Introduction
Эмбриональных стволовых (ЭС) клетки получают из внутренней клеточной массы эмбриона на стадии бластоцисты 1. При соответствующих условиях культивирования они самообновлению и остаются плюрипотентные. В 2006 году Яманака и его коллеги показали, что зрелые клетки могут быть перепрограммированы в так называемый индуцированных плюрипотентных стволовых (плюрипотентных) клеток путем принудительного выражения факторов транскрипции Oct-4, Klf-4, Сокс-2, С-Мус (OKSM) 2. плюрипотентных клеток, как ЭС клеток, может привести к всех типов клеток организма, тем не менее, они свободны от этических ограничений, окружающих поколение ЭС клеток 3. Кроме того, IPS клетки несут обещание персонализированной регенеративной медицины и несет в себе огромный потенциал для таких приложений, как моделирования заболевания и в пробирке наркотиков скрининга 4,5. Для того, чтобы перепрограммировать технику для выполнения этого потенциала, основной механизм ядерного перепрограммирования необходимо в полной мере понимать. Тем не менее, усилия препарировать перепрограммирования погладитьhway были затруднены тем, что только очень небольшое число клеток перепрограммировать (0,1-1%). Успешно перепрограммирования фибробластов были зарегистрированы для прохождения различных серии событий, включая мезенхимальных к эпителиальной перехода 6-10 и, в завершающей стадии перепрограммирования, активации эндогенного основной плюрипотентности сети 11-14. Мы и другие 12,13,15-17 недавно идентифицирован набор маркеров клеточной поверхности, который позволяет для разделения редких промежуточных от огнеупорной объемной населения. Перепрограммирование мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs) претерпевают изменения в экспрессии Thy-1.2, Ssea1 и EpCAM (среди прочих) во время 2-недельного процесса перепрограммирования 15. На ранних этапах перепрограммирования подмножество MEFs вниз-регулируют экспрессию фибробластов идентичности маркера (Твое-1.2), а затем начать выражая плюрипотентности связанных маркер SSEA-1 12. Во время заключительных этапах перепрограммирования Ssea1-позитивных клеток Reactivели эндогенные гены плюрипотентности такие как Oct-4 10-13,15. Этот последний переход отмечен на поверхности клетки экспрессии этого из EpCAM (рисунок 1) или в более поздней стадии PECAM 15. В последнее время О'Мэлли и др. Сообщили об использовании CD44 и ICAM1 в качестве альтернативы или дополняют Твоему-1.2 и SSEA-1 для идентификации перепрограммирования промежуточных. Ранее мы уже FACS извлечены перепрограммирования промежуточных со дня 0, 3-й день, 6-й день, День 9 и 12 день перепрограммирования культур, а также от установленных клеточных линий плюрипотентных основе этих маркеров клеточной поверхности 15,18. Для ниже описанной системы и условий перепрограммирования мы показали на одном уровне клетки, что, хотя население тихие однородная, есть определенная степень неоднородности в определенных промежуточных популяций. Следует отметить, что только подмножество клеток в этих популяциях могут прогрессировать к соответствующему следующему STAGE процесса перепрограммирования и порождают колоний плюрипотентных клеток в различной эффективностью, которые широко характеризуются ранее 15,19. Кроме того, эффективность перепрограммирования этих популяций будет зависеть также и от повторных гальванических и культуры условиях. Для увеличения экспериментальную воспроизводимость мы используем перепрограммируемой штамм мыши, которая была разработана специально, чтобы выразить транскрипции трансактиватор (m2rtTA) под контролем локуса Rosa26 и полицистронной OKSM кассеты под контролем доксициклина реагировать промоутер 20,21. Используя эту модель мыши обходит нежелательные побочные эффекты традиционных вирусных методов генерации клеток IPS, т.е., неоднородной отправной населения с клетки к изменчивости клеток в количестве и расположении интеграции сайтов вирусных вставок. Два трансгенные линии мышей (OKSM, m2rtTA), доступные как гомозиготных учредителей животных в лаборатории Джексона, должны быть скрещены в целях установления reprogrammable модель мыши (рисунок 2). В этой рукописи мы подробно описывают, как получить MEFs, генерировать плюрипотентных клеток, и изолировать перепрограммирования промежуточные на различных этапах процесса преобразования по FACS.
Protocol
1 Параметры прибора / Подготовка реагентов / генотипирования
- Подготовка клеток IPS среды: Дополнение 500 мл DMEM Нокаут носитель с 75 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS), 5 мл L-глутамина, 5 мл Номера незаменимые аминокислоты, 500 мкл β-меркаптоэтанола, 5 × 10 5 шт лейкоз ингибирующего фактора ( LIF). Пожалуйста, обратитесь к Список материалов для информации покупательной продукта и для реагентов, используемых в контексте этой рукописи.
