Introduction
Embryonale stamceller (ES-celler) er utledet fra den indre cellemassen blastocyststadiet embryoer en. Under egnede kultur forhold de selv fornye og forbli pluripotent. I 2006 Yamanaka og kolleger vist at modne celler kan omprogrammeres til såkalte induserte pluripotente stamceller (iPS-celler) ved tvang uttrykk for transkripsjonsfaktorene Oct-4, Klf-4, Sox-2, c-Myc (OKSM) 2. IPS-celler, i likhet med ES-celler, kan gi opphav til alle celletyper i kroppen, men de er fri for de etiske begrensninger som omgir generering av ES-celler med 3. Videre iPS-celler bærer løfte om personlig regenerativ medisin og hold et enormt potensial for applikasjoner som sykdom modellering og in vitro narkotika screening 4,5. For omprogrammering teknologi for å realisere dette potensialet, må den grunnleggende mekanismen for atom omprogrammering å forstås fullt ut. Men arbeidet med å dissekere omprogrammering pathway har blitt hemmet av det faktum at bare et svært lite antall celler reprogram (0,1-1%). Vellykket omprogrammere fibroblaster har blitt rapportert å gjennomgå en tydelig serie av hendelser, inkludert en mesenchymale til epithelial overgang 6-10, og i sluttfasen av omprogrammering, aktivering av endogene kjerne pluripotency nettverk 11-14. Vi og andre 12,13,15-17 har nylig identifisert et sett av celleoverflatemarkører som gjør det mulig for separasjon av sjeldne mellomprodukter fra den ildfaste bulk populasjonen. Omprogrammering mus embryonale fibroblaster (MEFs) gjennomgår endringer i uttrykket av Thy-1.2, Ssea1 og EpCAM (blant annet) i løpet av to uker lange omprogrammering prosess 15. Tidlig under omprogrammere en undergruppe av MEFs ned-regulere uttrykk for fibroblast identitetsmarkør (Thy-1.2) og deretter begynne å uttrykke pluripotency-assosiert markør SSEA-1 12. Under sluttfasen av omprogrammering Ssea1-positive celler reaktispiste endogene pluripotency gener som Oct-4 10-13,15. Denne siste overgang er markert på celleoverflaten av detekterbar ekspresjon av EpCAM (se figur 1) eller på et senere stadium Pecam 15. Nylig rapporterte O'Malley et al. Bruk av CD44 og iCAM1 som alternativ eller komplementær til Thy-1.2 og SSEA-1 for identifisering av omprogrammering mellomprodukter. Vi har tidligere FACS hentet omprogrammering mellomprodukter fra dag 0, Dag 3, Dag 6, dag 9 og dag 12 omprogrammering kulturer, samt fra etablerte iPS-cellelinjer basert på disse celleoverflatemarkører 15,18. For den nedenfor beskrevne omprogrammering system og betingelser har vi vist på celle-nivået som selv om de populasjoner er stille homogent, er det en viss grad av heterogenitet i de identifiserte mellomliggende populasjoner. Det bør bemerkes at bare et delsett av celler i disse populasjonene er i stand til å gå videre til den respektive neste stage av omprogrammering prosessen og gi opphav til iPS cellekolonier på ulike effektivitet, som har blitt omfattende preget tidligere 15,19. Videre vil omprogrammering effektiviteten av disse populasjonene avhenge samt på re-plating og kulturforhold. For å øke eksperimentell reproduserbarhet vi bruker en reprogrammable mus stamme som har blitt utviklet for å uttrykke en transkripsjonen transactivator (m2rtTA) under kontroll av Rosa26 locus og en polycistronic OKSM kassett under kontroll av en doksycyklin responsiv promoter 20,21. Ved hjelp av denne musemodell omgår de uønskede bivirkninger av tradisjonelle virus metoder for iPS celle generasjon, dvs. en heterogen start befolkning med celle til celle variasjon i antall og plassering av integrasjons områder av virus inserts. To transgene musestammer (OKSM, m2rtTA), tilgjengelig som homozygot grunnlegger dyr på Jackson Laboratory, har må krysses for å etablere reprogrammable musemodell (se figur 2). I dette manuskriptet beskriver vi i detalj hvordan du utlede MEFs, generere iPS-celler, og isolere omprogrammering mellom på ulike stadier av konverteringsprosessen ved FACS.
Protocol
1. Instrument Innstillinger / Reagensforberedelse / Genotyping
- Forbered IPS cellemedium: Supplement 500 ml Knockout DMEM medier med 75 ml føtalt bovint serum (FBS), 5 ml L-glutamin, 5 ml, ikke-essensielle aminosyrer, 500 ul β-mercaptoethanol, 5 x 10 5 enheter leukemi-inhiberende faktor ( LIF). Vennligst referer til materialliste for produktet og kjøpsinformasjon for reagenser som brukes i sammenheng med dette manuskriptet.
