Summary
Mätning av osmotiska vatten permeabilitetskoefficienten (P f) av celler kan hjälpa till att förstå de regler hos aquaporiner (AQPs). P f beslutsamhet i sfäriska växtcellprotoplaster som presenteras här innebär protoplaster isolering och numerisk analys av deras initial hastighet på volymförändringar till följd av en osmotisk utmaning under konstant bad perfusion.
Abstract
Studera AQP regleringsmekanismer är avgörande för förståelsen av vattenförbindelser på både cellulära och hela växtnivåer. Presenterad här är en enkel och mycket effektiv metod för bestämning av den osmotiska vatten permeabilitetskoefficienten (P f) i växtprotoplaster, som tillämpas i princip även andra sfäriska celler såsom grodoocyter. Det första steget i analysen är isoleringen av protoplaster från växtvävnaden av intresse genom enzymatisk digerering i en kammare med en lämplig isoton lösning. Det andra steget består av en osmotisk utmaning analys: protoplaster immobiliserade på botten av kammaren utsätts för en konstant perfusion börjar med en isoton lösning och följs av en hypoton lösning. Cell svullnad är video inspelad. I det tredje steget, är bilderna bearbetas offline för att ge volymförändringar, och tidsförloppet av volymförändringar är korrelerad med tidsförloppet av förändringen i osmolahet av kammaren perfusionsmediet, med användning av en kurvanpassningsförfarandet skriven i Matlab (den "PfFit '), för erhållande av Pf.
Introduction
Vattenupptagning och flöde över cellmembran är en grundläggande förutsättning för växt existens både på cellulär och hela växtnivåer. På cellnivå, aquaporiner (AQPs) spelar en viktig roll i regleringen av det osmotiska vatten permeabilitetskoefficienten (P f) i cellmembranet 1-3.
Hittills har flera metoder använts för att mäta den endogena P f av protoplast från olika växtorgan (dvs. rötter, mesophyll, endodermis, osv., Granskats av Chaumont et al. 4). En av de metoder för att mäta P f är att exponera protoplastema till en osmotisk utmaning och att övervaka initial hastighet på sin volymförändring (dvs., Lutningen på den tidiga linjära fasen av volymförändring). Två olika metoder har tidigare beskrivits utifrån detta synsätt, båda baserade på en momentan utbyte av lösningar. Den första en består av immobilizing av protoplast med ett sug mikropipett och omkoppling av vätskeflödet 5 och den andra att överföra protoplast från en lösning till en annan med hjälp av en mikropipett 6. Dessa mikropipett sug och mikropipett överföra metoder, som möjliggör bildtagning genast i början av den snabba lösningen utbyte (att fånga den tidiga linjära fasen av volymförändring), sannolikt innebära en fysisk stress till protoplaster och kräver specialiserad utrustning och expertmikromanipulering.
Den här beskrivna metoden minimerar störning till cellerna, innebär inga mikromanipulering och tillåter härledning av P f när badet perfusionen är inte ögonblicklig.
Efter den enzymatiska nedbrytning, protoplasterna, nedsänkt i en isoton lösning, är immobiliserade på täckglas botten av en plexiglas (aka Lucite eller plexiglas) kammare med laddnings interaktion. Sedan, under ett konstant bad perfusion,den isotonisk lösning spolas bort av en hypoton lösning genererar en hypoosmotisk utmaning protoplastema. Svullnaden av protoplast är video inspelad och sedan, genom att kombinera information om tidsförloppet för badet perfusion och tidsförloppet för cellsvullnad, är P f bestäms genom bildbehandling och kurvanpassningsförfaranden.
Fördelarna med denna metod är att försöket är mycket effektiv, dvs det är möjligt att följa ett fåtal celler samtidigt i en enda analys, och att det inte kräver speciell utrustning eller speciella mikromanipulering färdigheter. Flera tillämpningar för denna metod är möjliga. Till exempel, bestämning av den nativa P f av en mängd celler från olika vävnader och växter, såsom mesophyll och bunta täckceller från Arabidopsis blad 7, majs blad mesophyll eller rot cortexceller 8-10 eller suspensions odlade celler 11,12. I additiden, är det möjligt att bestämma P f av sfäriska djurceller som äggcell celler 11. Ett annat exempel handlar om granskning av AQP aktivitet genom gående uttryck för deras gen i protoplastema (eller andra gener som kan påverka dem, t.ex., gener av kinaser) och fastställande av deras bidrag till P f; till exempel uttryck av tomat AQP SlTIP2, 2 i Arabidopsis mesophyll protoplaster från PEG omvandling och beslutsamhet för SlTIP2, 2 relaterade P f 13. Slutligen undersökning av effekten på P f olika molekyler / ämnen (läkemedel, hormoner, etc.) till de lösningar kan också undersökas, till exempel på AQP blockerare HgCl2 7.
Följande protokoll beskriver isolering av protoplaster av Arabidopsis mesofyllceller och bestämning av deras Pf.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Beredning av lösningar
- Förbered isoton (600 mOsm) och hypoton (500 mOsm) lösningar innehållande 10 mM KCl, 1 mM CaCl2 och 8 M 2 (N-morfolin) -ethanesulphonic syra (MES), pH 5,7 och justera osmolaritet med lämpliga mängder D-sorbitol: 540 mM för isoton och 440 mM för hypoton lösning. Kontrollera osmolaritet lösningen (inom 3% av målvärdet) med hjälp av en osmometer.