- Подготовка MEF среды: Дополнение 500 мл DMEM среды с 50 мл FBS, 5 мл L-глутамина, 5 мл несущественных аминокислот, 5 мл пирувата натрия, 500 мкл β-меркаптоэтанола.
- Подготовьте замораживания среды: по 10 мл, объединить 9 мл FBS с 1 мл ДМСО.
- Подготовьте желатин покрытием блюда добавить 3-5 мл 0,1% раствора свиной желатин в колбе Т75, инкубируют при комнатной температуре в течение по крайней мере 10 мин и аспирации непосредственно перед использованием.
- Подготовка FACS маркировки среды: по 10 мл, сочетают 9,9 мл PBS с 0,1 мл ФБС.
- Выполнитегенотипирование ПЦР для локуса Rosa26 m2rtTA: Выполнение реакции полимеразы Taq ДНК в соответствии с инструкциями изготовителя. Используйте изменение MgCl 2 -концентрация 3,5 мм и следующие 3 праймеров: oIMR8052: 5 'GCG AAG AGT ТТГ TCC TCA ACC 3', oIMR8545: 5'AAA GTC GCT CTG AGT TGT ТАТ 3 ', oIMR8546: 5' GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG 3 '. Велоспорт условия: 94 ° C в течение 3 мин; 35 циклов (94 ° С в течение 30 сек, 65 ° С в течение 1 мин, 72 ° С в течение 1 мин); 72 ° С в течение 2 мин; выдержка при 12 ° С. Ожидаемый размер продукта: 650 б.п. для аллеля дикого типа и 340 б.п. для мутантного аллеля.
- Выполните генотипирования ПЦР для локуса Коллаген-StemCa / OKSM: Выполнение реакции с полимеразы Taq ДНК в соответствии с указаниями. Используйте изменение MgCl 2 -концентрация 2,5 мм, а следующие 3 праймеров: цв / FRT-B: 5 'CCCTCCATGTGTGACCAAGG 3', цв / frtA1: 5 'GCACAGCATTGCGGACATGC 3', цв / frtC1: 5 'GCAGAAGCGCGGCCGTCTGG 3 '. Велоспорт условия: 95 ° C в течение 1 мин: 2 циклов (94 ° С в течение 30 с, 70 ° C в течение 45 сек), 6 циклов (94 ° С в течение 30 с, 68 ° C в течение 45 сек) и 30 циклов из (94 ° С в течение 20 сек, 60 ° С в течение 1 мин); 72 ° С в течение 5 мин; выдержка при 12 ° С. Ожидаемый размер продукта: 331 б.п. для аллеля дикого типа и 551 б.п. для мутантного аллеля.
- Выполнить все операции центрифугирования при 400 мкг в течение 3 мин при 4 ° С.
2 Генерация эмбриональных фибробластов мыши
- Выполните приуроченный спаривания между животным штамма OKSM с членом противоположного пола штамма m2rtTA. Урожай эмбрионов на день эмбрионального 13,5 по выбраковки мать и удаления рог матки. Перед удалением рога матки, спрей брюшной области с 80% раствором этанола, чтобы избежать микробного загрязнения.
- Передача рог матки в 10 см тканевой культуральной чашке, содержащей 10 мл стерильного фосфатно-солевом буфере (PBS). Используйте стерилизованные ножницы хирургические класса сократить рог матки на куски, содержащих один эмбрион (рисунок 3а, б).
- Используйте рассечение микроскоп (идеально расположен в ткани капот культуры) и стерилизованные щипцы осторожно удалите матки конверт и внеэмбриональной мембраны, окружающие каждый эмбрион. Передача каждого эмбриона в отдельном 10-см чашку с 10 мл PBS.
- Продолжать, удалив голову эмбриона, конечности, хвост и внутренние органы (сердце, печень, кишечник и т.д.) с помощью пинцета (рисунок 3C). Передача голову эмбриона в 1,5 мл пробирку и замораживают вниз таким образом, он может быть использован для генотипирования, если это необходимо.
- Трансфер туловище эмбриона в пустую 10см пластины и использовать два хирургических лезвия рубить эмбрион в течение 2 мин. Добавить 200 мкл трипсина / EDTA раствора в верхней части фарша эмбриона и инкубировать в течение 3-5 мин при комнатной температуре. Продолжить мясорубки в течение еще 2 мин, добавить 2 мл MEF СМИ в активировать трипсин, а затем передать в 15 мл трубки.
- Используйте 1000 мкл пипетки для дальнейшего механически отделить ткань, осторожно пипеткой. Трансфер в желатиновую покрытием 10 см блюдо и добавить дополнительный 10 мл MEF СМИ. Примечание: Оба гипоксическим и гипоксические инкубаторы могут быть использованы для культуры, относятся к дискуссии для получения дополнительной информации.
