Bio-lags Interferometry til måling Kinetik af protein-protein interaktioner og allosteriske Ligand Effects

Summary

Protokollerne her beskriver kinetiske analyser af protein-protein interaktioner med Bio-lags Interferometry. F-typen ATP syntase, som er involveret i cellulære energi metabolisme, kan hæmmes af sin ε underenhed i bakterier. Vi har tilpasset Bio-lags interferometri at studere interaktioner af det katalytiske kompleks med ε hæmmende C-terminale domæne.

Abstract

Vi beskriver brugen af Bio-lags Interferometry at studere hæmmende interaktioner af subunit ε med den katalytiske kompleks af Escherichia coli ATP syntase. Bakteriel F-typen ATP syntase er målet for en ny, FDA-godkendt antibiotika til bekæmpelse af multiresistent tuberkulose. Forståelse bakterie-specifikke auto-hæmning af ATP syntase ved C-terminale domæne af subunit ε kunne give en ny måde at målrette den enzym til opdagelsen af antibakterielle stoffer. Den C-terminale domæne af ε gennemgår en dramatisk konformationsændring når enzymet overgange mellem aktive og inaktive stater og katalytisk-site ligander kan påvirke, hvilke af ε s konformationer er fremherskende. The assay måler kinetik ε bindingssted / dissociation med det katalytiske kompleks og indirekte MEAninger skiftet enzym-bundet ε til og fra tilsyneladende nondissociable inhiberende konformation. Bio-lag interferometri signal er ikke overdrevent følsom over for opløsning sammensætning, så det også kan bruges til at overvåge allosteriske virkninger af katalytisk-site ligander på ε er konformationelle ændringer.

Introduction

Protein-protein interaktioner er vigtige for mange biologiske processer og etiket-fri optiske metoder som overflade plasmon resonans (SPR) er blevet anvendt in vitro for at undersøge kinetikken for binding og dissociation ^1. De fleste label-fri metoder immobilisere et biomolekyle på en overflade og bruge en optisk signal til at opdage en bindende partner fra løsning, da det forbinder med det immobiliserede biomolekyle ^1.. Mens SPR er en yderst følsom metode, det er udsat for interferens som følge af ændringer i brydningsindeks af opløsningen strømmer over sensor ^2. Selvom det ikke er så følsomt som SPR, Bio-lags Interferometry (BLI) er mindre påvirket af ændringer i prøven sammensætning ^1,3. BLI bruger fiberoptiske biosensorer, der har en proprietær biokompatibel belægning på spidsen. Det system, der anvendes her (Oktet-RED96) indeholder otte spektrofotometre. Hvidt lys ledes til en række af sonder, der bevæger sig på en robotarm. Fiberoptiske sensorer are opfanget af proberne og flyttes til en 96-brønds plade indeholdende prøver. En af målmolekylerne er immobiliseret på biosensoroverfladen. Derefter sensorer flyttes til brønde indeholdende bindingspartneren i opløsning. BLI overvåger sammenslutning af den bindende partner med det immobiliserede molekyle, og derefter overvåger dissociation efter at flytte sensorerne til løsning uden bindende partner. Binding af molekyler til biosensoroverfladen fører til ændringer i optisk interferens mellem lysbølger, der afspejler tilbage til spektrofotometre fra en indre overflade og fra den eksterne grænseflade mellem sensor og løsning. Disse ændringer i interferens kan kvantificeres og anvendes til at bestemme kinetiske satser for binding og dissociation, som opsummeret i animationen af figur 1.