- Förbered en torr lager av "enzymatisk mix" som innehåller följande enzymer: 0,55 g cellulas, 0,1 g pectolyase, 0,33 g polyvinylpyrrolidon K 30, 0,33 g BSA (se tabell 1 nedan), blanda det torra pulvret med vortex, gör 5.7 mg alikvoter och lagra vid -20 ° C.
2. Isolering av Arabidopsis mesophyll protoplaster
- Förbered en petriskål (10 cm) med ca 6 droppar (ca. 30 ^ vardera) av isoton lösning.
- Skala abaxial (lägre) Arabidopsis blad epidermis, cut den skalade blad i rutor om cirka 4 x 4 mm 2, sedan placera rutorna på isoton lösning droppar med den exponerade abaxial sidan nedåt, röra lösningen.
- Lös 5,7 mg av enzymet mixen 165 l isoton lösning (3,3% vikt / vikt) i ett 1,5 ml rör, blanda försiktigt genom att pipettera i en minut eller så tills det är upplöst, och placera flera liknande droppar av den enzymatiska lösningen i samma Petri skålen.
- Överför de bladbitar på den enzymatiska lösningen droppar, stänga skålen försegling av locket med en omgång av parafilm och inkubera under 20 min, flytande skålen i ett vattenbad inställt på 28 ° C.
- Lägg flera fler droppar av isoton lösning till skålen (2 droppar per varje enzym lösning droppe). Överför varje blad stycke till en ny isoton lösning droppe, sedan, i tur och ordning, till en andra droppe (att tvätta den enzymatiska lösningen bort). Lyft bit i kanten med hjälp av pincett, skaka den i den andra drop (som en tepåse) för att frigöra protoplastema.Samla dropparna med protoplastema (med användning av en avklipps 100 mikroliter pipettspets) i en 1,5 ml rör.
3. Hypoton Challenge Assay: Arabidopsis mesophyll Cell Svullnad
- Förbered perfusionssystemet (Figur 1A) genom att fylla en kolonn med isotonisk lösning och en annan kolonn med hypoton lösning. Öppna ventilen, låt några lösning flöde (först den hypotona, då den isotoniska) för att fylla slangen hela vägen ner till inloppsgrenröret (Figur 1B). Se till att det inte finns några luftbubblor, och stäng sedan ventilen.
- Täta ett täckglas med användning av silikonfett (tabell 1), för att göra en botten för kammaren inom plexiglas slid (Figur 1B, se också schemat i kammaren i Figur 1C). För att göra kammaren botten (den uppåt vänd exponerade ytan av täckglas i fettring) "klibbiga" för protoplaster, päls detmed styrd laddningsbärande protaminsulfat (1% i vatten; Tabell 1) eller poly-L-lysin (0,1% i vatten; Tabell 1). Sprid detta "lim" över täck med hjälp av en pipett spets, vänta 1-2 min, skölj 3-4 gånger med isotonisk lösning och skaka bort den kvarvarande lösningen.
- Fyll kammaren med den isotoniska lösningen. Sedan, tillsätta en droppe av protoplaster innehållande lösning till kammaren, med användning av en avklipps pipettspets och vänta 3-4 min för protoplasterna sedimenteras. Täck kammaren med ett transparent lock (figur 1D, 1E) vidröra lösningen ytan (undvik att droppa luftbubblor under).
- Placera bilden (försiktigt!) På ett inverterat mikroskop bord, anslut den till perfusionssystemet och pumpen (skydda mot luftbubblor i slangen!) Och slå på isoton lösning flöde för konstant perfusion vid 1 ml / min (högre hastigheter kan användas, upp till 4 ml / min).
- För inspelningvolymförändringar, är ett inverterat mikroskop som används, med en 20X objektiv och med en CCD-kamera som är ansluten till en PC-dator. Använd "CMU 1394 Camera Driver" plugin i ImageJ programvara (se tabell för specifika material för nedladdning adresser dessa två mjukvaru stycken) för att spela in en 60 sek video film av utvalda orörliga protoplaster (förmodligen de som fastnat på botten) med en hastighet av 1 bild / sekund (1 Hz). Starta inspelningen med en 15 sek tvätt av isoton lösning (detta utgör baslinjen), växla till hypoton lösning under 45 sekunder (för att slutföra totalt 60 sekunder från början av perfusion). Spara filmen i TIF-format. OBS: Välj en vy fält med så många celler som möjligt, som uppfyller följande kriterier: sfäriska form och med en väl fokuserad cellkontur som störst omkrets (Figur 2A).
4 Analys av cellvolymförändringar Använda ImageJ
OBS: För att analyseraserie bilder på en svällande cell använder "Image Explorer" och "Protoplast Analyzer" plugins i ImageJ programvara (skriven av Xavier DRAYE) 14. Från och med de valda protoplastema vid sin första tidpunkten, kommer den "Protoplast Analyzer 'plugin upptäcker automatiskt protoplastema kanter (konturer) och beräkna tidsförloppet för sina områden under försöket (plugins finns med PfFit analysprogrammet, nedan) .
