Abstract
זה חיוני כדי לזהות זיהום ציטומגלווירוס (CMV) במערכת העיכול (GI) בדרכי של חולי immunosuppressed, בהתחשב בסיכון גבוה יותר שלהם לפיתוח זיהום חמור. שיטות מעבדה רבות לזיהוי של זיהום CMV פותחו, כולל סרולוגיה, תרבות נגיפית, ושיטות מולקולריות. לעתים קרובות, שיטות אלו משקפות את מעורבות מערכתית עם CMV ולא באופן ספציפי לזהות מעורבות רקמות מקומית. לכן, זיהוי של זיהום CMV במערכת העיכול הוא לעתים קרובות נעשה על ידי היסטולוגיה המסורתית של רקמת ביופסיה. מכתים Hematoxylin ו eosin (H & E) בשיתוף עם אימונוהיסטוכימיה (IHC) נשאר מעמודי התווך של בדיקת ביופסיה אלה. H & E וIHC לפעמים לגרום לדפוסי מכתים לא טיפוסיים (דו משמעיים), מה שהופך את הפרשנות קשה. זה היה הראה כי תגובת שרשרת של פולימראז כמותית (qPCR) לCMV יכולה להתבצע בהצלחה על, רקמת ביופסיה (FFPE) מוטבע פרפין קבוע פורמלין למאודרגישות גבוהה וספציפיות. המטרה של פרוטוקול זה היא להדגים כיצד לבצע בדיקות qPCR לגילוי CMV ברקמת הביופסיה FFPE במעבדת הגדרה קלינית. שיטה זו עשויה להיות יתרון גדול עבור חולים במקרים של כתמים חד משמעיים לCMV בביופסיות במערכת העיכול.
Introduction
הפרשנות של זיהום ציטומגלווירוס (CMV) בדגימות קליניות חשובה באופן קריטי. CMV הוא חבר בתת משפחת betaherpesvirinae של הרפס. דומה להרפס אחר, יש CMV היכולת להקים זיהום מתמשך או סמוי מאופיינת בחוסר השכפול נגיפי פעיל 1. הפעלה מחדש של נגיף עלולה להתרחש בזמנים של לחץ או דיכוי חיסוני אחר, מה שמוביל לשכפול נגיפי פעיל מאופיין בשחרור virion, אשר עשוי להיות מלווה בגילויי מחלה 2-4. במערכת העיכול (GI) תסמיני המחלה CMV בתדירות גבוהה כוללים כאבי בטן ו / או צואה דמה 1.
האבחנה של גסטרואנטריטיס CMV ידי היסטולוגיה מנצלת hematoxylin ו eosin (H & E) לזהות תכלילים נגיפיים CMV. במקרים בהם חשד קליני גבוהה עדיין אין תכלילים ברורים הם נצפו, אימונוהיסטוכימיה (IHC) משמשת לעתים קרובות כשיטת בדיקה נלווית. עם זאת, IHCיכול גם להיות הקשתה על ידי דפוסים נדירים לא קלאסיים המופיעים כתמים סלולריים (דו משמעיים), מה שהופך את הפרשנות קשה (איור 2) 5. הוא ביקש להשתמש DNA שנלקח קבוע פורמלין, פרפין, מוטבע (FFPE) רקמת ביופסיה במערכת העיכול ותגובה הכמותית פולימראז שרשרת (qPCR) כדי לזהות CMV בביופסיות במערכת העיכול. טכניקה זו הוכח להיות בעל ערך בזיהוי של CMV בביופסיות במערכת העיכול, ומועילה במיוחד במקרים מכתים IHC המשמעיים 5,6. כמו כן, qPCR גם הוכח לתאם גם עם נתוני בדיקה נוספים קליניים CMV כאשר הוא זמין 6. שימוש בqPCR באיתור CMV עלול להוביל לאבחון מוקדם וטיפול במקרים בהם חשד קליני לCMV הוא גבוה, אבל H & E ו-CMV IHC הוא שליליים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
עם אישורו של דירקטוריון סקירה המוסדי, חיפוש של מסד הנתונים מעבדה האלקטרוני בוצע לזהות קבוע פורמלין, פרפין המוטבע בלוקים (FFPE) המייצגים מקרים של זיהום ציטומגלווירוס (CMV) במערכת עיכול ביופסיות (GI) שאובחנו על ידי histopathology (hematoxylin ו eosin (H & E) ו / או אימונוהיסטוכימיה (IHC)).
1. עיבוד רקמות מרקמות FFPE GI ביופסיה
- לאסוף בלוקים רקמת הביופסיה FFPE GI לציטומגלווירוס (CMV) תגובת שרשרת של פולימראז כמותית (qPCR). בלוקים אלה מאוחסנים בטמפרטורת חדר.