- После 24-48 часов пластина должна быть густо покрыты MEFs.
- С другой стороны, клетки могут быть затем дополнительно размножают или замораживают. Для замораживания клеток, удалить питательных сред, промыть блюдо с 10 мл PBS для удаления следов массовой информации и наложения с 3 мл трипсина / ЭДТА. Инкубировать в течение 3-5 мин при температуре 37 ° С, инактивируют трипсин-переваривание путем добавления 5 мл MEF информации и передачи в 15 мл центрифужную пробирку. Спин вниз и ресуспендируют осадок в 3 мл замораживания средств массовой информации. Переезд в 3 криопробирки и заморозить вниз в морозильной контейнера клеток.
3 Перепрограммирование MEFs
ove_content "> Примечание: Гранул клетки центрифугированием при 200 мкг в течение 5 мин при 4 ° С и использовать нормоксических культуры ткани инкубаторы для перепрограммирования Это может быть полезно для получения и расширения MEFs в условиях гипоксии (5% кислорода, см обсуждение для получения дополнительной информации. ).- Быстро разморозить низкий проход криопробирку (P0-P1, 2-3 Mio клетки) на водяной бане (37 ° C) и переместите содержимое в трубку 10 мл подогретого MEF СМИ. Пелле клетки, ресуспендируют в 12 мл свежих MEF СМИ, передать в желатиновую покрытием T75 сосуда для культивирования, и позволяют клеткам восстанавливаться в течение 24-48 часов, прежде чем продолжить. Примечание: MEFs также может быть использован непосредственно после вывода.
- После удаления культуральной среды, промыть MEFs с PBS и cellularize путем наложения раствором трипсин / ЭДТА (3 мл в течение 3-5 мин при температуре 37 ° С). Гасят трипсин путем добавления 5 мл MEF сред и далее диссоциации клеток при осторожном перемешивании с 10 мл пипетки. Определить число клеток с использованием гемоцитометра.
- Для reprogramming эксперименты, семян MEFs Онто покрытые желатином Т75 колбы в плотностях 6,7 х 10 3 клеток / см 2 (~ 0,5 Mio клеток на колбу) в ИПСК средах, содержащих 2 мкг / мл доксициклина. Обратитесь к Таблице 1, касающиеся рекомендации посева получить около 2 Mio перепрограммирования промежуточные продукты для каждого момента времени. Примечание: Перепрограммирование начинается с того доксициклина (2 мкг / мл) с добавлением средств массовой информации
- За первые 6 дней заменить СМИ каждый день со свежими доксициклин дополнен IPSC СМИ (12 мл средствах массовой информации в T75 колбу). За этой точкой продлить носитель на ежедневной основе, если есть большое число клеток. Удвоить объем культуры, если изменения медиа может быть выполнена только через день.
- Урожай перепрограммирования промежуточные в требуемых временных точках (предложение: Дни 3, 6, 9, 12), удалив СМИ, промывки соответствующим объемом PBS (10 мл для T75 колбу) и наложения раствором трипсина-ЭДТА (3 мл для T75 колбу). Выдержитев течение 3-5 мин при температуре 37 ° C и гасят путем добавления 5 мл Ipsc средах с последующим осторожным пипетированием.
- Количество суспензии клеток с помощью гемоцитометра (смотри выше), осадок центрифугированием, аспирации супернатант и ресуспендируют клеток в 10 мл PBS, чтобы удалить все следы трипсина. Гранул клетки вновь, аспирата супернатант и перейдите к шагу 4.1 изолировать перепрограммирования промежуточные. Примечание: Клетки, проходящие перепрограммирование может быть криоконсервированных и оттаивали для изоляции FACS на более позднем этапе.
- Чтобы установить полностью перепрограммировать плюрипотентных культур, роста клеток в DOX-бесплатно IPSC СМИ еще в течение 4-7 дней. Примечание: Успешно перепрограммирования культуры будет содержать большое количество колоний на 12 день (рисунок 4). В течение этого времени, аномальным плюрипотентных клеток, которые еще требуют OKSM выражение исчезнет.
- Кроме того, для распространения оставшиеся полностью перепрограммировать плюрипотентных культур: первоначально, семян облученных MEFs при плотности 15 х 10 3 клеток / см 2
- Далее, cellularize плюрипотентных клеточных культур путем удаления носителя промывки T75 колбу с 10 мл PBS, наложением с 3 мл раствора трипсина-ЭДТА и инкубировали в течение 3-5 мин при температуре 37 ° С. Quench трипсин, добавив 5 мл ИПСК СМИ с последующим осторожным перемешиванием, трансфер в 15 мл коническую трубку, спин вниз и затем ресуспендировали в 10 мл плюрипотентных СМИ.
