Summary
Om de cellulaire en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen neotissue vorming en stenose ontwikkeling in tissue engineered hartkleppen begrijpen, een muizenmodel van heterotopische hartklep transplantatie werd ontwikkeld. Een pulmonale hartklep werd getransplanteerd naar ontvanger via de heterotopische harttransplantatie techniek.
Abstract
Tissue engineered hartkleppen, vooral ontceld kleppen, beginnen aan kracht winnen in klinisch gebruik van reconstructieve chirurgie met gemengde resultaten. Echter, de cellulaire en moleculaire mechanismen van de neotissue ontwikkeling, klep verdikking en stenose ontwikkeling niet uitgebreid onderzocht. Om de bovenstaande vragen te beantwoorden, ontwikkelden we een muizen heterotopic hartklep transplantatie model. Een hartklep werd geoogst van een afsluiter donor muis en getransplanteerd naar een hart donor muis. Het hart met een nieuwe klep werd heterotoop getransplanteerd naar een ontvanger muis. De getransplanteerde hart toonde zijn eigen hartslag, onafhankelijk van de hartslag van de ontvanger. De doorbloeding werd gekwantificeerd met behulp van een hoge frequentie ultrasoon systeem met een gepulste golf Doppler. De stroming door de geïmplanteerde pulmonaalklep toonde aanvoer met minimale oprispingen en de piekstroom was dicht bij 100 mm / sec. Dit muizenmodel van hartklep transplantatie is highly veelzijdig, zodat het kan worden gewijzigd en aangepast aan verschillende hemodynamische omgevingen en / of kan worden gebruikt met verschillende transgene muizen neotissue ontwikkeling bij een tissue engineered hartklep.
Introduction
Aangeboren cardiovasculaire defecten zijn een van de belangrijkste oorzaken van kindersterfte in de westerse wereld 1,2. Onder hen, pulmonaalklep stenose en bicuspide aortaklep gebreken zijn een vaak voorkomende vorm 3. Hartklepvervanging operatie is een routine keuze van reconstructieve chirurgie; echter complicaties zoals stenose en verkalking van de hartklep en levenslange afhankelijkheid van anticoagulantia zijn een belangrijke bron van chronische ziekte en dood 4-7. Bovendien is het gebrek aan groeipotentieel vereist herziening operaties, die verder verhoogt de mortaliteit van deze jonge patiënten 4,8,9.
In een poging om een functionele vervanging hartklep met groeipotentieel, Shinoka et al.. Gezaaide autologe cellen zich ontwikkelen op een biologisch afbreekbare synthetische hartklep 8. De kunststof klep getransformeerd naar een native hartklep achtige structuur met groei potentiometerAl. Voorlopige grote dierlijke studies aangetoond dat de haalbaarheid van het gebruik van deze methode om een functionele hartklep 10 te creëren. Echter, op lange termijn implantatie studies aangetoond slechte duurzaamheid gevolg van de geleidelijke verdikking van de klep neotissue resulteert in vernauwing van de hartklep. Werken vanuit Sodian et al.. Gebruikt de Shinoka methodologie, maar uiteindelijk vervangen de PGA matrix met een biologisch afbreekbare elastomeer, die de biomechanische eigenschappen van het weefsel gemanipuleerde afsluiter gaf de bouw van een meer fysiologisch profiel 9,11,12. In de in vivo studie, ondanks het succes van implantatie, een confluente endotheelcellen bekleding was niet gevormd die het succes van de steiger 12 lange termijn kunnen beperken.
Om rationeel ontwerpen van een verbeterde tweede generatie synthetische hartklep, een muizenmodel van hartklep transplantatie werd opgericht om de cellulaire en moleculaire mechanismen underlyin onderzoekeng neotissue vorming, klep verdikking en stenose ontwikkeling. Muizen-modellen bieden een breed scala aan moleculaire reagentia, waaronder transgenics, die niet direct beschikbaar in andere soorten 7 zijn. In deze hartklep transplantatie model, werd een ex vivo syngeen pulmonale hartklepvervanging eerst uitgevoerd; en dan het hart met de geïmplanteerde hartklep werd heterotoop geïmplanteerd in een syngene gastheer met een microchirurgische techniek. Dit model maakt hartklep vervanging zonder de noodzaak van cardiopulmonale bypass.