- צינורות microfuge 1.7 מיליליטר מראש תווית עם מספר זיהוי הייחודי של הבלוק.
- נעל את Handwheel microtome.
- סיאט גוש הרקמה לתוך מהדק הקלטת.
- באמצעות סכין טרי, שאינו בשימוש, ויישר את הבלוק לזווית הסכין על microtome.
- התאם את microtome לחתוך 10 מיקרומטר חלקים עבים.
- נעילת הHandwheel דואר ומראש לחסום כיוון הלהב.
- לחתוך 5 סעיפים של הבלוק ב10 מיקרומטר מרווחים עבים, המאפשר לכל חתך לגלגל לגלילה של רקמה. ודא כי כל מגילה מכילה ייצוג נאות של רקמות ביופסיה הרצויות.
- נעל את Handwheel microtome.
- עם מלקחיים, למקם את כל 5 המגילות של רקמה לתוך צינור צנטריפוגות מראש שכותרתו, נזהר רק לתפעל את המגילה על ידי פרפין על מנת להפחית את הפוטנציאל לזיהום לחצות. הצמד את הכובע על הצינור ומניח אותו בחזרה על המדף.
- להסיר את חסימת הרקמה מmicrotome.
- להסיר ולסלק את הלהב.
- לטהר כל משטחים או מכשירים שייתכן שבאים במגע עם הרקמה הקודמת.
- הנח להב טרי, שאינו בשימוש לתוך מחזיק הסכין.
- חזור על שלבים 1.4-1.14 עבור כל בלוק נוסף לעיבוד. צינורות microfuge המכילים את מגילות הרקמה עשויים להיות מאוחסנים בטמפרטורת חדר עד timדואר של מיצוי DNA.
2. מיצוי DNA ממגילות של רקמות FFPE GI ביופסיה
הערה: פרוטוקול זה מותאם מהעלון של ערכת FFPE רקמת DNA חילוץ (זהירות: מתייחס לגיליון בטיחות חומרים (MSDS)).
- הוספת קסילן 1 מיליליטר (זהירות: עיין MSDS) לכל דגימת צינור microfuge. סגור את המכסה והמערבולת במרץ ל10 שניות.
- להמשיך במיצוי DNA באופן ספציפי שתואר בעלון המוצר של היצרן בשינויים הבאים.
- להוסיף ראשון 6 μl של הבקרה הפנימית (IC) על צינור אחד microfuge.
- לאחר הדגירה ATL / proteinase K תמוגה ב56 מעלות צלזיוס במשך שעה 1, לדגור על 99 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, ולא 90 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
- במהלך שלב elution DNA הסופי, לפתוח בזהירות את המכסה של עמודת טיהור DNA ולהחיל 50 μl DNAse / מים RNase ללא מזוקקים במרכזו של הקרום, ולא buffer-ATE.
הערה: עיין בעלון לאחסון וההכנה של חומרים כימיים המתאימים. ה-DNA צריכה להיות מופק מכל 5 מגילות FFPE. לבצע את כל שלבי צנטריפוגה בטמפרטורת חדר (15-25 ° C).
3. QPCR לCMV
- תגובת שרשרת פולימרז נוהל (PCR)
- ליצור גיליון עבודה של Excel PCR לטווח assay CMV. גיליון עבודה של Excel זו מחשבת את הסכום הכולל של כל אחד מגיב הדרוש כדי להפוך את תערובת ההורים עם Mg. זה מכפיל את הכמות של כל אחד מגיב זקוקה לדגימה (מפורט בהמשך) פעמים מספר הדגימות והבקרה ועוד אחד (כדי לפצות על אובדן בשל pipetting).
- כוללים את ריאגנטים הבאים בכל תגובת PCR בסכום שצוינו:
מגיב0; הסכום לדוגמה
12.5 μl בקבוקון תערובת ההורים LC-CMV
2.5 μl בקבוקון הצהוב פתרון מ"ג
נפח כולל 15.0 μl
- כוללים את ריאגנטים הבאים בכל תגובת PCR בסכום שצוינו:
- לכלול בכל assay, המנוהל על מים או אין שליטת יעד (NTC), ביקורת שלילית, ביקורת חיובית נמוכה, בקרה חיובית גבוהה, וגם QS3 או QS4, וכל דגימות המטופל. יש להגדיר את נימי הדם בצו זה.
- השג ספציפי בלוק הקירור למכשיר ה-PCR בזמן אמת שמאוחסן ב 4 ° C. מניחים את צינורות נימים המתאימים בבלוק הקירור. אל תיגע במשטח של צינורות נימים. תמיד להשתמש בכפפות בעת הטיפול בנימי הדם.