- Börja ImageJ. För att öppna filmen, klicka på "Arkiv" på ImageJ panelen och sedan, efter varandra på rullgardinsmenyerna som de utvecklas: "Importera" och sedan "Bild Explorer". Markera den valda filmen, högerklicka på den och sedan vänsterklicka på "Protoplast Analyzer". Bläddra igenom filmen (med hjälp av ett reglage på protoplastbild botten) för att identifiera protoplaster som förblir i stort sett orörliga under experimentet - dessa kommer att analyseras. Tillbaka på första imaGE, med hjälp av musen, rita cirklar (plockade från ImageJ ritverktyg) runt de valda protoplaster (Figur 2B) och klicka på "OK" i tabellen för "Detektionsparametrar 'som visades.
- För att starta protoplastdetekteringsalgoritmen, klicka på "lokal" på protoplast bilden övre panelen, sedan "Process" i rullgardinsmenyn. Undersök de gröna cirklar runt de valda protoplaster (figur 2C) under hela filmen. Spara "Resultat" i en Excel-fil. Quit ImageJ. OBS: Om visas en röd prick (för att indikera en dålig kontur passform - oftast på grund av dålig bildkontrast), kör med olika parametrar.
- För att separera raderna som hör till varje cell (vilket - om två eller flera celler analyserades samtidigt - kommer att sammanflätade, eftersom analysen utförs ruta för ruta), i Excel, sortera sparade data från cell nummer kolumnen ("objekt" ).
- Till DeTermine pixel-till-um omräkningsfaktor för att erhålla det verkliga värdet av P f, knäppa en bild av en mikrometer linjal via samma mål 20X mikroskop. Dra en linje (plockas från ImageJ ritverktyg) längs linjalen bilden och läsa bildpunktsantalet motsvarar linjalen längden på botten av ImageJ huvudpanelen. Konvertera de godtyckliga värden pixelområde i Excel-filen i im 2. Spara områden tidsförloppet (för varje separat cell) som en textfil (två kolumner av siffror endast). OBS: Detta kommer att vara en ingång till volymen lutande "PfFit programmet.
5. Modellering Takt Osmolaritet Förändring i den experimentella avdelningen Använda ImageJ och Matlab Program P f Fit
- Lägg 2 mg xylencyanol (tabell 1, nedan) till 100 ml av isoton lösning (för att framställa den "Indicator Dye").
- Förbered perfusionssystemet (som i 3.1) med indikatorn Dye och icke färgade hypotonic lösning.
- Täta ett täckglas med hjälp av silikonfett på botten av Plexiglas kammaren, sedan försiktigt fylla kammaren med indikatorn Dye, täck den med ett täckglas (som med protoplastema före) och placera den på mikroskop scenen.
- Anslut kammaren till perfusionssystemet och pumpen, och slå på indikatorn Dye flödet för en konstant perfusion vid l ml / min.
- Spela in ett 60 sekunder film med en hastighet av 1 Hz. Starta inspelningen med 15 sekunder av indikator Dye, växla till hypoton lösning under 45 sekunder. Sluta filma. Spola med Indikator Dye (åtminstone i 30 sekunder) och sedan starta en ny film. Upprepa ca 5 - 6 gånger och spara alla filmer
- Använd ImageJ mjukvara för att analysera videobilder av indikatorfärgämnet smittans för att erhålla ett genomsnitt tidsförloppet för skötsmittans.
- Starta ImageJ, klicka på "File" och sedan "Öppna" och bläddra efter filmen. För varje film, dra en 10 pixel bred vertikalrektangel var som helst på 1: a bilden av filmen. Klicka på "Bild" på ImageJ huvudpanelen och sedan på "Crop" i rullgardinsmenyn.
- Rikta in 60 bilder (i 60 sek filmen) i en rad, klicka igen "Bild", sedan på varandra i rullgardinsmenyerna som de utvecklas: "Stacks" och "Gör Montage" (kolumnerna 60, rader 1). Rita en 1 pixel hög horisontell rektangel var som helst längs hela raden av bilder och klicka på "Analysera" i ImageJ huvudpanelen och sedan på "plot profil" i rullgardinsmenyn. OBS: "Rita av Montage" visas fönstret (visas ej), och en lista över transmittans uppgifter kan öppnas från menyn. Varje bild av filmen är representerat i den här listan med 10 genomgångskoefficienten med ursprung i 10 pixel bred rektangel och därmed "tidsbasen" (bilden löpnummer) är 10 gånger längre.
- Kopiera listorna i transmittans daten (en lista per film) till en Excel-fil. Medelvärdet transmittans tidsförlopp som erhållits från flera filmer av indikatorn Dye spolningar. Generera en realtidsbasen genom att multiplicera bildsekvensnummer med 0,1. Spara genomsnitt tidsförloppet (två kolumner) till en textfil. OBS: Före medelvärdes, om så önskas, rita de individuella tidsförlopp för att avvisa eventuella oegentligheter. Se till att filmen innehåller minst fem sista sekund av steady-state transmittans av indikatorn Dye.