In dit artikel een gedetailleerde uitleg van een hartklep oogst, donorhart voorbereidingen, hartklep transplantatie, en heterotopische harttransplantatie wordt beschreven. De resultaten lieten een continue hartslag van het donorhart, die onafhankelijk van de ontvanger hartslag was. De bloedstroom door het geïmplanteerde pulmonale klep werd gemeten met een hoogfrequente ultrasone systeem met pulserende golf doenppler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door de Nationwide Children's Hospital Institutional Animal Care en gebruik Comite.
1. Pulmonale hartklep Oogst van een hartklep Donor Mouse
- Autoclaaf alle chirurgische instrumenten voor de operatie: 1x fijne schaar, 3x micro tang, 2x micro vasculaire klemmen, 1x klem toepassen tang, 1x micro naaldhouder, 1x lente schaar, 1x oprolmechanisme.
- Een 6-8 weken oude vrouwelijke C57BL / 6 muis als pulmonaire hartklep donor. Verwijder de muis uit de kooi en wegen, dan euthanize met een ketamine / xylazine cocktail (ketamine, 200 mg / kg en xylazine, 20 mg / kg, IP) overdosis.
- Knip de borst en plaats de muis in een dorsale recumbence positie op een pad. Maak dan de thoracotomie. Expose het hart, maak een kleine snee in de rechterboezem, en perfuseren de linker ventrikel met ijskoude zoutoplossing.
- Botweg ontleden de longslagader (PA) van de oplopende eenorta. Knip de pulmonaalklep (PV), samen met 2 mm manchet van longslagader. Gooi de rest van het hart.
- Bewaar de PV koude heparine en zoutoplossing (100 eenheden / ml). Opmerking: De PV kan de oplossing gedurende twee uur vóór de transplantatie om het donorhart.
2. Donorhart Voorbereiding
- Een 6-8 weken oude vrouwelijke C57BL / 6 muis als donor hart. Verwijder de muis uit de kooi en wegen, dan euthanize met een ketamine / xylazine cocktail (ketamine, 200 mg / kg en xylazine, 20 mg / kg, IP) overdosis. Dit is een terminal procedure.
- Knip de borst en plaats de muis in een dorsale recumbence positie op een pad. Maak dan de thoracotomie. Botweg scheiden het hart, vena cava inferior (IVC), vena cava superior (SVC), stijgende aorta, PA, en pulmonale ader. Perfuse het IVC met ijskoud steriele zoutoplossing.
- Ligeren de IVC, SVC, en pulmonale ader met 6-0 zijden hechtdraad en snijd superieur aan deligaturen.
- Snijd de aorta en de PA met 2 mm manchet.
- Knip de PV en gooi het weg.
3. Heart Valve Transplantation op een donorhart
- Onmiddellijk na stap 2.5, plaatst u de hartklep van stap 1.5 in het donorhart en oriënteren van de hartklep.
- Zet de PV met een steek aan de rechterzijde van de klep met 10-0 monofilament-hechtingen op conische naalden en gaan continu hechten met 5-6 steken vanaf de andere zijde van de PV.
- Na het afronden van de voorkant, draai het hart horizontaal en beginnen aan de achterkant van de PV te hechten op het donorhart.
- Bewaar het hart in een koude steriele heparine / zoutoplossing. Opmerking: Het donorhart kan de oplossing gedurende twee uur vóór implantatie de ontvanger muis.
4. Heterotope Heart Transplantation op een ontvanger Muis
- Een 6-8 weken oude vrouwelijke C57BL / 6 muizen werd gebruikt als een reciwie de goederen overgaan. Verwijder de muis uit de kooi en wegen, vervolgens verdoofd met ketamine / xylazine cocktail (ketamine, 100 mg / kg en xylazine 10 mg / kg). Ketoprofen (5 mg / kg) als preanesthesia analgeticum.
- Na het controleren van het niveau van sedatie door staart knijpen, clip de buik-en borsthaar. Smeer de ogen met steriele oogzalf, en plaats de muis in een dorsale recumbence positie op een pad. Ontsmet de buik met betadine en alcohol pads. Dek de muis met een steriel laken en alleen de incisie gebied bloot.
- Maak een middellijn laparotomie incisie van onder de xyphoid de suprapubische regio, en steek een zelf behoud oprolmechanisme. Wikkel de darmen in een zoutoplossing bevochtigd gaas. Botweg de infrarenale aorta en vena cava definiëren.
- Plaats twee 6-0 zijden hechtingen proximaal en distaal rond de aorta en IVC bloedsomloop beperken.
- Plaats het donorhart aan de rechterzijde van de abdominale aorta en dek deze af met steriel gauZE. Hydrateren met een zoutoplossing.