- הגדר את כל תגובות שרשרת פולימראז במכסת מנוע נקייה אינו מזוהם בproduc ההגברהts.
- הסר את המספר הנכון של בקבוקוני הורים מערכת PCR כדי לבדוק את כל הדגימות החולים, בתוספת 5 פקדים. בואו בקבוקוני ההורים, פתרון Mg, והפשרת מים כיתה PCR בבלוק הקירור. כל בקבוקון אדון מכיל מספיק חומרים כימיים ל12 בדיקות.
- בעדינות מערבולת בקבוקוני האדון ומהיר לסובב אותם בצנטריפוגה במהירות המרבית.
- לשלב את התוכן של כל בקבוקון אדון לבקבוקון אחד, ובעדינות מערבולת שוב.
- מערבבים את תערובת ההורים ופתרון Mg בכמויות שצוינו בגיליון עבודת PCR לתוך צינור microfuge סטרילי אחת.
- מערבבים בעדינות וaliquot 15 μl תמהיל הורים עם Mg לתוך כל צינור נימים, למעט הנימים בעמדה 5 שהינה על רמת quantitation (QS).
- הזז את בלוק הקירור המכיל את צינורות נימים ושילוב הורים עם Mg ממכסת המנוע הנקי למכסת מנוע עיבוד.
- הוסף 2 μl של בקרה פנימית (IC) ל30 μl הנותר של אמןלערבב עם Mg. מערבבים בעדינות וaliquot 15 μl לתוך הנימים בעמדה 5 (עמדה לQS).
- פיפטה 10 μl מים, לשלוט DNA, או דנ"א מדגם לתוך צינור הנימים המתאים. מכסה את צינורות נימים באמצעות כלי מכסת.
- קח קירור בלוק / דגימות למכשיר ה-PCR בזמן אמת.
- ליצור גיליון עבודה של Excel PCR לטווח assay CMV. גיליון עבודה של Excel זו מחשבת את הסכום הכולל של כל אחד מגיב הדרוש כדי להפוך את תערובת ההורים עם Mg. זה מכפיל את הכמות של כל אחד מגיב זקוקה לדגימה (מפורט בהמשך) פעמים מספר הדגימות והבקרה ועוד אחד (כדי לפצות על אובדן בשל pipetting).
- לתכנת בזמן אמת PCR המכשיר (ראה טבלה 1)
- הגברה והאיתור שבוצעו על מכשיר ה-PCR בזמן אמת
- להתחבר למחשב
- לחץ לחיצה כפולה על סמל המכשיר ולהיכנס לתוכנה.
- הפעל את המכשיר בזמן אמת PCR
- לחץ על "CMV / EBV" מהמסך הקדמי.
- בצע את ההנחיות של אשף המאקרו.
- בחר בתיבה כדי להפעיל בדיקה עצמית כאשר תתבקש לעשות זאת על ידי התוכנה. בדיקה עצמית יש לבצע פעם אחת בכל יום המכשיר נמצא בשימוש.
- שם הארוך.
- התאם את ספירת המדגם ממוקמת בLEF העליוןהפינה לא של הדף לסכום של בקרות וחולים שנכללה בריצה והזן את מספר זיהוי של כל דגימת חולה.
- לחץ על הלשונית "אבס קוואנט".
- תחת "סוג לדוגמא", להקצות את סוג הדגימה המתאים לסטנדרט.
- הקלד בריכוזים הצפויים לסטנדרטי quantitation (QS).
- הסר את צינורות נימים מהגוש הקריר ומניח אותם למצב המקביל בקרוסלה (קירור מדגם # 1 בלוק צריך להיות ממוקם בעמדת המס '1 על הקרוסלה, וכו').
- הנח את הקרוסלה לתחילת צנטריפוגות והעיתונות של המכשיר.
- פתח צנטריפוגות ולהסיר את הקרוסלה.
- הנח את הקרוסלה למכשיר ה-PCR בזמן אמת. סגור את המכסה.
- לחץ על "התחל הפעלה".
- מכשיר ה-PCR בזמן אמת יבדוק כל עמדה למדגם. לא להתרחק מהמכשיר עד סימון זו הושלם, ובייחודcially אם אחד מנימי הדם לא נמצא בקרוסלה. המכשיר יהיה לציין זאת ולשאול אם הריצה היא להמשך יבוא. לענות בחיוב לפני שעזבתי.
- לאחר הריצה תושלם, סגור את הדו"ח שנוצר.
- לחץ על "המוחלט Quantitation".
- לחץ על החץ שליד צבע פיצויים.
- לחץ על "בחר צבע פיצוי" מהתיבה הנפתחת.
- בחר את קובץ פיצוי צבע העדכני ביותר לפנות לריצה.