- Starta Matlab passningsprogram P f Fit (den "Indikator Fit" panel, figur 3) för att beräkna de olika parametrarna i osmolaritet tidsförloppet. OBS: baserad på de kända initiala och slutliga koncentrationer av lösningen i badet, är tidsförloppet för den förändrade osmotiska koncentrationen av lösningen beräknas utifrån koncentrationen tidsförloppet (beräknat i sin tur från Indikator Dye transmittansen), under förutsättning att det följer samma dynamik somfärgämneskoncentration. P f Fit är ett program för gratis användning. Den "PfFit_Installer_web.exe" kan laddas ner från: P f Fit User Guide "med detaljerade förklaringar och definitioner är tillgänglig via Jove som en kompletterande fil, vilket hjälper till att bekanta användaren med P f Fit programmet.
- I "Indikator Fit" panel, importera data från tiden loppet av indikatorn Dye transmittans (Indikator datafil ", figur 3A) och för in manuellt nuvarande experimentparametrarna och de initiala gissningar på parametrarna" bredd "och" t_half "beskriver tidsförloppet av indikatorn Dye koncentration (Figur 3B. Klicka på" Kör "för att visa tomter om tidsförlopp i indikatorn Dye koncentrationen (verkliga data och passform, figur 4A), och modellerade (beräknad) bad osmolaritet (Figur 4B). OBS: agood passning till data är viktigt (en rekommendation: börja med de värden som visas i figur 3).
6 Fastställande av P f med hjälp av Matlab Fitting Program P f Fit
OBS: Förutom de grundläggande antaganden om beteendet hos en protoplast som en sann och perfekt osmometer 11, bestämning av P f vilar på antagandet att P f kan förändras med tiden, att denna dynamik P f ligger bakom den tid loppet av cellens volymförändring, och att tre parametrar räcker för att beskriva det: P fi (det initiala värdet på P f), Slope Pf (graden av den linjära förändringen av P f) och Delay (perioden från början av badet osmolaritet förändring tills starten av cellvolymen förändring). Olika modeller kan testas, inklusive olika kombinationer av dessa parametrar och deras värden, inklusive null-värden 11. P
- Växla till "Volym Fit" panel (Figur 5). Välj för import filen områden data (textfilen med tidsförloppet för de "områden" av de analyserade protoplaster, figur 5A). Välj "Senaste Indikatordon" som parameter källa (figur 5B, se 'P f Fit Användarhandbok "för alternativ). OBS: Dessa parametrar (Figur 5D) används sedan för att regenerera osmotikum förändringen i badet för de volymer passande förfarande.
- I "Volym Fit" panel (figur 5C), initiera (Fyll i de inledande gissningar för) P f parametrar: P f, Slope Pf och Delay (en rekommendation: börja med 1, 1 och 30, respektive), valde modellen "klass" (en rekommendation: börja med II och varumärke "kontroller" för alla tre parametrar som ska monteras). Klicka på "Kör" och sedan ögongloben interims figuren (figur 5E) och justera fördröjningsparametern och längden på posten, om det behövs.
- Undersök resultat graf (fig 6) för att utvärdera passform kvalitet och registrera passform felet. Ändra initialisering parametrarna några vika vardera, och åter'Run ". OBS: Gör inte modet när programmet fastnar - bara starta om programmet!
- Upprepa proceduren flera gånger, med början med olika kombinationer av initieringsparametrarna, siktar på det lägsta värdet på passning fel.
- Kopiera listan över de passnings resultaten direkt från skärmen, eller hitta dem i tHan PfFit genererade "_FIT_Vol_Results.txt" fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att bestämma P f och jämföra aktiviteten hos olika AQPs är mesophyll protoplaster från Arabidopsis blad används. Dessa protoplaster befanns ha låga basala (bakgrund) P f nivåerna 7 och kan fungera som en funktionell-expressionssystem för att möjliggöra reproducerbara mätningar P f.
Protoplaster från en mogen blad från en 6 veckor gamla Arabidopsis anläggning isolerades och tre gen konstruktioner med AQP gener från Arabidopsis (AtPIP2, 1) och majs (ZmPIP1, 2 och ZmPIP2, 4) var tillfälligt (och separat) uttryckas med PEG transformation metod 15. Om man antar att vid transformationen är samtidigt ett stort antal plasmider används i cellen oavsett karaktär och bygger på de resultat som visade en 100% framgång för synkroniserad gående uttryck av två plasmider i en cell rapporterats tidigare för andra växtsystem15,16, de samar med en vektor som kodar för den förbättrade grönt fluorescerande protein (EGFP) för att märka de transformerade protoplaster (Figur 7).
För P f-analyser, var protoplaster som i experimentkammare (figur 1B) och GFP-märkta protoplaster övervakades genom video medan de spolades initialt med isoton lösning (600 mOsm), sedan med hypoton lösning (500 mOsm), med användning av perfusionssystemet (Figur 1A).