- Een aortotomy in de abdominale aorta met een 30 G naald en breiden de opening met een schaar om de grootte van de donor aorta.
- Voer een end-to side anastomose met behulp van steriele 10-0 monofilament hechtingen op taps toelopende naalden. Zet de donor aorta met een steek aan de proximale uiteinde van de opening in de abdominale aorta en gaan continu hechten met 4-5 steken uit het distale einde van de abdominale aorta.
- Flip het hart aan de linkerkant, dek het af met een zoutoplossing toegediend gaas, en beginnen om continu te hechten met 4-5 steken uit het distale einde van de abdominale aorta.
- Wordt venotomie in de IVC met een 30 G naald en breiden de opening om de grootte van de donor longslagader.
- Voer een einde aan zijkant anastomose met behulp van steriele 10-0 monofilament hechtingen op taps toelopende naalden. Zet de donor PA met een steek aan het proximale uiteinde van de opening in de IVC en gaan continu hechten met 4-5 steken uithet distale uiteinde van de inferior vena cava. Deze keer, omdat de aorta in de weg, zorg ervoor dat het hechten van de linker wand van de PA van de donor is aan de binnenkant van het IVC.
- Spoel de IVC lumen met heparine en zoutoplossing (100 eenheden / ml). Sluit de rechterwand van de donor en de ontvanger PA IVC door voortdurend hechten zij aan het distale einde.
- Verwijder de distale ligatuur en de controle van de bloeding door het toepassen van een actueel absorbeerbare steriele hemostaat middel. Wanneer de bloeding stopt helemaal, verwijder de proximale hechting en de controle van de bloeding op dezelfde manier.
- De terugkeer van de darmen en sluit de buikspieren en huid in twee lagen met een 6-0 zwart polyamide monofilament hechtdraad.
- Injecteer 0,5 ml zoutoplossing subcutaan en plaats de muis in een herstel kooi op een opwarming pad totdat de muis is volledig mobiel. Na herstel, de terugkeer van de muis om een nieuwe kooi met papier beddengoed. Geef pijnstillers (Ibuprofen, 30 mg / kg, drinkwater) voor 48 uur. Doenniet een dier dat een operatie heeft ondergaan om het gezelschap van andere dieren tot volledig hersteld terug.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont het schema van de hartklep transplantatie model met behulp heterotopische harttransplantatie. De hartklep werd geoogst van een donorhart en geïmplanteerd op een hart van een tweede donor muis. Dan het hart met de nieuwe hartklep werd geïmplanteerd om de buik van een ontvanger muis. Figuur 2 toont een illustratie van de geïmplanteerde hart op de buik ruimte (A), direct na harttransplantatie (B), en 5 minuten na transplantatie. Na verwijderen hechtingen aan beide zijden van de aorta en IVC, het hart begint 1-2 minuten later sloeg en wordt Pinker meer bloedcirculatie. Merk op dat het rechteratrium meer gedilateerd in (C) dan (B). Het hart slaat geleidelijk sterker en is stabiel na 24 uur.
De bloedstroom door het geïmplanteerde pulmonaalklep werd percutaan gemeten 10 dagen na implantatie meteen hoogfrequente ultrasone systeem met pulserende golf Doppler modus (figuur 3). De locaties van de aorta, rechter ventrikel (RV), geïmplanteerd pulmonaalklepvervanging (PV) en longslagader (PA) in B-modus is getoond in figuur 3 (A). De gele monstervolume overlay op de geïmplanteerde PV. Figuur 3 (B) toont een schema van de anatomie en de locatie van het monstervolume overlay. Zoals getoond in figuur 3 (C), werd het donorhart QRS golf ritmisch gedetecteerd en onafhankelijk van de ontvanger hartgolf. De gemeten systolische en diastolische bloedvolume op de geïmplanteerde PV paste het donorhart golf. De pieksnelheid was ongeveer 100 mm / sec.
Figuur 1.60; Schematische voorstelling van de hartklep transplantatie Een pulmonale hartklep werd geoogst uit een eerste donor muis en geïmplanteerd in een hart uit een tweede donor muis.. Dan het hart met de nieuwe klep werd heterotoop geïmplanteerd in een ontvanger muis.
Figuur 2. De getransplanteerde hart. A) Een diagram van een hart met nieuwe hartklep geïmplanteerd om buikholte (B) direct na de implantatie, en (C) 5 min na implantatie.