- לחץ על אישור כאשר התיבה יצוץ.
- לחץ על החץ בתקן Curve.
- בחר באפשרות "שימוש חיצוני" מהתפריט הנפתח.
- בחר את קובץ עקומת סטנדרט החיצוני העדכנית ביותר, ולאחר מכן לחץ על אישור.
- תסתכל על כל עקומה תחת התפריט המוחלט כימות כדי להבטיח שעקומות נמצאות ולא קו ישר, אם ריכוז מוקצה. כימות מוחלטת ל530 705/Back הוא ניתח באופן אוטומטי.
- Quשליטת ality
- ליצור עקומת סטנדרט חדשה בכל פעם שמספר הרבה חדש של חומרים כימיים הוא קיבל, או כל שישה חודשים, לפי תכוף יותר.
- הוסף 10 μl של כל תקן לתערובת ההורים עם Mg. קחו למשל את הסטנדרטים כלולים בערכה ה-DNA שחולצה בעבר.
- הוסף 1 μl של בקרה פנימית עבור כל תקן לתערובת ההורים עם Mg שימוש בתהליך יצירת העקומה סטנדרטית כדי להבטיח quantitation מדויק. אל תוסיף IC לתערובת ההורים עם Mg לשום תבנית הבקרה (NTC).
- הכן NTC ושלושה משכפל של Quantitation התקנים 4 QS, 3, 2, 1, ודילול של 1:10 QS4 לריצה כדי ליצור את עקומת הסטנדרט, בהיקף ב16 נקודות נתונים.
- בחר באפשרות "לשכפל של" בתפריט הנפתח לסטנדרטים חוזרים ונשנים
- בחר אף 530/back ערוץ ולהדליק פיצוי צבע בעת ניתוח הארוך,
- תחת "Curve הרגיל (בהפעלה)", בחר "שמירה בשם לשעברשלהן פנימי "ושם העקום. הזן את התגובה "מיושמת כעקומת סטנדרט" בעת שמירה.
- גרף התוצאות. מקדם ליניאריות וכתוצאה מכך יש ≥ 0.81.
- לריצות יומיות, כולל עותק אחד של QS3 או QS4 כשליטה בריצה. עקומת הסטנדרט החיצונית הנוכחית עשויה להיות מיובאת לתוך הריצה בשלב הניתוח.
- הפעלת פקדים: אין שליטת DNA, בקרה שלילית, נמוכה, ובקרות חיוביות גבוהות. עומס נגיפי צפוי נקבע ומותאם לכל ספק ומספר הרבה.
- הוספת IC לכל דגימה ולשלוט במיצוי DNA.
- אם כל אחד מהפקדים נופל מחוץ לטווח, רשום את התוצאות בלתי מתקבלות על הדעת ולהתייחס assay לפתרון בעיות.
- תדר של בקרות
- לכלול בכל ריצה: NTC, ביקורת שלילית, נמוכה חיובית, גבוהה חיובית, וסטנדרטית.
הערה: גבולות מקובלים לבקרות. אין פסגות יש להתבונןד לשום תבנית (NTC) ופקדים שליליים. פסגות צריכה להיות נוכחים בערוץ 530 ועומס נגיפי צפוי נקבעים ומותאם לכל ספק ומספר הרבה לבקרות חיוביות נמוכות וגבוהות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כולל של 228 לוקי רקמות נבדקו על ידי תגובה כמותית פולימראז שרשרת (qPCR), שהיה מורכבת מ91 ציטומגלווירוס (CMV) מקרים חיוביים המבוססות על היסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה החיובית (IHC), 18 עם דו משמעי CMV IHC, ו79 פקדים שליליים. כפי שמודגם באיור 2, במקרים חיוביים CMV היו הפגינו תכלילים טיפוסיים CMV נגיפיים (א) ו / או כתמים חיוביים IHC (ב '). מקרים דו משמעיים היו הפגינו דפוסים נדירים, לא קלאסיים המופיעים כתמים (C), ואילו בקרות שליליות היינו לא הראו היסטולוגיה חשודה או צביעת IHC 5.
91 ביופסיות חיוביות עבור CMV ידי histopathology, 88 היו חיוביים על ידי qPCR (טבלה 2). עם הגדרה חיובית אמיתית המבוססת על היסטולוגיה המסורתית, כלומר תכלילים טיפוסיים CMV נגיפיים ו / או אופייני CMV IHC, נתונים אלה הביאו לרגישות של 96.7%.