Vi har anvendt BLI at måle interaktioner mellem det katalytiske kompleks af bakteriel ATP syntase og ε-underenhed, som automatisk kan inhibere enzymet. ATP SYnthase er en membran-embedded roterende nanomotor som katalyserer syntese og hydrolyse af ATP ^4. Det katalytiske kompleks (F _1), kan isoleres i en opløselig form, der fungerer som en ATPase. Subunit ε har to domæner: N-terminal domæne (NTD) er nødvendig for korrekt samling og funktionelle kobling af enzymet, men ikke interagerer direkte med de katalytiske underenheder, det C-terminale domæne (CTD) kan hæmme enzymet ved at interagere med flere katalytiske underenheder ^5,6. Denne ε-medieret regulering er specifik for bakterielle ATP synthaser og er ikke observeret i mitokondrie homolog. ATP syntase er opstået som et mål for antibakterielle stoffer, som det fremgår af den seneste FDA godkendelse af bedaquiline at behandle multiresistent tuberkulose ^7. Således kunne målrette ε hæmmende rolle for lægemiddelforskning give antibakterielle midler, der ikke hæmmer mitokondrie ATP syntase. Med det isolerede katalytiske kompleks (F _1), εbliver et dissocierbart underenhed. Men med ε bundet til F ₁ kan εCTD undergå en dramatisk konformationsændring, delvist indsættelse i enzymets centralt hulrum, og som danner en inhibitorisk stat, der er usandsynligt, at dissociere direkte ^6,8. Vi bruger BLI at måle kinetik F ₁ / ε bindende og dissociation, og indirekte, at undersøge allosteriske effekter af katalytisk-site ligander på ε s kropsbygning.

I vores system ε blev valgt til immobilisering på sensoroverfladen siden BLI signal (som SPR) er følsom over for massen af ​​molekylerne binder på overfladen. Den ε underenheden er små (~ 15 kDa) i forhold til den vigtigste F ₁ kompleks (~ 347 kDa). Således vil et større BLI signal skyldes binding af F ₁ til immobiliseret ε. For at overvåge F ₁ dissociation, hvilket kan være meget langsom, skal ε kraftigt immobiliseret. Således valgte vi at biotinylereOg immobilisere det på streptavidin-coatede biosensorer. Proteiner kan biotinyleres ved (i) tilfældig modifikation af overflade lysiner ^9, (ii) omsætning af en unik nativt eller manipuleret cystein med en biotin-maleimid reagens ¹⁰ eller (iii) genetisk tilføje en specifik biotin-acceptor-peptid, der er enzymatisk biotinyleres under in vivo-ekspression af det kodede protein ^11. I vores system er ε biotinyleres under anvendelse af metode (iii) ^8. Når biotin-mærkede ε er immobiliseret på streptavidin sensorer kan BLI måle bindingen og dissociation af F _1, der er blevet tømt for underenhed ε (F ₁ (-ε)). For eksperimenterne beskrevet her var foreløbige analyser blevet gjort for at bestemme rimelige mængder af det biotinylerede protein til immobilisering på sensorerne. Dette kan variere afhængigt af molekylvægten af ​​proteinet og dets bindingspartner, men målet er at bestemme en minimal mængde af immobiliseret protein that giver (I) acceptabelt signal til støj for binding kinetik med en lav koncentration af bindingspartneren (under K _D) og (ii) minimal forvrængning af binding kinetik med nær-mættende koncentration af bindingspartneren. Desuden kan støkiometri biotinylering variere (men undgå> 1 mol biotin / mol protein), så nogle indledende analyse kan være behov for hvert nyt lot biotinyleret protein for at bekræfte, at en konsekvent BLI signal kan opnås i løbet af immobilisering på streptavidin-coatede sensorer.

Protocol

1.. Programmering af instrumentet for BLI Assay

Tænd instrumentet mindst en time i forvejen for at lade lampen varme op, og dette er nødvendigt for at minimere støj og drift i optisk signal under eksperimentet. Indstil den ønskede temperatur via fanen instrument til opvarmning af prøven plade holder. Derefter oprette den eksperimentelle design i dataopsamling software. Vælg "Ny Kinetics Experiment" i fanen Experiment Wizard. Dette giver en tabbed menu med alle skridt, der skal defineres.

1.1. Plate Definition

Definer de kolonner, der skal bruges på 96-brønds prøveplade. Tildel kolonner indeholder puffer, immobiliseret protein eller bindingspartner. For hver forening godt indtaste koncentrationen af ​​bindende partner, der skal bruges. Bemærk: pladen definitionen vist i figur 2 har muligheder for forskellige assays.