- Передача 500 мкл этой клеточной суспензии на облученных MEFs (Т75 колбы) и позволяют культуры расти в течение 4-5 дней. Примечание: Установленные плюрипотентных культуры могут подвергнуть криоконсервации или использовать для экспериментов. Клональные клеточные линии могут быть получены путем выбора каждой колонии IPSC под микроскопом рассекает 22.
- Крио сохранить конфлюэнтных культур IPSC, как описано в 2.8 для MEFs.
4 Антитела Маркировка
- Ресуспендируйте клеточные гранулы перепрограммирования культур, подготовленные в разделе 3, вFACS-маркировки, дополненной антител (анти-Thy-1.2 Pacific Blue 1: 400, анти-SSEA-1 биотин 1: 400 и анти-EpCAM Fitc 1: 400). Используйте 200 мкл дополненной маркировки смеси на 5 млн клеток и инкубировать на льду.
- Через 10 мин осторожно нажать на трубу, чтобы ресуспендирования клеток и инкубируют в течение дополнительных 10 мин на льду. Добавьте 10 мл холодной PBS на пробирку и спином вниз.
- Для каждой трубки, чтобы быть окрашены подготовки 200 мкл маркировки средах с добавлением 1 мкл стрептавидин-PeCy7 (1: 200) за 5000000 клеток. Когда клетки осаждали, тщательно аспирата супернатант и ресуспендируют в соответствующем объеме маркировки среде с Streptavidin-PeCy7.
- Хранить клеток на льду в течение 10 мин, нажмите для ресуспендирования, инкубируют в течение еще 10 мин на льду, добавляют 10 мл холодного PBS на пробирку, спин вниз и аспирации супернатант.
- Ресуспендируют осадок клеток в маркировке средах с добавлением иодида пропидия (PI) (2 мкг / мл) примерно в 1 х 10 7 клеток / мл. Удалить скопления клеток пропусканием суспензии через сито 70 мкм. Передача клеток к соответствующему FACS трубы и держать их на льду.
- Подготовьте отдельные образцы с отдельных антител (анти-Thy-1.2, анти-SSEA-1 и анти-EpCAM). ПРИМЕЧАНИЕ: Они необходимы для выполнения цветовой компенсацию в трех каналов, используемых в анализе. Кроме того, немаркированные клетки необходимы для установки напряжения и ворота для сортировки. В идеале плюрипотентных клеток используются для компенсации: запасы 0,5-1 × 10 6 плюрипотентных клеток, поддерживаемых в облученных MEFs хранятся в криопробирки в жидком азоте. Наличие MEFs важно, чтобы получить сигнал в Thy-1.2 канал.
- Оттепель криопробирку из плюрипотентных клеток, как описано для MEFs (раздел 3). После центрифугирования ресуспендирования клеток в 800 мкл маркировки буфера и 200 мкл этого образца, выделено в качестве намеченного контроля.
- Используйте оставшиеся клетки в качестве контроля компенсации. Разделите клетки между тремя 15 мл пробирки и добавить антителследующим образом: Pacific Blue контроль компенсации: добавить 0,5 мкл анти-Thy-1.2 Pacific Blue антитела. Fitc компенсации трубки: добавить 0,5 мкл антитела анти-EpCAM-FITC. Пе-Cy7 контроль компенсации: 0,5 мкл анти SSEA-1-биотин антитела.
- Держите образцы клетки-антитела на льду в течение 10 мин, тщательно смешать и инкубировать в течение 10 мин на льду.
- Образцы Промыть 10 мл холодной PBS для удаления несвязанных антител, спина клетки вниз и аспирата супернатант. Ресуспендируйте клеточные осадки в 200 мкл FACS маркировки СМИ.
- Для анти-SSEA-1-биотин меченых образцов, добавить сопряженное Стрептавидин-PeCy7 (1 мкл на 200 мкл клеток). Этикетка клетки, как описано для первичного антитела (SSEA-1-биотин).
- Пройти все образцы, включая немеченым контроля через 70 мкм сито и добавить PI (2 мкг / мл). Трансфер клетки FACS труб и держать на льду пока не требуется.
5 FACS Выделение промежуточных
ПРИМЕЧАНИЕ:Клетки сортируются с использованием клеток с возбуждением флуоресценции сортировщик с 405 нм, 488 нм и 560 лазеров возбуждения нм и сопла 100 мкм.
- Настройка напряжения для переднего и бокового разброса, так что популяция клеток правильно визуализированы. Нарисуйте ворота вокруг клеток, как указано на рисунке 5А исключить мусор. Примечание: Правильный набор из напряжений на мобильный сортировщик может быть сложным и требует опытного оператора FACS.