ארבעה עשר של 18 ביופסיות (78%) עם כתמי CMV IHC משמעיים נבדקו חיוביים עבור CMV ידי qPCR 5. בין 18 מקרים דו משמעיים אלה, עשר היו ביופסיות נוספות שצולמו באותו היום שהיו חיוביים ל-CMV ידי histopathology. בין 14 דגימות חיוביות אלה qPCR, 10 היו ביופסיות שנלקחו באותו היום שהיו חיוביים ל-CMV בhistopathology. של 18 הביופסיות משמעיות שנבדקו, 11 היו מידע קליני נוסף לגבי בדיקת CMV בדגימות אחרות שהוגשו בבית או בתוך 7 ימים מהזמן הביופסיה נלקחה. בין 11 מקרים אלה, 8 (73%) נמצאו חיוביים לCMV ידי qPCR. של 11 ביופסיות אלה, 5 (45%) נמצאו חיוביים על ידי qPCR עם דגימות CMV חיוביות נוספות; 3 (27%) נבדקו להניחive ידי qPCR ללא דגימות CMV חיוביות; 3 (27%) שנבדקו שליליים על ידי qPCR עם דגימות CMV שליליות נוספות.
בנוסף לאלה מחקרים שהוזכרו לעיל, היה זה עניין כדי לקבוע האם רמות נוספות קבלת hematoxylin ו eosin (H & E) תהיה מועילות במקרים בהם אין תכלילים נגיפיים נראים על H & E בתחילה וCMV IHC הוא דו משמעי. לכן, פעמים H & E רמות 5 לכל אחד מהגושים 18 עם דו משמעי CMV IHC בוצעו. שני פתולוגים לבחון בזהירות במקרים אלה ולא הצליחו לזהות תכלילים נגיפיים ניכרים על כל שקופיות נוספות (מידע לא מוצג).
| פרמטרים תגובת השרשרת של פולימראז בזמן אמת הציעו | ||||||
| קריאת הגדרה: | ||||||
| ערוץ ברירת מחדל | חפש טמפרטורה | מקסימום חפש ממוצע סוג המכשיר | גודל נימים | |||
| 530 | 30 מעלות צלזיוס | 12 | 6 ערוץ | 20 μl | ||
| שם תכנית: הפעלה של אנזים | ||||||
| מספר המחזורים: 1 | ||||||
| מצב ניתוח: אין | ||||||
| יעד ° C | החזק hh: mm: ss | רמפת דרג | שניות יעד | שלב גודל | שלב עיכוב | מצב רכישה |
| 95 | 0:10:00 | 20 | 0 | 0 | 0 | אף לא אחד |
| שם תכנית: לנחות צעד | ||||||
| מספר המחזורים: 10 | ||||||
| מצב ניתוח: אין | ||||||
| יעד ° C | החזק hh: mm: ss | אילדרג p | שניות יעד | שלב גודל | שלב עיכוב | מצב רכישה |
| 95 | 00:00:05 | 20 | 0 | 0 | 0 | אף לא אחד |
| 65 | 00:00:20 | 20 | 55 | 1 | 1 | אף לא אחד |
| 72 | 00:00:15 | 20 | 0 | 0 | 0 | אף לא אחד |
| שם תכנית: הגברה של ה-DNA | ||||||
| מספר המחזורים: 40 | ||||||
| מצב ניתוח: Quantitation | ||||||
| יעד ° C | החזק hh: mm: ss | רמפת דרג | שניות יעד | שלב גודל | שלב עיכוב | מצב רכישה |
| 95 | 00:00:05 | 20 | 0 | 0 | 0 | אף לא אחד |
| 55 | 00:00:20 | 20 | 0 | 0 | 0 | אחד |
| 72 | 00:00:15 | 10 | 0 | 0 | 0 | אף לא אחד |
| שם תכנית: קירור | ||||||
| מספר המחזורים: 1 | ||||||
| מצב ניתוח: אין | ||||||
| יעד ° C | החזק hh: mm: ss | רמפת דרג | שניות יעד | שלב גודל | שלב עיכוב | מצב רכישה |
| 40 | 00:00:30 | 20 | 0 | 0 | 0 | אף לא אחד |
טבלת 1. יש להשתמש בפרמטרים המופיעים כקו מנחה לטמפרטורות היעד, מספרי מחזור, ואורכי מחזור בהגדרה של תגובת שרשרת של פולימראז בזמן אמת לאיתור cytomegalovi rus ב, ביופסיות עיכול מוטבע פרפין קבוע פורמלין. עשויים פרמטרים אלה דורשים אופטימיזציה בהתאם לדגם המכשיר והיצרן.
| מקרים חיוביים היסטולוגיה | מארזי ה-PCR חיובי | רגישות | מקרים שליליים היסטולוגיה | מקרים שליליים PCR | Specitivity |
| 91 | 88 | 96.7% | 79 | 78 | 98.7% |
טבלה 2. רגישות (96.7%) וסגוליות (98.7%) של תגובת שרשרת של פולימראז בזמן אמת (qPCR) באיתור ציטומגלווירוס ב, ביופסיות עיכול מוטבע פרפין קבוע פורמלין. טבלה זו שונה ממקוי ואח' 5.