De tidsförloppen för de förändringar cell volym (figur 8A) erhölls för varje cell i två steg: först, den "Bild Explorer" och "Protoplast Analyzer 'plugins användes för att generera tidsförloppet av förändringar i cellens konturområdet (figur 2) då Matlab passningsprogram P f Fit (Figur 5) användes för att importera these områden och konvertera dem till cellvolymer. De P f-värden (figur 8C) härleddes för varje cell med P f Fit programmet (Figur 5), baserat på tidsförloppet av cellvolymer och dessutom på den importerade genomsnitt tidsförloppet av transmissions förändringar i indikatorn Dye (Figur 3), omräknat till tidsförloppet av koncentrations ändra indikatorn Dye (Figur 4A) och sedan - till tidsförloppet av badet osmolaritet förändring (figur 4B, 6A och 8B). Det är värt att notera, att delC, skillnaden i osmotiska koncentrationer i cellen (Cin) och i badet (Cout), dvs. Drivkraften för vatteninflöde, berodde nästan enbart till ändringen av Cout (Figur 6A ). I detta experiment ökade P f under analysen (Figur 6B).
P f Pf av kontrollcell transformerad med GFP ensamt (figur 8C).
Figur 1: Den volym-analyssystemet. (A) Den experimentella uppställningen: perfusionssystemet innehåller lösnings reservoarer (infusions kolumner, 'Kolumnerna'), slang (T), ventiler (V) och en peristaltisk pump (P) som är ansluten till plexiglasglid inställd på mikroskopbordet. HS = hypoton lösning, är isoton lösning, Cm kamera. (B) En förstorad vy av den plexiglaset med experimentkammare (Chr) och slangen fäst via ett inlopp (I) förgreningskontakten. Lösningen suges från kammaren via ett utlopp (Ut) till pumpen. (C) En schematisk ritning av plexiglas slide (moturs: ovanifrån, lång från sidan och kort från sidan): a = glas täckglas, den centrala kammaren botten; b = klar tejp (tabell 1), som fungerar som en botten för inlopp och utlopp lösningsspår som leder till och från den centrala kammaren; när tejp skall ersättas (bara ibland), är ett hål skärs i den under kammaren; c = a plexiglas blocket limmas på glid; d = en utloppsanslutning hål. Siffror är mm (men på ritningen är inte skalenliga). (D) En förstorad vy av den centrala delen av sliden med det transparenta locket (även plexiglas) som delvis täcker den centrala kammaren (pilar). (E) Schematisk ritning (överst och sidovyer) i det transparenta locket. Storleken på det genomskinliga locket handtag (grön plast i D) är godtycklig. Andra detaljer är som i C.
2 / 51652fig2highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 2: Analys av svullnad protoplaster bilder med hjälp av "Protoplast Analyzer" plugin. (A) en, den första bilden av filmen med protoplaster, b, som i en, men gula cirklar indikerar urvalet gjorts efter att ha granskat filmen, innan konturerna automatiskt, c, från den första till den sista bilden de gröna cirklarna tätt följer konturerna av de "skötsamma" protoplaster genomgår analys. (B) 'Time'-rätters tomter (med enheter av bildnummer på abskissan) av de beräknade områden inom protoplast konturer ("område", i kvadratiska bildpunkter ) för varje spårad (och numrerade) protoplast. (C) Parametrarna ingångspanel "Protoplast analysatorn" plugin. Fyra "detektionsparametrar" kan justeras för att finjustera protoplastdetekteringsalgoritmen. Den "antal gränspunkter "Parameter definierar den minsta tjockleken på protoplastkonturen (standardvärde: 5). Den "relativa vikt" parameter påverkar den grå tröskelnivåskillnad mellan det inre protoplastområdet och den yttre gränsen (default: 2). Den "maximal omkrets ratio" definierar en tröskel för undantag protoplaster när deras form avviker från en cirkel. Denna parameter är förhållandet mellan protoplast omkrets till omkretsen av en perfekt cirkel med samma yta som protoplast (default: 1,05). Det "maximala ökningen området" (% ökning per tidssteg) parameter utesluter protoplaster med ökningar konturområdet ovanför parametervärdet (standardvärde: 5%). Slutligen plugin hanterar även små protoplaströrelser men kommer sluta spåra protoplaster som rör sig snabbt eller som försvinner från bildytan. Filmen kan köra så många gånger som behövs, och en enda protoplast kan analyseras om separat..com / filer / ftp_upload / 51652 / 51652fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Den "Indicator Fit" panelen av P f Fit programmet. Denna del översätter indikatorsmittans tidsförloppet i badet osmolaritet tidsförloppet. (A) Bläddra för den sparade datafil med tidsförloppet av transmittans förändringar i indikatorn Dye. (B) Använd antingen den tidigare sparade lista med variabler och parametrar, eller sätt in manuellt de fem variabelvärden för det aktuella experimentet: "true_C_init" och "true_C_end" (de osmolarities i det ursprungliga badet lösningen och P f -assay lösning perfusion via badet), "t_start_wash"(Hur länge baslinjen provtagning vid den initiala Indicator Dye-nivå)," threshold_% '(% av utgångsvärdet, där programmet upptäcker automatiskt avgång från utgångsvärdet transmittans, 1-5% är oftast den mest effektiva),' N_steady_st_pts "(antalet prov - med 10 prover som representerar varje Indikator Dye bild tagen - som medelvärdet i slutet steady state nivån på indikatorn Dye, avgörande för omvandlingen av indikatorn Dye koncentrationen till osmotikum koncentration) och initiala gissningar för två av de fyra parametrarna i indikatorn Dye transmittans sigmoidal tidsförloppet, "bredd" och t hälften (Grovt relaterad till varaktigheten av övergången del av sigmoid, och till dess mittpunkt, respektive; t hälften kan vara negativ!). Två bästa passform parametrar, utöver "bredd" och t hälften erhålls utan behov av gissninges: lag ('flush_lag'), tiden mellan ventilöppningen till ankomsten av lösningen i badet, och "C_init", utan en fysisk mening, men nödvändigt för att beskrivningen av osmolaritet tidsförloppet (se kompletterande P f Fit Användarhandbok.