- Использование Вперед разброс (FSC) высота по сравнению с FSC области, чтобы исключить агрегатов (Рисунок 5б).
- Визуализируйте PI канал против ФСБ к воротам в на PI негативных живых клеток (Рисунок 5С).
- Используйте немеченые клетки для регулировки напряжения для люминесцентных каналов PB, FITC / GFP, Пе-Cy7. В идеальном случае позиционировать клеточной популяции на нижнем конце соответствующего канала.
- Установите ворота с немеченых контрольных клеток, как показано на рисунке 6A, B, чтобы югу фракции перепрограммирование культовогоОЭС в День 3, 6 и 9 группы населения: SSEA-1 / Thy-1.2 + клеток; SSEA-1 / Thy-1.2- клетки; и перепрограммирование промежуточные SSEA-1 + / Thy-1.2- клетки.
- Далее разделить День 9 SSEA-1 + / Thy-1.2- фракция помощью Пе-Cy7 против FITC блоте; привлечь ворота вокруг Sse-А1 + / EpCAM + клеток и SSEA-1 + / Epcam- клеток. Установите ворота с немеченых контрольных клеток, как показано на рисунке 6С, D.
- Prefill соответствующие трубки сбора с плюрипотентных клеток СМИ (1-2 мл) до сортировки желаемых субпопуляции (рисунок 7 для представительных FACS профилей для MEFs, день 3 / День 6 / День 9 / День 12 культур и плюрипотентных клеток).
- Выполните FACS сортировки по производит протокол.
- После выделения FACS представить клетки молекулярного профилирования (РНК / извлечения белка, иммунопреципитации хроматина, ДНК methylome анализ и т.д.). Кроме того, различные клеточные фракции можно культивировать.
Representative Results
После вскрытия, разукрупнения и обшивки эмбриона E13.5 мыши, 10 см блюдо как ожидается, достигнет слияния в приблизительно от 1 до 2 дней. На данном этапе, это нормально для культуры, чтобы содержать некоторые прилипшие кусочки ткани, которые не были cellularized правильно. Они исчезнут после пассирования.
По индукции доксициклина, перепрограммирования MEFs пройти различные морфологические изменения. Вокруг 6 день, ранние колонии-как патчи должны начать появляться (рисунок 4C). Они будут продолжать расти в размерах при дальнейшем культуры (рис 4D, E). Хороший эксперимент перепрограммирование должны привести в> 500 колоний на T75, который был первоначально засеянного 5 х 10 5 клеток (рис 4д). Штатные культуры плюрипотентных обладают характерными купольного типа колоний и должны в основном быть лишен дифференцированных клеток (Рисунок 4F). Иногда дополнительные пассажи IPS Cultuразрешение может потребоваться удалить недифференцированные / частично перепрограммировать клетки; сливной колбу клеток могут быть разделены в соотношении 1:10 на фидерного слоя облученных MEFs.
Как упоминалось выше, морфологические и молекулярные изменения во время перепрограммирования отражаются от изменений в FACS профилей для Thy-1.2, SSEA-1 и в конечном итоге EpCAM (рисунок 7A-F). Как сообщалось ранее 12,15, в то время как MEFs преимущественно позитивным для Твоей-1.2 и отрицательным для других маркеров, день 3 культур уже выглядят заметно отличается. Большая часть клеток начали вниз-регулируют экспрессию Thy-1.2 и очень небольшое подмножество этих Thy-1.2 негативных клетках стать положительным для SSEA-1, фактическое перепрограммирования промежуточного для этого момент времени. Число промежуточных перепрограммирования, которые могут быть извлечены из 3-й день культуры очень непредсказуемы как процент SSEA-1 + / Thy-1.2-, как правило, лежит в диапазоне между 1-10% viablе клетки. На 6 и 9 Увеличение доли клеток SSEA-1 +, как правило, значительно выше 10%, могут быть обнаружены. Вокруг 12-й день подмножество SSEA-1 позитивных клеток могут быть обнаружены, что также маркировать положительным для EpCAM. День 12 культур, как 3-й день культуры, представляет собой узкое место в очистке промежуточных продуктов, как процент SSEA-1,2 + / + клеток EpCAM является переменной и, как правило, лежит в диапазоне от всего 2-4% всех живых клеток. Ожидаемое количество перепрограммирования промежуточных, представленных в таблице 1 служит лишь в грубом приближении. Штатные добросовестные клеточные культуры плюрипотентных будет сильно положительным для SSEA-1 и EpCAM.