"Width =" es/ftp_upload/51570/51570fig1highres.jpg 400 "/>
איור 1. Microtome טיפוסי עם גוש הרקמה יושב בצורה נכונה במהדק הקלטת) כסעיף עבה 10 מיקרון של רקמת הביופסיה לחתוך אותו מותר לגלגל לגלילה ב '), אשר הועבר לC צינור microfuge). כל חמש המגילות של רקמת ביופסיה ממוקמות בצינור microfuge יחיד למיצוי DNA.
Hematoxylin איור 2.) ו eosin סעיף מוכתם של ביופסיה מעי גס מראה תכלילים CMV בשפע, טיפוסיים כפי שצוין על ידי חצים (400X ההגדלה המקורי). B) ביופסיה מעי גס מוכתמת עם נוגדן חד שבטי כנגד CMV מראה את דפוס צביעת IHC הצפוי (מקורי 400X הגדלה).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטות מעבדה רבות זמינות עבור האבחנה של זיהום ציטומגלווירוס (CMV), כולל סרולוגיה, תרבות נגיפית, מבחני ירמיה מולקולריים, היסטולוגיה של חומר ביופסיה, וכפי שהוכיח לאחרונה מבחני, מולקולריים של, ביופסיה קבועה פורמלין פרפין, מוטבע (FFPE) 5,6 רקמות. סרולוגיה, ברגע שעמוד תווך של אבחנה, רק באופן מהימן מזהה חשיפה ואינה תואמים היטב עם זיהום CMV אקוטי 7. תרבות ויראלי, קונבנציונלית ובקבוקון פגז אנטיגן מוקדם, הקשו על ידי פעמים assay ממושכות, במקרה טוב 2-3 ימים במקרה של 8 האחרונים. מבחני ירמיה מולקולריים פותחו, ביותר שיש את היתרון של להיות כמוני עם הפוטנציאל ליעילות טיפול ניטור 9-11. למרבה הצער, כאשר יש חשש קליני למעורבות מקומית של מערכת העיכול (GI) בדרכי, מבחני ירמיה משקפים מעורבות מערכתית ולא באופן ספציפי לזהות זיהום מקומי. לכן, histology כבר את תקן הזהב לזיהוי זיהום CMV של מערכת העיכול.
זה חיוני כדי לזהות זיהומים פעילים CMV מערכת העיכול בחולי immunosuppressed, כגון אלה עם HIV / איידס, בכימותרפיה, או איבר / השתלות מוח עצם, בהתחשב בסיכון גבוה יותר שלהם לפיתוח זיהום חמור. עוד נמסר תגובת שרשרת של פולימראז כמותית (qPCR) היא שיטה רגישה והספציפית ביותר לגילוי CMV בביופסיות במערכת העיכול 5. תוצאות דומות נתמכות על ידי מחקרים אחרים 6.
למרות שכל השלבים לאורך כל ההליך הם חשובים, יש כמה שלבים קריטיים מפתח שראוי להתחשבות מיוחדת. במהלך עיבוד רקמות על microtome, קיים הכרח הלהב לפעול בין כל דגימה כדי לצמצם את האפשרות של זיהום צולב בין דגימות. באופן דומה, טיהור של אזורים על microtome הרקמות עשויות לבוא במגע עם שימוש rec שואב מתאיםommended ידי יצרן microtome יהיה גם להפחית את הסיכון הזה.
צעד מרכזי נוסף במהלך הפרוטוקול הוא התוספת של הבקרה הפנימית IC (שלב 2.3) למדגם במהלך מיצוי DNA, אשר משמש כשליטה לשני את תהליך החילוץ והגברה. ההגברה זיהוי של IC אינה מפריעות להגברה של CMV, כי גילוי של נגיף CMV מתרחש בערוץ 530, בעוד שזיהוי של IC מתרחש בערוץ 705. כל מעבדה לקבוע טווח מקובל לIC. לאחר חילוץ, באיכות ה-DNA לא צריך להיות מוערכת. במילים אחרות, קביעת spectrophotometric של ריכוז ה-DNA היא לא מבוצעת באופן שיגרתי לאחר בידוד ה-DNA. אם הוסיף קודם למיצוי DNA, IC פועל כבקרה לתהליך החילוץ. לחלופין, 1 μl של IC ניתן להוסיף לכל תערובת הורים עם בקבוקון Mg. אם הוסיף לתערובת ההורים עם Mg, IC פועל רק כג הגברהontrol.
