-2-yl]amino]stilbene-2,2'-disulphonic acid [CAS Number 4404-43-7] |
| Vibratome | Leica | Leica Vibrating blade microtome VT1000S | http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/ |
| Razor | American Safety razor company | Item # 60-0139-0000 | Stainless Steel Double Edge Blade (Personna Super) |
| Screw Cap Microcentrifuge Tubes (2 ml) | VWR | 16466-044 | |
| Microcentrifuge Tubes (0.6 ml) | Axygen Scientific | MCT-060-C | |
| Mitt | Bel-Art | 380000000 | SCIENCEWARE Hot Hand Protector Mitt |
| Tissue adhesive | Ted Pella Inc | 10033 | Store at 4 °C or 20 °C for 3 months or longer storage |
| Microwave | Panasonic | NN-SD762S | PELCO Pro CA 44 Instant tissue adhesive |
| Camera with CCD chip with no mechanical shutter | Hamamatsu | C4742-95 | |
| High speed color camera | QImaging | MicroPublisher 5.0 RTV | |
| Camera software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.7.0.0 | |
| Imagining anaylsis | Adobe | Photoshop CS4 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1 | VWR | 48366-067 | 22 x 22 mm (7/8 x 7/8")-Cover glasses are corrosion-resistant and uniformly thick and flat. No. 1 thickness is 0.13 to 0.17 mm. |
| Frosted Micro Slides, 1 mm | VWR | 48312-003 | 75 x 25 mm - 1 mm |
| Parafilm M | Alcan packaging | BRNDPM998 | |
| TX2 Filter cube | Leica | 11513851/11513885 | Filter used for Congo red analysis with a band-pass of 560/40. |
References
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