Figuur 3. Bloedstroom meting implanted pulmonaalklep. A) het B-modus waarin de locaties van aorta, rechter ventrikel (RV), geïmplanteerd pulmonaalklepvervanging (PV) en pulmonale arterie (PA). B) Een diagram van de anatomie en de locatie van het monstervolume overlay. C) Velocity meting bij de geïmplanteerde PV met ECG-golven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het sterftecijfer van deze procedure is bijna 20%, die voornamelijk veroorzaakt door bloeding op de PV transplantatie plaats en anastomose aan de aorta donor naar de ontvanger abdominale aorta. In de meeste gevallen, het sterftecijfer aanzienlijk afneemt 48 uur na de operatie. De overleving muizen vertoonden sterke hartslag en bloedstroom door het geïmplanteerde PV. Het hele proces duurt vier uur voor een ervaren micro chirurg. Het zal ongeveer 250 muizen te nemen om de techniek onder de knie. Het heterotope harttransplantatie is relatief eenvoudig in vergelijking met de PV implantatie het donorhart. Een van de meest kritische stappen voor een succesvolle HV transplantatie oogst van de PV structuur van een donor muis. De PV structuur moet worden doorsneden ongeveer 1-2 mm onder de klep. Als het restmateriaal te kort zal anastomose uitdagend. Indien het weefsel onder de PV te lang (dwz. De PA te lang zijn in vergelijking met het stijgening aorta na implantatie), kan de geïmplanteerde PA verdraaien of knikken. Een andere belangrijke stap is de anastomose tussen de geïmplanteerde PA en ontvanger IVC. Aangezien het IVC is zeer dun, is het uiterst gemakkelijk te scheuren tijdens het hechten.
In dit model, de aorta bloed komt door de aorta, stroomt door de kransslagaders, dan verlaat door coronaire sinus naar de donor RA. Dus het bloedvolume door het geïmplanteerde PV te berekenen van 5% van het totale bloedvolume te schatten, de belangrijkste beperking van dit model toe bestuderen TEHV. Om de bloedstroom hoewel de PV verhogen werden drie extra modellen gecreëerd. Ten eerste, een derde anastomose werd gemaakt op basis van de donor RV naar de ontvanger IVC. De derde anastomose kan bloedstroom met 10% tot 50% van het totale bloedvolume. Ten tweede, verder verhogen van de bloedstroom, na plaatsing van de derde anastomose werd de IVC geligeerd proximaal van de derde anastomose. Deze werkwijze verzekerde 50% van de bloedstroom door dePV geïmplanteerd. Ten derde, om de stroming te verhogen door het geïmplanteerde PV en fysiologische circulatie behouden, werd het hart getransplanteerd met de longen. Deze methode kan de stroom oplopen tot 50% van de totale bloedstroom en nog belangrijker, de linker ventrikel en de linker boezem behouden hun circulatie. Deze verschillende fysiologische stroming modellen stellen ons in staat om te bestuderen hoe de verschil in fysiologische stroming van invloed op de ontwikkeling van neotissue en stenose in een getransplanteerde hartklep.
Onlangs hebben we een pilot-studie naar transplantatie ontceld HV uitgevoerd zonder zaaien van cellen met behulp van de beschreven techniek in dit document. De geïmplanteerde PV toonde vergelijkbare bloedstroomkenmerken als controle, predecellularized getransplanteerde PV. In de toekomst zullen verschillende soorten cellen worden gezaaid op de neotissue vorming en vernauwing ontwikkeling van de getransplanteerde HV bestuderen. Bovendien, transgene muizen, zoals groen fluorescerend eiwit (GFP) muizen of mouse model van de ziekte HV, kan het proces van neotissue vorming mechanistisch worden bestudeerd door het bestuderen van de herkomst van de cellen bevolken de gedecellulariseerde of zieke hartklep met behulp van immunohistochemie, die de ontwikkeling van meer rationeel ontworpen, tweede generatie tissue engineered hartkleppen zal helpen. De mogelijkheid om verschillende fysiologische stroomomstandigheden, transgene muizen, PV cellen ontdaan implantaties en mogelijke combinaties van drie tonen de veelzijdigheid en potentieel belangrijke preclinical nut van deze HV transplantatiemodel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund, voor een deel, door een subsidie van de NIH (RO1 HL098228) te CKB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Microscope | Leica | M80 | |
| C57BL/6J (H-2b), Female | Jackson Laboratories | 664 | 8-12 weeks |