Рис.1 Поверхностные изменения габаритных течение перепрограммирования пути: вниз-регулирование фибробластов идентичности маркера Твоего-1.2 следует регуляциюSSEA-1. Переход из подмножества SSEA-1 позитивных клеток к плюрипотентное состояние обозначается приобретение EpCAM вокруг 12-й день. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2 Схематическое представление перепрограммируемой модели мыши:. Выражение m2rtTA находится под контролем повсеместно активного Rosa26 локуса В присутствии доксициклина (DOX) белок m2rtTA связывается с тетрациклиновой зависимого промотора (tetOP) в коллагена 1A1 (COL1A1) локус в результате экспрессии четыре фактора кассеты. Два бицистронной кассеты соединены посредством сайта входа рибосомы (IRES). Открытые рамки считывания для Окт-4 / KLF-4 и Sox-2 / C-Myc являются фу SED по саморасщепляющиеся F2A и E2A последовательностей, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3 эмбрионов рассечение: (А) Передача рог матки в 10 см чашку, наполненную 10 мл PBS и (В) разрезают на куски, содержащие один эмбрион. (C), используя щипцы освободить эмбрионы из дополнительной эмбриональной ткани и удалить голову, конечности, хвост и внутренние органы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
ле / ftp_upload / 51728 / 51728fig4highres.jpg "ширина =" 500 "/>
Рисунок 4 Морфологические изменения при перепрограммировании. Колоний, как патчи становятся очевидными в культурах из 6-й день года. Добросовестный иПСК характеризуются куполообразной профилированного морфологии. (А) День 0 / MEFs, (B) День 3, (С) День 6, (D) День 9, (Е) День 12, (F), IPS клеточной культуре. Шкала бар:. 200 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5 Настройка Основные FACS. () Исключить мусора с боковым Scatter против Forward Scatter Площадь пятно. (В)Исключить агрегаты из не-мусора на гейт на одной клеточной популяции с Forward Scatter Площадь против Forward Scatter Верховного пятно. (C) Исключить мертвые клетки с одной популяции клеток путем стробирования с ИП низких событий с П. И. канала против Forward Scatter Площадь блот. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6 Память. (A, B) Используя немеченые контрольные клетки, установленные ворота для Твоей-1.2 + / SSEA-1- клеток, Твоих-1.2- / SSEA-1 клеток и Thy-1.2- / SSEA-1 + клетки. (C) Используйте немеченые контрольные клетки, чтобы установить ворота для EpCAM положительных и отрицательных EpCAM клеток. (D), SSEA-1 + / Thy-1.2- клетки могут быть отделеныв EpCAM положительной и в отрицательной населения EpCAM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 7 Thy-1.2 по сравнению с SSEA-1 FACS-блоттинга на различных этапах процесса перепрограммирования. (А) День 0 / MEFs, (B) День 3, (С) День 6, (D) День 9, (Е) День 12, культура клеток (F) IPS.
Таблица 1 Предлагаемые посева плотность, число колбу и ожидаемые результаты для P1 MEFs эмбриона гетерозиготных для OKSM и m2rtTA. Пожалуйста, нажмите часпрежде чем, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| День | Количество Т75 колбы засевали в день 0 | Общее количество Ssea1 + клеток после FACS | Общее количество Ssea1 + / EpCAM + клеток после FACS |
| 3 | 8 | 2000000 | |
| 6 | 4 | 2000000 | |
| 9 | 4 | 2000000 | |
| 12 | 10 | 10000000 | 2000000 |
Discussion
Для того, чтобы успешно перепрограммировать MEFs в плюрипотентных клеток и очистить перепрограммирования промежуточные на высоком количестве важно быть в курсе факторов, которые оказывают влияние на общую эффективность. В частности партия FBS используется в дополнение к плюрипотентных СМИ может иметь отрицательное влияние. В общих положительных впечатлений были сделаны с эмбриональными стволовыми квалифицированных FBS (ES) клеток, но пакетном тестирования сывороток от различных поставщиков может определить более дешевую альтернативу.
Другим фактором, который влияет на эффективность перепрограммирования является генотип MEFs 15,20. Хотя MEFs, полученных от мышей, гетерозиготных (HET) как для OKSM и локуса m2rtTA ли перепрограммировать, homozygousity на одном или обоих локусов приводит к более высокой эффективности перепрограммирования. Действительно, MEFs, полученные из потомства OKSM и m2rtTA крестов показывают увеличение эффективности перепрограммирования в следующем порядке (OKSM / m2rtTA): гет / гет <гомо / гет <гет / гомо <гомо /гомо (обратите внимание, что цифры, приведенные в таблице 1, для гет / гет животных). В тех редких случаях мужчины гомо / гомо животное идентифицировано, гарем спаривания с несколькими самками m2rtTA можно настроить. Все потомство от этих крестов будет Het / гомо для OKSM / m2rtTA локусов, соответственно. Кроме того, быстрое генотипирование пометов рекомендуется как крупные пометы получаются при использовании более молодых мышей для разведения (6-15 недельного возраста).