1.2. Assay Definition

NDHOLDET "> Definer alle nødvendige skridt for analysen. Disse omfatter (i) Baseline (flere), (ii) Loading, (iii) Association og (iv) dissociation af bindingen partner. Så, som beskrevet nedenfor, link individuelle assaytrin med kolonner af brønde på prøve pladen ved at vælge analysen trin og derefter dobbeltklikke på den respektive kolonne. Denne programmer sensorerne skal flyttes fra én kolonne med brønde til den næste i løbet af analysen.

1. Baseline
   Begynde med en kort baseline trin (≥ 60 sek), og sensorer i assaypuffer (fig. 2, kolonne 1), for at bestemme de indledende BLI signaler i 96-brønds plade.
2. Loading (immobilisering af biotinylerede protein på sensorerne)
   Tildel sensorer til brønde, der indeholder det biotinylerede protein (figur 2, kolonne 2). Brug tærskel funktion til at opnå et forudbestemt niveau af binding (se indledningen). Indstil tærsklen indstilling, så alle sensorer vil være flytted til den næste kolonne af brønde, når et hvilket som helst af sensorerne når tærsklen.
3. Baseline
   Omfatter en anden baseline trin i puffer (fig. 2, kolonne 3, typisk> 5 min) for at skylle immobiliserede biotinylerede proteiner fra sensorerne og etablere nye stabile baseline signaler. For grundlæggende binding / dissociation assays (som i figur 3), omfatter en ekstra baseline trin (60 sek) med sensorer i nye brønde af buffer (figur 2, kolonne 4), før foreningen trin.
4. Association (af bindingspartneren til det immobiliserede protein)
   For en grundlæggende bindende / dissociation assay (som i figur 3), skal du vælge en række koncentrationer af bindende partner, der skal anvendes til forskellige sensorer / brønde (figur 2, 5. kolonne). Juster trin tid, således at i det mindste en mætningskoncentration af bindingspartneren bør henvende ligevægtsbinding signal. For enassay til at teste allosteriske virkninger af små ligander på dissociation af protein-protein-kompleks (som i figur 5), vælge en enkelt høj koncentration af bindingspartner (~ 10-fold over den beregnede K _D) til anvendelse i alle associerings brønde.
5. Dissociation (af bindingspartneren)
   For en grundlæggende bindende / dissociation assay blev kun (som i figur 3), udpege sensorerne at vende tilbage til kolonne 4 (fig. 2), den samme buffer brønde, som anvendes for den ekstra basislinje før Association. Til et assay til at teste allosteriske virkninger af små ligander, i stedet betegne sensorer til at flytte til spalte 6 (figur 2), hvor hver brønd kan indeholde buffer plus forskellige allosteriske ligander.

1.3. Sensor Assignment

Anfør steder i sensoren bakke, der vil indeholde befugtet sensorer til analysen. Identificer eventuelle tomme positioner da eksperimentet vil Fail hvis ingen sensorer er samlet op.

1.4. Anmeldelse Experiment

Visualiser alle planlagte trin for at kontrollere for fejl og gå tilbage for at rette dem.

1.5. Kør eksperiment

Indtast de nødvendige oplysninger, herunder placering af datafiler. Indtast den ønskede temperatur til eksperimentet. Hvis sensorer kræver stadig Befugtningsanlæg, skal du vælge at udskyde starter eksperimentet. Endelig, når alle prøveforberedelse er afsluttet (trin 2) og både prøve plade og sensor bakke indlæses i instrumentet, skal du klikke på knappen Go for at køre analysen.