Figur 4:. Indikatorfärgämnet koncentration i badet och osmolariteten hos mediet (A) Tidsförloppet av indikator-färgämnet koncentrationen, beräknas direkt från data (prickar) och från de mest lämpliga parametrar (linje) som det tvättade bort med en icke färgad lösning. (B) Den beräknade tidsförloppet för osmolariteten förändring av badlösningen, under antagande att det följer samma dynamik som förändringen av indikatorfärgämnet koncentration.
Figur 5:. Den "Volym Fit" panel av P f Fit program (A) Bläddra för området tidsförloppet datafil i det analyserade protoplast (B) Välj "Senaste Indikatordon alternativet att importera experimentparametrarna från. . senaste körningen genom "Indikator Fit" (se kompletterande P f Fit Användarhandbok för alternativ) (C) "Model Type" / "klass": Klass I innehåller den enklaste modellen 1, klass II - modellerna 2-5, klass III - modeller 6 - 8 Modellerna skiljer sig åt med avseende på vilka parametrar som fastställs och som anpassas (dvs fritt rörlig.) under anpassningsförfarandet (kryssa i rutan för att låta den variera), och huruvida " SlopePf "och / eller" Försening "är null. Det lägels 1-6 diskuteras utförligt av Moshelion m.fl. 11.. "Kombinationer" listar parameterval dikteras av valet av "Model Type" / "klass". Bland modeller med en liknande passform resultat - välj den enklaste! Initiera 'P f "," Slope Pf' ('Slope_Pf) och "försenad flygning" parametrar som visas (mer information om "Delay" i E nedan). (D) De variabler och parametrar som beskriver tidsförloppet för den föränderliga badet osmotikum matas antingen manuellt, eller som beskrivs i B. (E) En interims tomt, åberopas genom att slå "RUN", av ett tidsförlopp för volymförändring (beräknat från cellkonturområden) för att underlätta valet av det ursprungliga värdet för "Delay" parametern. Värdering, genom att eyeballing, den totala längden av den baslinje den 1 punkten till start av cellvolymförändring (den "inclusive fördröjning: summan av "t-start-wash '+' lag '/' flush-lag" + den "fysiologiska" "försening"). Sätt detta värde som en ingångsparameter för "försening" i "VolumeFit" panelen och "Kör" igen (se även kompletterande P f Fit Användarhandbok).
Figur 6: Resultaten av kopplingen (A) "Bakom kulisserna": de beräknade ultimata tidsförlopp av osmotikum koncentrationer i de två facken:. Badet (Cout, grön linje) och cellen (Cin, blå linje; Cin är beräknas utifrån protoplastvolymförändringar och ett antagande att plasmamembranet är permeabelt endast för vatten - den "perfekta och sanna osmometer" 11), samt tidsförloppet för skillnaden mellan dem (delC, Röd linje), som är den drivande kraften för vattenflödet, 'Eo-tLag "markerar slutet på den" flush-lag "och i början av hypoton utmaningen (här endast på ca 21 sek). Röd ruta: felet i passningsvärde (fit-ERR, se definition i B nedan) (B) Det slutliga resultatet av montering av volym tidsförloppet;. Grön ruta: "ingångsvariabler" är de värden som matas in via P f Fit / 'VolumeFit "panel (definieras i figur 5A legend). Black box: "Exptl-Vol" och "monterade-Vol" är de experimentella data och volymen beräknas med de mest lämpliga parametrar, respektive, är "Eo-tLag" samma som i A, 'Eo-Delay' markerar starten av volymförändringen. "Ett område med 3% 'markerar volymen som den yta ökade med 3%, den förmodade gränsen till cellmembranet förmåga att sträcka utan att brista. "Pf (skalas)" är den tid under beslaget-based beräknat P f, spänner de värden som anges under den röda rutan som "Span i P f '. Röd box: "MONTERADE PARA" är värdena för de bästa passningsparametrar: "Pf i" (den ursprungliga P f), "försening" (tiden mellan uppkomsten av hypoton utmaning och början av volymförändring (vilket, enligt modellen fem som används i detta exempel är också början på en förändring i P f-värde), och "lutning-P f '(den konstanta förändringstakten i P-värde" fit_ERR "visas i en. - minimeringsmålet i Matlab passande förfarande - är "root-mean-square" avvikelse (dvs en kvadratroten ur ett medelvärde i kvadrat avvikelsen) i en grön prick på svart linje), presenteras som% av baslinjen volymen It. är genom detta värde att den relativa framgången för upprepad montering med olika parameter initieringsvärden bedöms. AVarningens: Som de mest lämpliga parametervärden kan vara resultatet av ett lokalt minimum hittas i felminimering förfarandet - för att kontrollera att en global minimi har funnit är flera körningar krävs med olika initieringsvärden för dessa tre parametrar (och lägsta fit_ERR bör sökas under dessa försök Blå ruta:. deltan de förändringar som inträffade i slutet av den monterade volymförändringen period: "avg Volm%" är den relativa omfattningen av den beräknade protoplastvolymförändring och "avg Area%" är den relativa förändringen av den protoplast ytarea. Initialstorleken av cellen ges av "radie", härlett från medelvärdet av den protoplastbasalkonturområdet.