Кроме того, использование низких MEFs прохода для перепрограммирования подчеркивается 23. Если MEFs были получены и разложить в нормоксических культуры ткани инкубаторе мы настоятельно рекомендуем использовать только эти клетки до прохождения 2. Однако, если экспериментатор имеет доступ к инкубатора низкий кислорода (5% кислорода) для вывода и расширения MEFs, цифры выше, чем 3-прежнему будет приносить хорошие результаты 23 прохождение.
В случае экспериментатор сталкивается с проблемами, связанные с перепрограммированием, как указано, наиболее вероятные объяснения высокие цифры прохождение в момент DOX того, неправильное генотипа мышей или использования FBS, которая не способствует генерации IPS клеток. Тем не менее, в редких случаях мы наблюдали, что MEFs не смогли перепрограммировать даже при идеальных условиях. В этих случаях спонтанное заново удаление в открытой рамки считывания в m2rtTA был идентифицирован как основной причине.
Эта методика была успешно адаптирована для извлечения SSEA-1 + промежуточные через изоляции магнитного клеток (MACS). Существует явное преимущество времени при помощи MACS, однако, чистота SSEA-1 + клеточных популяций 'уменьшается до 80-90%, а не больше, чем 95%, что в зависимости от типа эксперимента клетки, предназначенные для может представлять проблемой. Таким образом, вариант заключается в использовании MACS для обогащения SSEA-1 + клеток с последующим FACS увеличить чистоту и / или доли их в SSEA-1 + / EpCAM + и SSEA-1 + / Epcam- клеток.
"> В то время как клетки плюрипотентных произведенные описанным протоколом и мышиной модели было показано, что плюрипотентные и эффективно содействовать всех тканях химерных животных 15,20, снижается способность производить эмбрионы полностью состоит из этих плюрипотентных клеток с помощью дополнения тетраплоидной был показали 24. Аберрантные метилирования на кластере генов Dlk-DIO3 были определены в качестве основной причины 24. Тем не менее, добавление аскорбиновой кислоты в концентрации 50 мкг / мл в СМИ во время перепрограммирования будет производить тетраплоид комплементации компетентные плюрипотентных клеток 24. Доводим до вашего сведения, что альтернативная модель перепрограммируемый мышь, сконструированные для экспрессии факторов перепрограммирования в другом стехиометрии может производить тетраплоидные компетентные плюрипотентных клеток даже в отсутствие лечения аскорбиновой кислоты 25. Тем не менее, в наших руках клеток из этого штамма перепрограммирует на значительно ниже частоты по сравнению к настоящей Методики используются режиме мышил.Методология, описанная в этой рукописи позволяет разделить перепрограммирования промежуточных от огнеупорной массы населения и должны рассматриваться как ценный инструмент разбираются и понять процесс перепрограммирования, удаляя предыдущие ограничения того, чтобы использовать unfractioned населения для профилирования (например, высокий шумовой сигнал от тугоплавких клеток). Сочетание описанных здесь антител позволяет выделения промежуточных продуктов из мышиных клеток с высокой степенью чистоты, однако, возможно, что дополнительные маркеры клеточной поверхности будут обнаружены в будущем, что позволит получить промежуточные продукты при еще более высокой чистоты. Пожалуйста, обратите внимание, что SSEA-1 выражение не является отличительным признаком человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток и, таким этом протоколе не может быть использован на перепрограммирование клетки человеческого происхождения. В заключение, перепрограммировать После выделения промежуточных продуктов с описанным способом, может быть использован для молекулярных анализов в том числе экспрессии Профилинг, хроматин иммунопреципитации, methylome анализа, и белковые анализы.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотели бы выразить признательность за финансовую поддержку от Larkins Программы Монаш, а также от NHMRC КОР и проектных грантов NHMRC. Кроме того, мы хотели бы поблагодарить Сью Mei Лим за ее конструктивные предложения, Эдвина McGlinn за ее поддержку и команды Монаш Flowcore (в частности Адама Dinsdale) за помощь в производстве видео.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse CD90.2 (Thy1.2) Pacific Blue | eBioscience | 48-0902-82 | |
| Anti-Human/Mouse SSEA-1 Biotin | eBioscience | 13-8813 | |
| Streptavidin PE-Cy 7 | eBioscience | 25-4317-82 | |
| Anti-Mouse CD326(Epcam) Fitc | eBioscience | 48-5791-82 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| Embryonic Stem Cell qualified Foetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10439024 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-070 | |
| β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140 | |
| Propidium Iodide solution (PI) | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | |
| Gelatine from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Doxycyclin hyclate | Sigma-Aldrich | 33429-100MG-R | |
| Leukemia Inhibitory Factor (LIF) | Millipore | ESG1107 | |
| DMEM High Glucose | Life Technologies | 11960-044 | |
| DPBS (Dulbecco's phosphate buffer saline) | Life Technologies | 14190-144 | |
| KnockOut DMEM | Life Technologies | 10829-018 | |
| Irradiated MEFs | Life Technologies | S1520-100 | |
| 75-cm2 Tissue culture flasks | Corning/BD Bioscience | 430641 | |
| 15-ml centrifuge tubes | Corning/BD Bioscience | 430791 | |
| 50-ml centrifuge tubes | Corning/BD Bioscience | 430829 | |
| Disposable surgical blades | Clifford Hallam | SM0501 | |
| Cryogenic vials | Corning/BD Bioscience | 430487 | |
| 70 µm Cell strainer | BD Bioscience | 352340 | |
| Taq DNA Polymerase | Life Technologies | 10342-020 |
References
- Matsui, Y., Zsebo, K., Hogan, B. L. Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture. Cell. 70, 841-847 (1992).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Stadtfeld, M., Maherali, N., Borkent, M., Hochedlinger, K. A reprogrammable mouse strain from gene-targeted embryonic stem cells. Nature Methods. 7, 53-55 (2010).