2. Prøveforberedelse

1. Forbered et passende assay buffer. Buffer anvendes til forsøg er vist i figur 3 og 5: 20 mM MOPS (3 - (N-morpholino) propansulfonsyre), Tris (Tris (hydroxymethyl) amino-methan) (tilsat for at justere pH til 8,0), 50 mM KCI. Omfatter BSA (bovint serumalbumin, fedtsyrer fri, 0,5mg / ml endelig) i bufferen for alle assaytrin og for alle fortyndinger af biotinyleret protein eller bindingspartner for at minimere ikke-specifik binding af proteiner til sensorerne.
2. Fortynd det biotinylerede protein (ε) i assaybuffer til en passende koncentration (se indledningen).
3. Forbered fortyndinger af bindende partner (F ₁ (-ε)) i assay buffer (se Diskussion for koncentrationsområde at bruge).
4. Prewet streptavidin-coatede sensorer til mindst 10 minutter for at fjerne den beskyttende saccharose belægning. Fjern sensoren indeholder rack fra sensoren skuffen ud, indsæt en 96-brønds plade i bunden af ​​bakken, glidende ene hjørne af pladen i orienteringsværktøjet hak på bakken. For søjle af følere, der skal anvendes, tilsættes 200 pi assaypuffer per brønd i kolonnen af ​​96-brønds plade. Retur rack af sensorer til bakken i den rigtige retning (med faner i slots).
5. Som er tildelt under programmering i trin 1, skal du udfylde brønde of prøvepladen med assaybuffer eller de pågældende proteinfortyndinger som i figur 2. Undgå at indføre bobler, da de kan forårsage støj i det optiske signal. Omfatte en eller flere referencesignaler brønde, der udelader enten (i) biotinyleret protein eller (ii) binding partner.
6. Åbn døren af ​​instrumentet, og sæt sensoren bakke på scenen (til venstre), med faner den bakke er indsat i åbningerne på scenen. Sæt prøvepladen ind pladeholderen (til højre), sørg for at pladen sidder fladt og i den rigtige retning, som angivet på pladen holder. Lukke døren og starte assayet fra dataopsamling programmet (trin 1.5).

3. Databehandling

1. Når analysen er kørt, skal du åbne Dataanalyse software og indlæse den mappe, der indeholder dataene. Klik på fanen "Processing" for at se en trinvis Processing menuen (til venstre) og de rå kinetiske data, med hver sensor (AH) er tildelt en anden farve (seFigur 3).
2. Under "Data Selection", klik på "Selection Sensor" knappen. På "Sample Plate Kort", udpege brøndene til 1 eller 2 Sensorer (G, H i analysen i figur 3) som reference-brønde. , Skal du kontrollere "subtraktion" boksen for behandling menuen og vælg "reference Wells" at trække referencesignal (enkelt eller gennemsnit) fra alle andre følersignalet.
3. Juster alle spor til Y = 0 ved at bruge "Align Y-akse" skridt. Vælg "Baseline" som trin tilpasning (dette er den sidste baseline før foreningen trin). For "Time Range", indtast de sidste 10 sekunder af denne baseline (dvs. 50-60 sek for en 60-sek baseline, som i figur 3).
4. Check "Inter-trins Correction" boksen for at minimere signal skift mellem foreningen og dissociation trin. Vælg tilpasse til Baseline eller Dissociation.
5. Vælg Savitzky-Golay filtrering funktion i de fleste tilfælde, og klik på "Process data!" for at fortsætte. Eftersede endelige behandlede data (nederste højre panel). Med analyser beregnet til global dataanalyse (som i figur 4), hvis signal spor viser et markant skift mellem foreningen og dissociation trin, ændre valget af Dissociation eller baseline til "Inter-trins korrektion", og oparbejder de data, før du fortsætter til data Analyse.

4.. Dataanalyse

Klik på "Analyse"-fanen i Dataanalyse at begynde. Bemærk: eksempel trin nedenfor er for den globale analyse af flere binding / dissociation kurver (som i figur 3).