Figur 7: Epi-fluorescensmikroskopi syn på mesophyll protoplaster (A) under överförd vitt ljus och (B) vid 488 nm excitation och 520 nm emission. Skala bar:. 100 pm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8:. Volym förändring och det extraherade osmotiska vattenpermeabilitet, P f (A) Tidsförlopp (60 sek) av protoplast svullnad vid exponering för hypotonisk utmaning (medelvärde ± SE) (B) Den beräknade osmotikum koncentrationen i badet under den. hypoton utmaning. Observera att även om hypoton lösning flödet var påslagen vid 15 sek, nådde det badet först efter eneftersläpning, här på 5,9 sek. (C) P f (medelvärde ± SE). Asterisker indikerar signifikanta skillnader från kontroll (p ≤0.05). Data från minst tre oberoende försök för varje behandling med totalt n protoplaster (kontroll: n = 52, AtPIP2, 1: n = 13, ZmPIP1, 2: n = 28, ZmPIP2, 4: n = 34).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beskrivs här är en enkel och mycket effektiv procedur för att mäta P f av isolerade växtprotoplaster, som gäller i princip även för andra sfäriska celler, t ex., Grodoocyter 11. Denna metod är baserad på mätning av P f som svar på en osmotisk utmaning till cellen. I motsats till de andra metoder baserade på detta tillvägagångssätt är emellertid förändringen av lösningar, dvs av osmolariteten är inte ögonblicklig, men gradvis, under en konstant bad perfusion, som börjar med isoton lösning, i vilken en baslinje cellvolymen är etablerad. Dessutom ger denna metod inte involverar en sugan pipett och minimerar därför störningen till protoplaster.
Den metod som presenteras här möjliggör mätningar från en mängd olika protoplaster, från olika växter eller vävnader. Men på grund av beräkningarna inblandade, bara sfäriska celler kan analyseras. Även den enzymatiska isoleringen av the protoplaster och osmolaritet lösningarna måste anpassas till de analyserade cellerna (t.ex. den enzymatiska isoleringen av tomat mesophyll protoplaster tar ungefär en timme, betydligt längre än i fallet med Arabidopsis protoplaster).
Isoleringen av Arabidopsis mesophyll protoplaster i enlighet med den presenterade protokollet är enkel, snabb och effektiv, vilket gav ett stort antal protoplaster. Noterbart är detta i kombination med deras låga basala P f nivåer och deras höga omvandlingseffektivitet (Figur 8), gör dem till en attraktiv system för funktionellt uttryck av AQPs, för att möjliggöra kvantitativa jämförelser av P f inducerad av olika AQP isoformer. När uttryck AQPs i dessa protoplaster med en markörgen (t.ex. GFP), kan ett enkelt screena protoplasterna i försökskammaren efter fluorescerande celler att analysera.
Det lönar sig att kontrollera om detta system är en livskraftig Alternative till äggceller för analys AQPs även från animaliska källor (att funktionella animaliska proteiner kan uttryckas i växtceller har redan visat 17).
Med hjälp av P f Fit program, ytterligare två parametrar, bredvid P f, erhålls för beskrivningen av protoplast svar på hypotona utmaningar: fördröjning, tiden mellan uppkomsten av volymförändringar och början av badet perfusion och Slope Pf, förändringstakten i P f under det osmotiska utmaning (beskriven i detalj i 11).
För varje försöksdata som volymen montering proceduren måste utföras flera gånger, som levererar olika utgångs (initiering) värden för dessa parametrar, så småningom välja passform med lägst felet. Detta fel minimering process kan beskrivas som att söka den djupaste dalen (ett "globalt minimum") i ett landskap av dalar med olika djup, bland människany kullar, och försök inte fångas i en ganska grund dalgång (ett "lokalt minimum").
Två typer av P f erhålls, P f i början av hypoosmotisk svullnad svaret ("P f inledande") och P f beräknas i slutet av 15 sekunder av svullnad, räknat från slutet av fördröjningen ('P f slutlig). Skillnaden mellan de två diskuteras fullt av Moshelion et al. 11, när det gäller de sex modellerna analyseras.