- Ebert, A. D., Svendsen, C. N. Human stem cells and drug screening: opportunities and challenges. Nature Reviews. Drug Discovery. 9, 367-372 (2010).
- Zhang, J., et al. A human iPSC model of Hutchinson Gilford Progeria reveals vascular smooth muscle and mesenchymal stem cell defects. Cell Stem Cell. 8, 31-45 (2011).
- Samavarchi-Tehrani, P., et al. Functional genomics reveals a BMP-driven mesenchymal-to-epithelial transition in the initiation of somatic cell reprogramming. Cell Stem Cell. 7, 64-77 (2010).
- Celià-Terrassa, T., et al. Epithelial-mesenchymal transition can suppress major attributes of human epithelial tumor-initiating cells. The Journal of Clinical Investigation. 122, 1849 (2012).
- Liao, B., et al. MicroRNA cluster 302–367 enhances somatic cell reprogramming by accelerating a mesenchymal-to-epithelial transition. Journal of Biological Chemistry. 286, 17359-17364 (2011).
- Cieślik, M., et al. Epigenetic coordination of signaling pathways during the epithelial-mesenchymal transition. Epigenetic., & Chromatin. 6, 1-22 (2013).
- Golipour, A., et al. A late transition in somatic cell reprogramming requires regulators distinct from the pluripotency network. Cell Stem Cell. 11, 769-782 (2012).
- Maherali, N., et al. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).
- Stadtfeld, M., Maherali, N., Breault, D. T., Hochedlinger, K. Defining molecular cornerstones during fibroblast to iPS cell reprogramming in mouse. Cell Stem Cell. 2, 230-240 (2008).
- Brambrink, T., et al. Sequential expression of pluripotency markers during direct reprogramming of mouse somatic cells. Cell Stem Cell. 2, 151-159 (2008).
- Wernig, M., et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448, 318-324 (2007).
- Polo, J. M., et al. A molecular roadmap of reprogramming somatic cells into iPS cells. Cell. 151, 1617-1632 (2012).
- Wright, A. J., Andrews, P. W. Surface marker antigens in the characterization of human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 3, 3-11 (2009).
- O'Malley, J., et al. High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells. Nature. , (2013).
- Hansson, J., et al. Highly coordinated proteome dynamics during reprogramming of somatic cells to pluripotency. Cell Reports. 2, 1579-1592 (2012).
- Stadtfeld, M., Maherali, N., Breault, D. T., Hochedlinger, K. Defining molecular cornerstones during fibroblast to iPS cell reprogramming in mouse. Cell Stem Cell. 2, 230-240 (2008).
- Stadtfeld, M., Maherali, N., Borkent, M., Hochedlinger, K. A reprogrammable mouse strain from gene-targeted embryonic stem cells. Nature Methods. 7, 53-55 (2009).
- Sommer, C. A., et al. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 27, 543-549 (2009).
- Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2, 3081-3089 (2007).
- Utikal, J., et al. Immortalization eliminates a roadblock during cellular reprogramming into iPS cells. Nature. 460, 1145-1148 (2009).
- Stadtfeld, M., et al. Ascorbic acid prevents loss of Dlk1-Dio3 imprinting and facilitates generation of all-iPS cell mice from terminally differentiated B cells. Nature Genetics. 44, 398-405 (2012).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 9, 588-598 (2011).