1. For "Step til Analyze", vælg Association og Dissociation. For "Model", vælg 01:01. Bemærk: andre begrænsede valgmuligheder er tilgængelige.
2. For "Fitting", vælg Global (Full). For "Group Ved" Vælg farve (som på grafen). Vælg "R _{max-tilkoblede} Af Sensor" for at tillade uafhængig montering af R _max (maksimal signal respons ved mætte binding af partner til den immobiliserede protein). Bemærk: vi gør det for de fleste analyser, som sensorer variere lidt i mængden af protein immobiliseret (jf. figur 3, Loading).
3. På tabellen, sørge for alle sensor spor, der skal analyseres har samme farve, så vil de blive analyseret som et sæt globale. Hvis det er nødvendigt, skal du vælge en eller flere sensor spor at udelade fra den globale montering: under "Medtag" kolonnen, skal du højreklikke på den ønskede sensor position og vælg "Udelukke Wells".
4. Klik på "Fit Curves!" at starte lineær regressionsanalyse. Undersøg tilpasningsresultater, som omfatter (i) overlejring af regressionskurver med sensor data spor (som i figur 4), (ii) plots af montering residualer, og (iii) en tabel med beslutsomme parameterværdier (ratekonstanter R _max, K _D) og statistik (standard fejl for parametre, Chi-squared, R ^2).
5. Under "Data Export", gem montering resultater ved at klikke på "Eksporter tabel til. Csv-fil." For graphing eller yderligere analyse af data / monteret kurver med anden software, skal du klikke på "Eksporter Montering Results" for at gemme hver sensor data og tilpassede kurve i en tekstfil.

Representative Results

Realtids-binding og dissociation BLI kinetik er vist i figur 3.. Dette eksperiment blev udført med assaypuffer i foreningen og dissociation. Dette eksperiment blev startet med en 10 min baseline skridt, da sensorerne var blevet prewet kun kortvarigt. Dernæst blev biotinyleret ε indlæst på sensorerne. Ingen påviselig dissociation af ε opstod gennem alle resterende trin set fra referencekurven (G), som ikke havde nogen bindende partner tilføjet. En anden henvisning sensor (H) var blottet af immobiliseret protein og udviste lav ikke-specifik binding af bindingspartneren. Forskellige koncentrationer af F ₁ (-ε) blev anvendt i foreningen trin til sensorer AF for at passe resultater globalt og få de bedste værdier for k _a, k _d og K _D. Resultaterne blev bearbejdet som i protokollen, hvilket giver data spor (blå) i figur 4.. I dette tilfælde blev referencesensor spor H fratrækkes prøve trEsser at korrigere for ikke-specifik binding af bindingspartneren og systemets signal afdrift. I dataanalyse skridt, alle kurver var globalt fit med en 1:1 model (enkelt k _a, enkelt k _d) den "globale (Full)" fit forudsætter fuldstændig dissociation af bindingen partner (signal vil vende tilbage til nul ved uendelig tid) (figur 4, rød). Bemærk, at for de to højeste koncentrationer af F ₁ (-ε), der er små, men væsentlige afvigelser af data fra den globale, 1:1 model. Lave niveauer af immobiliseret ligand (biotinyleret "ε" underenhed) blev anvendt, og pasformen blev ikke forbedret ved at inkludere en masse transport faktor i modellen (ikke vist). Men F ₁ (- "ε") er et stort kompleks (~ 350 kDa), og andre forsøg (ikke vist) tyder på, at disse afvigelser skyldes reduceret binding adgang til en brøkdel af immobiliseret ligand, dvs en F ₁ bundet til én "ε" kan sterisk hindre adgang til en anden biotinylerede"Ε" bundet på samme streptavidin tetramer.

Figur 5 viser en anden eksperiment, hvor enzymet var bundet til sensor-immobiliseret ε i tilstedeværelse af 1 mM ATP / EDTA, hvilket disponerer fleste F ₁ / "ε" komplekser at påtage sig den inhiberende kropsbygning, som dissocierer let ^8. Sensorer blev derefter flyttet til dissociation brønde indeholdende assaypuffer med forskellige ligander. Dette viser virkningerne af forskellige ligander på kropsbygning af ε. For eksempel udsættelse for MgADP / Pi dramatisk bremset netto dissociation, hvilket indikerer, at ε flyttet kropsbygning til den stramt bundne, hæmmende tilstand. Komplekse dissociation kinetik blev observeret, da forskellige ligander forårsagede forskellige skift i den fraktion af F _1. Ε komplekser med ε i de aktive (dissocierbare) eller hæmmende (nondissociable) konformationer. Det er også muligt at væsentlige konformationelle ændringer af bundne proteinerbidrage direkte til ændringer i BLI signal, men i vore undersøgelser, synes dette at være ubetydelig i forhold til signalet for binding / dissociation af store F ₁ kompleks (se Shah et al ^8, figur 5D. overgang til kurverne 3 og 6 viser meget lignende opførsel, selv om deres vilkår favoriserer forskellige konformationer af bundet F _1). Data Analysis-software er ikke beregnet til sådanne komplekse dissociation kinetik. Således har vi eksporterede data til tekst filer til ikke-lineær regressionsanalyse med anden software.