Det finns två viktiga steg i protokollet: första, en bra passform till tidsförloppet av indikatorn Dye koncentrationen, andra, en bra passform till tidsförloppet av volymen av den svällande cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats med bidrag från den belgiska nationella fonden för Scientific Research (FNRS), den Interuniversitets sevärdhet polacker Program-belgiska Science Policy och "Communauté française de Belgique-Actions de Recherches Concertées" till FC, från Israel Science Foundation Jerusalem ( ISF) till MM (Grant # 1311-1312) och NM (Grant # 1312-1312).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KCl | Chem-Impex International | 01247-1 | http://www.chemimpex.com Any source, anal. grade |
| CaCl2 | Merck | 11718006 | http://www.merck.com Any source, anal. grade |
| 2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES) | Sigma | 15152002 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| D-Sorbitol | Sigma | 18032003 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| Cellulase | Worthington, Lakewood, NJ, USA | LS002603 | http://www.worthingtonbiochem.com |
| Pectolyase | Karlan, Phonix, AZ, USA | 8006 | http://www.karlan.com |
| Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP) | Sigma | 81420 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418-5G | http://www.sigmaaldrich.com |
| Protamine sulphate | Sigma | P4380 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Silicone vacuum grease heavy | Merck | 107921 | https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&SEO_ErrorPageOccurred=true&attachments=CoA |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100/TS100F | http://www.nikoninstruments.com |
| Peristaltic pump | BIO-RAD | EP-1 Econo Pump | http://www.bio-rad.com |
| Grayscale digital camera | Scion Corporation | CFW-1308M | http://www.scioncorp.com |
| CMU 1394 Camera Driver’ plugin for ImageJ | Carnegie Mellon | http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html Free software |
|
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ Free software |
|
| Econo Gradient Pump Fittings Kit | BIO-RAD | 731-9006 | http://www.bio-rad.com |
| Connectors, manifold | DirectMed | http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S | |
| Burette infusion sets (columns) | Welford | IF-BR-001 | http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61 |
| Tubing | TYGON | R-3603 | http://www.usplastic.com |
| 3M packaging Scotch tape 1'', clear | Viking Industrial, UK | VKMONO25 | http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8 any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK |
References
- Tyerman, S. D., Niemietz, C. M., Bramley, H. Plant aquaporins: multifunctional water and solute channels with expanding roles. Plant Cell Environ. 25, 173-194 (2002).
- Maurel, C. Plant aquaporins: Novel functions and regulation properties. Febs Letters. 581, 2227 (2007).
- Maurel, C., Verdoucq, L., Luu, D. T., Santoni, V. Plant aquaporins: Membrane channels with multiple integrated functions. Annual Review of Plant Biology. 59, 595 (2008).
- Chaumont, F., Moshelion, M., Daniels, M. J.
- Ramahaleo, T., Morillon, R., Alexandre, J., Lassalles, J. P. Osmotic water permeability of isolated protoplasts. Modifications during development. Plant Physiology. 119, 885-896 (1999).
- Suga, S., Murai, M., Kuwagata, T., Maeshima, M. Differences in aquaporin levels among cell types of radish and measurement of osmotic water permeability of individual protoplasts. Plant Cell Physiol. 44, 277-286 (2003).
- Shatil-Cohen, A., Attia, Z., Moshelion, M. Bundle-sheath cell regulation of xylem-mesophyll water transport via aquaporins under drought stress: a target of xylem-borne ABA? The Plant Journal. 67, 72-80 (2011).
- Hachez, C., Moshelion, M., Zelazny, E., Cavez, D., Chaumont, F. Localization and quantification of plasma membrane aquaporin expression in maize primary root: A clue to understanding their role as cellular plumbers. Plant Molecular Biology. 62, 305-323 (2006).
- Hachez, C., Heinen, R. B., Draye, X., Chaumont, F. The expression pattern of plasma membrane aquaporins in maize leaf highlights their role in hydraulic regulation. Plant Molecular Biology. 68, 337-353 (2008).
- Besserer, A., et al. Selective regulation of maize plasma membrane aquaporin trafficking and activity by the SNARE SYP121. The Plant Cell. 24, 3463-3481 (2012).
- Moshelion, M., Moran, N., Chaumont, F. Dynamic changes in the osmotic water permeability of protoplast plasma membrane. Plant Physiology. 135, 2301-2317 (2004).
- Moshelion, M., et al. Membrane water permeability and aquaporin expression increase during growth of maize suspension cultured cells. Plant, Cell & Environment. 32, 1334-1345 (2009).
- Sade, N., et al. Improving plant stress tolerance and yield production: is the tonoplast aquaporin SlTIP2;2 a key to isohydric to anisohydric conversion? New Phytologist. 181, 651-661 (2009).
- Volkov, V., et al. Water permeability differs between growing and non-growing barley leaf tissues. J. Exp. Bot. 58, 377 (2007).
- Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount. Plant Cell Reports. 21, 865-871 (2003).
- Hosy, E., Duby, G., Véry, A. A., Costa, A., Sentenac, H., Thibaud, J. B. A procedure for localisation and electrophysiological characterisation of ion channels heterologously expressed in a plant context. Plant Methods. 19, (2005).
- Shoseyov, O., Posen, Y., Grynspan, F. Human Recombinant Type I Collagen Produced in Plants. Tissue Eng Part A. 19, 1527-1533 (2013).