זה גם הכרחי כי במהלך ההקמה של כל תגובות qPCR שמכסה מנוע נקי (כולל טפטפות וטיפים) לשמש להקים מגיב. מכסה המנוע הזה לא צריך שום מוצרי הגברה, כלומר הודעה בזמן אמת או PCR הקונבנציונלי, מניפולציות בתוכו. מוצרי הגברה אלה יכולים להפוך לתרסיס ולזהם תגובות מוכנות לאחר מכן qPCR מובילות לתוצאות חיוביות כוזבות. מעבדות רבות אפילו ללכת רחוק ככל ברדסים וציוד מייעדים לpipetting ריאגנטים חומצה ללא גרעין ומכסה מנוע שני וציוד להוספת מדגם ולשלוט בחומצות גרעין. מעבדות אדם חייבים להחליט מה עובד הכי טוב שניתנו אילוצי המקום האישיים שלהם.
פתרון בעיות תוצאות בלתי צפויות ייתכן שתהיה צורך במהלך ההליך. אם אין עדויות להגברה של IC (קו כלומר שטוח) של מדגם, מומלץ קודם כל לחזור על תגובת qPCR מextracti-DNA המקוריעל מנת להבטיח שגיאת pipetting לא להתרחש במהלך מדגם הכנת תגובה. אם IC נשאר בקו ישר על התגובה החוזרת ויש רקמת ביופסיה מספיק הנותרת, מיצוי DNA שני עשוי שבוצע, להיות מודע כדי להוסיף IC במהלך תהליך החילוץ. אם דגימה-מופק מחדש זה גם מדגימה קו שטוח IC, סביר להניח שיש מעכב תגובה נוכחי בתוך הדגימה המקורית. במקרה זה, תוצאת הבדיקה תהיה בלתי מוגדרת לצורך זיהוי של CMV מאז שליטת תגובת qPCR לא בצעה כראוי.
אם המים, אין שליטת יעד (NTC) מדגים הגברה של היעד, מומלץ תחילה לנתח את השיעור החיובי של הריצה. אם יש הריצה גבוהה יותר מאשר שיעור חיובי נורמלי, זה יהיה מומלץ לבצע בדיקות לסחוב של אזורים שבם כל מניפולציה מגיב מבוצעת כדי לזהות כל זיהום סביבתי פוטנציאלי. אם הזיהום סביבתי הוא לשלול, השתמשבקרת מים חדש שנפתחה יחד עם הבקרות חיוביות הרגילות. אם בקרת המים החדשים שנפתחה לא מוצגת מוצר הגברה, סביר להניח השליטה הקודמת המים הייתה מזוהמת ברצף היעד. עם זאת, אם בקרת מים חדשה זו היא מזוהמת שוב, זה מעלה את האפשרות של כל חומרים כימיים או ברדסים להיות מזוהמים עם רצף יעד או כל. במקרה זה, זה יהיה הכי טוב כדי לטהר את כל הברדסים המשמשים בתהליך ולאחר מכן להשתמש בכל חומרים כימיים החדשים בניהול מערך חדש של פקדים (חיובי ומים). אם הבעיה נמשכת, בחינה מחודשת של זרימת העבודה בתחומי העיבוד והברדסים, כמו גם פנייה ליצרני המוצרים צריך להיעשות.
אם תקני האיכות (QS) כלולים במנוסה לא להדגים את מספר העותק המתאים במהלך הגברה, מומלץ קודם כל להפעיל את כל QS (4, 3, 2, 1, ודילול 1:10 של QS4). אם סטנדרטים אלה נופלים בתוך הטווחים המתאימים, ואז לחזורהדגימות שצוינו כבעבר עם הבקרות המתאימות. אם QS לא נופל בתוך הטווחים המתאימים, ולאחר מכן ליצור עקומת סטנדרט חדשה כמתואר בסעיף בקרת איכות של הפרוטוקול (3.4). אם הבעיה נמשכת, יצירת עקומת סטנדרט חדשה עם QS חדש שנפתח בהווה או במספר הרבה חדשים עשויים להיות ניסיון. אם צעדים אלה לא יצלחו, לפנות ליצרן יהיה מוצדק.
למרות הרגישות והסגוליות של qPCR לגילוי CMV בביופסיות במערכת העיכול המבוסס על חישובים תוך שימוש בשיטות קונבנציונליות (H & E וIHC) כתקן זהב לא להפגין באופן מיידי יתרון אבחון, תוך שימוש בשיטת qPCR יותר אנליטית רגישה כמו הזהב הסטנדרטי משפר באופן משמעותי אלה חישובים 5. בנוסף, 14 (78%) של 18 ביופסיות משמעיות נבדקו חיוביים עבור CMV ידי qPCR במחקר זה. הוא הרגיש שנקודות אלה תומכים ברעיון כי qPCR הוא הרבה יותר רגיש מאשר או H &E לבדו, או בשילוב עם IHC גילוי CMV בחומר ביופסיה במערכת העיכול. בנוסף, במקרים עם דפוסי מכתים IHC דו משמעיים, השגת רמות נוספות לא סביר שיהיה של כל ערך מוסף בהשוואה לשיטות מקובלות כיום.