Figur 1.. Principper for Bio-lags Interferometry. Animation opsummerer de underliggende fysik til påvisning af biomolekylære interaktion med BLI. Lys, der passerer gennem sonder reflekteres tilbage til spektrofotometre (I) fra den indre overflade af sensoren, og (ii) fra den eksterne iinterface af føleren med prøveopløsningen. Dette resulterer i et interferensmønster. Binding af molekyler til sensoroverfladen ændrer interferensmønster. Dette kan afbildes som en nanometer forskydning af relativ intensitet vs bølgelængde. Overvågning denne nanometer skift over tid giver bindende og dissociation kinetik. Grafik er tilpasset med tilladelse fra FortéBio ^12.

Figur 2.. Skematisk arrangement af prøver i 96 brønde prøve plade. Sensorerne vil blive flyttet parallelt fra kolonne til kolonne og kan flyttes enten til venstre eller højre, som defineret i et bestemt assay-protokol. Brønde med grå farve repræsenterer assaybuffer henviser rød, blå og grøn repræsenterer immobiliseret protein bindingspartner og ligaNDS, hhv.

Figur 3.. Skærmbillede viser rådata fra en BLI assay. Lodrette røde linjer angiver bevægelse af sensorer mellem assaytrin i protokollen. Step typer betegnes på billedet. Steder buffer og prøver som vist i figur 2. Som bemærket af numre langs toppen af ​​grafen blev streptavidin-coatede sensorer flyttes mellem forskellige kolonner af prøven plade i følgende rækkefølge: 123.454. Legenden under grafen angiver farven for hver sensor data spor. I Loading trin blev hver sensor undtagen H inkuberet med 50 nM biotinyleret "ε" underenhed. I foreningen trin, blev sensorerne inkuberet med nM koncentrationer af "ε"-udtømte F _1: 30 (A, H), 20 (B), 15 (C), 10 (D), 5 (E), 2.5 (F), 0 nM (G). Klik her for at se større billede.

Figur 4. Skærmbillede af de analyserede data fra BLI assay i fig. 3. Dataene blev behandlet og monteret som beskrevet i teksten. Kun Association og Dissociation trin vises, delt af en lodret rød streg. De behandlede data kurver er blå, den ikke-lineære regression passer fra 1:1 global analyse er vist i rødt. Globale tilpasningsresultater ^8: k _a = 2 x 10 ⁵ m ^-1 s ^-1 (± 0,1%), k _d = 4,8 x 10 ^-5 s ^-1 ("±" 0,1%), hvilket gav K _D = 0,24 nM. Goodness of fit: R² = 0,999054. Den maksimale bindende parameter (R _max) var egnet separat for hver sensor, med middelværdi = 0,813 nm ("±" 0,0803). Klik her for at se større billede.

Figur 5.. Resultater fra en BLI assay viser allosteriske effekter af ligander på ε s kropsbygning. F ₁ (-ε) blev bundet til sensor-immobiliseret ε i tilstedeværelse af 1 mM ATP / EDTA. Enden af ​​foreningen fase og en del af dissociation fase er vist. Under dissociation trin blev tydelige ligander for F ₁ katalytiske sites (opført for hver trace) medtaget for at iagttage deres allosteriske effekter på dissociation af F ₁