| Ketamine Hydrochloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| Xylazine Sterile Solution | Akorn Inc. | NADA# 139-236 | |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-4396-01 | |
| Ibuprofen | PrecisionDose | NDC 68094-494-59 | |
| Heparin Sodium | Sagent Pharmaceticals | NDC 25021-400 | |
| Saline solution (Sterile 0.9% sodium chloride) | Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| 0.9% Sodium chloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| Petrolatum Ophthalmic Ointment | Dechra Veterinary Products | NDC 17033-211-38 | |
| Iodine Prep Pads | Triad Disposables, Inc. | NDC 50730-3201-1 | |
| Alcohol Prep Pads | McKesson Corp. | NDC 68599-5805-1 | |
| Cotton tipped applicators | Fisher Sientific | 23-400-118 | |
| Fine Scissor | FST | 14028-10 | |
| Micro-Adson Forcep | FST | 11018-12 | |
| Clamp Applying Forcep | FST | 00072-14 | |
| S&T Vascular Clamp | FST | 00396-01 | |
| Spring Scissors | FST | 15008-08 | |
| Colibri Retractors | FST | 17000-04 | |
| Dumont #5 Forcep | FST | 11251-20 | |
| Dumont #7 - Fine Forceps | FST | 11274-20 | |
| Dumont #5/45 Forceps | FST | 11251-35 | |
| Tish Needle Holder/Forceps | Micrins | MI1540 | |
| Black Polyamide Monofilament Suture, 10-0 | AROSurgical Instruments Corporation | TI638402 | For sutureing the graft |
| Black Polyamide Monofilament Suture, 6-0 | AROSurgical Instruments | SN-1956 | For musculature and skin closure |
| Non Woven Sponges | McKesson Corp. | 94442000 | |
| Absorbable hemostat | Ethicon | 1961 | |
| 1 ml Syringe | BD | 309659 | |
| 3 ml Syringe | BD | 309657 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309604 | |
| 18 G 1 1/2 in, Needle | BD | 305190 | |
| 25 G 1 in., Needle | BD | 305125 | |
| 30 G 1 in., Needle | BD | 305106 | |
| Warm Water Recircultor | Gaymar | TP-700 | |
| Warming Pad | Gaymar | TP-22G | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| VEVO2100 High Frequency Ultrasound | VisualSonics | http://www.visualsonics.com/vevo2100 | The catalog number and pricing can be acquired from the sales representatives. |
| Ultrasound transmission gel | Parker Laboratories, INC. |
01-02 | |
| Table Top Laboratory Animal Anesthesia System | VetEquip, INC. | 901806 | |
| Isoflurane | Baxter | 1001936060 |
References
- Polito, A., et al. Increased morbidity and mortality in very preterm VLBW infants with congenital heart disease. Intens Care Med. 39, 1104-1112 (2013).
- Wren, C., Reinhardt, Z., Khawaja, K. Twenty year trends in diagnosis of life threatening neonatal cardiovascular malformations. Arch Dis Child Fetal. 93, F33-F35 (2008).
- Vacanti, J. P. Beyond transplantation Third annual Samuel Jason Mixter lecture. Archives of surgery. 123, Chicago Ill. 545-549 (1960).
- Tudorache, I., et al. Orthotopic replacement of aortic heart valves with tissue-engineered grafts. Tissue engineering Part A. 19, 1686-1694 (2013).
- van Geldorp, M. W., et al. Patient outcome after aortic valve replacement with a mechanical or biological prosthesis weighing lifetime anticoagulant related event risk against reoperation risk. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 137, 881-886 (2009).
- El Oakley, R., Kleine, P., Bach, D. S. Choice of prosthetic heart valve in today's practice. Circulation. 117, 253-256 (2008).
- Quinn, R. W. Animal Models for Bench to Bedside Translation of Regenerative Cardiac Constructs. Progress in Pediatric cardiology. 35, (2013).
- Shinoka, T., et al. Tissue engineering heart valves valve leaflet replacement study in a lamb model. The Annals of thoracic surgery. 60, S513-S516 (1995).
- Sodian, R., et al. Tissue engineering of heart valves in vitro experiences. The Annals of thoracic surgery. 70, 140-144 (2000).
- Shinoka, T., et al. Tissue engineered heart valves. Autologous valve leaflet replacement study in a lamb model. Circulation. 94, II164-II168 (1996).
- Sodian, R., et al. Evaluation of biodegradable three dimensional matrices for tissue engineering of heart valves. ASAIO journal (American Society for Artificial Internal Organs. 46, 107-110 (1992).
- Sodian, R., et al. Early in vivo experience with tissue-engineered trileaflet heart valves). Circulation. 102, III22-III29 (2000).