יחדיו, qPCR הוא רגיש וספציפי ביותר לגילוי זיהום CMV ברקמת הביופסיה FFPE במערכת העיכול. שימושי במיוחד הוא הביצועים של qPCR בביופסיות במערכת העיכול עם דפוסים דו משמעיים CMV IHC מכתים או קליני חשודים מאוד לCMV. בהשוואה להיסטולוגיה המסורתית, בדיקות qPCR של חומר ביופסיה במערכת העיכול עשויות להקל על אבחון מדויק בפרק זמן קצר, ובכך מובילים למוקדם יותר וניהול יעיל יותר סבלני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מכירים את איימי Thomasson על סיועה בהכנת כתב היד הזה, ופרדריק Skarstedt וריאן כריסטי על מאמציהם בהכנה של דמויות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 ml Microfuge tubes | Costar | 3620 | |
| Serrated forceps | Electron Microscopy Services | 62086-1S | Micro Forceps MF-1 |
| Tabletop centrifuges (microfuge) | Eppendorf | 5424 | |
| Xylene | Fisher | Fisher Scientific: X3P | 1 gallon |
| Ethanol | Fisher | Fisher Scientific: ET108 | 96-100% |
| Microtome | Leica | RM2255 | |
| QIAamp DNA FFPE Tissue Kit | Qiagen | 56404 | |
| artus CMV LightCycler PCR ASR | Qiagen | 4500025 | |
| CMV LC PCR Supplement Kit | Qiagen | 1031873 | |
| LightCycler centrifuge | Roche | 75005087 | |
| LightCycler Cooling Block | Roche | 10800058001 | |
| LightCycler Capping Tool | Roche | 3357317 | |
| Color Compensation Kit | Roche | 2158850 | |
| LightCycler 20 μl Capillaries | Roche | 1 909 339 | |
| Blades | Sakura | Fisher Scientific: 4689 | Accu-Edge low profile |
References
- Hodinka, R. L. Manual of Clnical Microbiology. 2, ASM Press. 1558-1574 (2011).
- Lasry, S., et al. Interstrain variations in the cytomegalovirus (CMV) glycoprotein B gene sequence among CMV-infected children attending six day care centers. The Journal of infectious diseases. 174, 606-609 (1996).
- Murph, J. R., Baron, J. C., Brown, C. K., Ebelhack, C. L., Bale Jr, J. F. The occupational risk of cytomegalovirus infection among day-care providers. JAMA : the journal of the American Medical Association. 265, 603-608 (1991).
- Pass, R. F., et al. Vaccine prevention of maternal cytomegalovirus infection. The New England journal of medicine. 360, 1191-1199 (2009).
- McCoy, M. H., et al. qPCR increases sensitivity to detect cytomegalovirus in paraffin-embedded, formalin-fixed tissue of gastrointestinal biopsies. Human Pathology. 45, 48-53 (2014).
- Mills, A. M., Guo, F. P., Copland, A. P., Pai, R. K., Pinsky, B. A. A comparison of CMV detection in gastrointestinal mucosal biopsies using immunohistochemistry and PCR performed on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. The American journal of surgical pathology. 37, 995-1000 (2013).
- Krech, U. Complement-fixing antibodies against cytomegalovirus in different parts of the world. Bulletin of the World Health Organization. 49, 103-106 (1973).
- Chou, S. Newer methods for diagnosis of cytomegalovirus infection. Reviews of infectious diseases. 12 Suppl 7, (1990).
- Brytting, M., Xu, W., Wahren, B., Sundqvist, V. A. Cytomegalovirus DNA detection in sera from patients with active cytomegalovirus infections. Journal of clinical microbiology. 30, 1937-1941 (1992).
- Revello, M. G., et al. Human cytomegalovirus in blood of immunocompetent persons during primary infection: prognostic implications for pregnancy. The Journal of infectious diseases. 177, 1170-1175 (1998).
- Shinkai, M., Bozzette, S. A., Powderly, W., Frame, P., Spector, S. A. Utility of urine and leukocyte cultures and plasma DNA polymerase chain reaction for identification of AIDS patients at risk for developing human cytomegalovirus disease. The Journal of infectious diseases. 175, 302-308 (1997).