Discussion

Eksisterende instrumenter til BLI tillade betydelig gennemløb og fleksibilitet i assays for biomolekylære interaktioner. Forskellige opløsning prøver dispenseres i brønde i en sort mikrotiterplade, og et sæt af parallelle BLI sensorer er programmeret til at bevæge sig frem og tilbage mellem søjler af brønde på pladen. Prøverne omrøres med orbital omrystning hele assayet. Systemet anvendes her har 8 sensorer og bruger en 96-brønds prøveplade, men et andet system bruger 16 sensorer og en 384-brønds prøveplade. Således kan samspil mellem en sensor-immobiliseret biomolekyle og dets bindende partner i opløsning afprøves under forskellige forhold med flere sensorer i parallel. For eksempel i den første analyse præsenteres her med det immobiliserede inhibitoriske ε underenhed interaktioner blev målt med seks forskellige koncentrationer af enzym (bindingspartner) i parallelle (fig. 3 og 4). Dette gav en global analyse beslutsomhedne et enkelt par hastighedskonstanter (k _et k _d) for netto binding og dissociation, og dermed en ligevægtsdissociationskonstanten (K _D = k _d / k _a), som er enig tæt sammen med hæmningskonstant (K _I) bestemmes ud fra opløsning assays af enzyminhibering ved ε ^8. En anden type af eksperiment (figur 5) viste, at BLI også kan overvåge allosteriske effekter af små ligander på samspillet mellem to proteiner, virkningerne af forskellige ligander blev sammenlignet parallelt. Der er begrænsninger til påvisning af virkningerne af allosteriske ligander, idet BLI signal afhænger af massen af den bindende molekyle, og kan direkte påvisning af binding af små forbindelser under optimerede betingelser ^13. Men i analysen i figur 5 bindingspartneren, F _1, var et stort protein kompleks (~ 347 kDa), så BLI signal til dets binding / dissociation blev ikke signifikant påvirket af annoncetionelle binding af små ligander, såsom ATP (~ 500 Da) til F ₁ komplekset. Dette blev bekræftet med analyser, hvor disse ligander ikke påvirkede BLI signal for F ₁ bundet til en afkortet form af ε mangler den hæmmende CTD ^8.. Således skal assays af allosteriske virkninger overveje massen af ​​allosteriske ligand i forhold til massen af ​​de interagerende proteiner, og indbefatter fortrinsvis kontrol for at teste for direkte BLI reaktion på bindingen af ​​liganden.

Bemærk, at visse trin og ændringer i forsøgsprotokollen kan være afgørende for at opnå bedre resultater og mere præcis analyse. For eksempel, som i protokollen beskrevet her (se trin 1.2.3, 1.2.5), et assay beregnet til samlet analyse af binding og dissociationshastighedskonstanter bør omfatte en ekstra baseline trin (se trin 1.2.3) i en ny kolonne af buffer brønde (figur 2, kolonne 4), før foreningen skridt, og sensorerne skal være returned til samme kolonne i buffer brønde for Dissociation trin (se trin 1.2.5). Under hver sensor i samme brønd (med de samme optiske egenskaber) før og efter foreningen trin kan forbedre inter-trins korrektion (trin 3.4) for Foreningen / dissociation trin, og det letter global kinetiske montering af flere data spor (som i figur 4). Også for analyser, der er mere foreløbige end vist her, har programmet en mulighed for at afkorte eller forlænge tidspunktet for ethvert skridt i analysen (mens det er det aktive trin). Dette er nyttigt, for eksempel, hvis den optimale læsning signalet ikke allerede er kendt, eller hvis mere tid er nødvendig for at give tilstrækkelig dissociation til at opnå en god pasform for dissociationshastighed.

Uspecifik binding af bindingspartneren til sensoren overflade kan være et problem for etiket-fri metoder såsom SPR og BLI. I vores analyser blev denne minimeres effektivt ved at inkludere BSA i assaypuffer. Som i immunoblotTing protokoller, bortset BSA proteiner kan bruges, og lave koncentrationer af vaskemiddel kan også minimere uspecifik binding (Tween20 anvendes i kinetik buffer fra leverandøren). Selv med minimal uspecifik binding, bør de fleste analyser omfatte mindst én kontrol sensor uden immobiliseret protein, men med den højeste koncentration af bindende partner i foreningen trin (se figur 3, sensor-H); subtraktion af den resterende ikke-specifik binding (og dens forfald i løbet af dissociation trin) kan forbedre kinetiske analyser for den specifikke binding / dissociation blive undersøgt. På den anden side, når første analyser bekræfter, at det biotinylerede protein forbliver stabilt bundet efter indlæses trin (se figur 3, sensor G), kan denne kontrol udelades, og denne sensor kan anvendes til en prøve tilstand.

Til robust bestemmelse af associerings-og dissociationshastighedskonstanter hjælp BLI, flere koncentrationer af bBINDENDE partner bør anvendes, og alle data spor skal passe med den globale analyse, hvis det er muligt (som i figur 3 og 4). Ideelt set bør koncentrationsområde span ~ 10-fold over og under den estimerede K _D. I vores tilfælde, med en høj affinitet interaktion (K _D = 0,25 nM), signal-til-støj var dårlig for bindingskinetik med sub-K _D koncentrationer. Således blev koncentrationer af bindingspartner over K _D anvendes således, at væsentlige ændringer i observerede tal og niveauer af binding blev opnået (se figur 3). Desuden blev en lang dissociation trin bruges til at forbedre tilliden til montering af langsom dissociationshastighed. Med høje affinitetsvekselvirkning, er det også muligt, at langsom dissociation overdrevet genbinding under dissociation trin, da BLI assays er udført i en omrørt prøve snarere end fortsat strømning over sensoren, som for SPR. Dette potentiale artefakt kan testes med såsiger hvor dissociation buffer indeholder en "vask" af overskydende konkurrencedygtig protein, der binder dissocieret bindingspartner og forhindrer det genbinding til sensoren-immobiliserede protein ^14. I vores system, blev dette gjort ved at sammenligne resultater med og uden nonbiotinylated (> 10 gange over K _D) i dissociation godt, og vi bekræftede, at gentilknytningsangreb ikke var et væsentligt problem ^8. Endelig, hvis sæt af kinetiske resultater ikke passer godt af den globale analyse (1:1 eller 2:01 modeller til rådighed), er der andre analysemuligheder til fejlfinding. For eksempel, i stedet for at vælge "Global (Full)" (i trin 4.2), "Local" kan vælges til at passe hver sensor spor uafhængigt. Hvis binding følger en simpel 01:01 model plotte de observerede bindende satser (k _obs) vs koncentrationerne af bindingspartner skal vise en lineær afhængighed med hældningen lig med den anden rækkefølge, iboende bindende hastighed. Fanen af ​​softwaren Analysis har en "XYgraf "vindue, der giver mulighed for hurtig visualisering af dette forhold.

En begrænsning af det instrument, som vi brugte er den tilgængelige temperaturområde. Med en rækkevidde på 2 ° C over den omgivende temperatur til 40 º C, kan kun molekyler, der er stabil i dette område anvendes. Desuden er termodynamisk analysen begrænset af det snævre temperaturområde. En anden generel begrænsning er, at den maksimale assay tid er ~ 4 timer, efter dette, artefakter udvikle på grund af fordampning af prøver fra det åbne mikrotiterplade.

BLI indebærer en forholdsvis enkel indretning i forhold til SPR. Sensorerne flyttes mellem søjler af brønde med faste mængder, snarere end en konstant strøm af prøve gennem sensoren. Selvom det ikke er så følsomt som SPR er BLI mindre påvirket af ændringer i brydningsindeks på grund af ændringer i prøven sammensætning. Samlet set med denne relative brugervenlighed og fleksibilitet af instrumentet i skiftende mellem assaybetingelser BLI giversa alsidigt værktøj til in vitro assays af biomolekylære interaktioner.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Octet-RED96	Pall/FortéBio	30-5048
Bovine Serum Albumin	Sigma	A6003-10G	Fatty Acid free
Biosensor/Streptavidin	Pall/FortéBio	18-5019	Tray of 96 sensors
Microtiter plate	Greiner Bio-one	655209	Black, Polypropylene
Data Acquisition software	Pall/FortéBio	Version 6.4	Newer versions available
Data Analysis software	Pall/FortéBio	Version 6.4	Newer versions available