- Forbered MEF medium: Supplement 500 ml DMEM medier med 50 ml FBS, 5 ml L-glutamin, 5 ml ikke-essensielle aminosyrer, 5 ml Natrium pyruvat, 500 ul β-mercaptoethanol.
- Forbered frysing medium: For 10 ml, kombinere 9 ml FBS med 1 ml DMSO.
- Forbered Gelatin belagt retter Legg 3-5 ml 0,1% porcine gelatinoppløsning til en T75 kolbe, inkuber ved romtemperatur i minst 10 min og aspireres rett før bruk.
- Forbered FACS merking medium: For 10 ml, kombinere 9,9 ml PBS med 0,1 ml av FBS.
- Utføren genotyping PCR for Rosa26 m2rtTA locus: Utfør reaksjoner med Taq DNA polymerase i henhold til produsentens instruksjoner. Bruk en modifisert MgCl2 -concentration av 3,5 mm og følgende tre primere: oIMR8052: 5 'GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC 3', oIMR8545: 5'AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT 3 ', oIMR8546: 5' GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG 3 '. Sykkel betingelser: 94 ° C i 3 min; 35 sykluser av (94 ° C i 30 sek, 65 ° C i 1 min, 72 ° C i 1 min); 72 ° C i 2 min; hold ved 12 ° C. Forventet Produkt størrelse: 650 bp for villtype-allelet og 340 bp for mutant allel.
- Utfør en genotyping PCR for Collagen-StemCa / OKSM locus: Utfør reaksjoner med Taq DNA polymerase i henhold til instruksjonene. Bruk en modifisert MgCl2 -concentration på 2,5 mm, og følgende tre primere: col / frt-B: 5 'CCCTCCATGTGTGACCAAGG 3', col / frtA1: 5 'GCACAGCATTGCGGACATGC 3', col / frtC1: 5 'GCAGAAGCGCGGCCGTCTGG 3 '. Sykkel betingelser: 95 ° C i 1 min: to sykluser av (94 ° C i 30 sek, 70 ° C i 45 sek), 6 sykluser (94 ° C i 30 sek, 68 ° C i 45 sek) og 30 sykluser på (94 ° C i 20 sek, 60 ° C i 1 min); 72 ° C i 5 min; hold ved 12 ° C. Forventet Produkt størrelse: 331 bp for villtype allel og 551 bp for mutant allel.
- Utføre alle sentrifugeringsfremgangsmåten ved 400 xg i 3 min ved 4 ° C.
2. Generering av mus embryonale Fibroblaster
- Utfør en tidsbestemt parring mellom et dyr av OKSM stamme med et medlem av det motsatte kjønn på m2rtTA belastning. Slakte embryoer på embryonale dag 13.5 ved culling mor og fjerne livmor horn. Før fjerning av livmorhornet, spray mageregionen med en 80% etanol-løsning, for å unngå mikrobiell kontaminering.
- Overfør den uterine horn inn i en 10 cm vevskultur-skål som inneholder 10 ml sterilt fosfatbufret saltvann (PBS). Bruk steriliserte kirurgisk karakter saks for å klippe livmor horn i biter som inneholder ett embryo (se figur 3A, B).
- Bruk en disseksjon mikroskop (ideelt plassert i en vev kultur hette) og sterilisert pinsett for å forsiktig fjerne livmor konvolutt og de ekstra-embryonale membraner som omgir hver embryo. Overfør hver embryo til en separat 10 cm skål med 10 ml PBS.
- Fortsett ved å fjerne fosteret hode, armer og ben, hale og indre organer (hjerte, lever, tarm etc.) med pinsett (se Figur 3C). Overfør embryoet hode inn i et 1,5 ml rør og fryse ned slik at den kan brukes for genotyping om nødvendig.
- Overfør embryo overkropp inn i en tom 10cm plate og bruke to kirurgiske kniver å hakke embryoet i 2 min. Tilsett 200 pl av trypsin / EDTA-oppløsning på toppen av hakket embryo og inkuberes i 3-5 min ved RT. Fortsett hakking for en ekstra 2 min, tilsett 2 ml MEF media til i aktivere trypsin, og deretter overføre til en 15 ml tube.
- Bruk en 1000 mL pipette til ytterligere mekanisk distansere vevet ved forsiktig pipettering. Overføring til en gelatin belagt 10 cm form og legg i ytterligere 10 ml av MEF medier. Merk: Begge normoksisk og hypoksiske inkubatorer kan brukes til kultur, se diskusjon for mer informasjon.
- Etter 24-48 timers platen bør være tett dekket med MEFs.
- Alternativt kan cellene kan deretter bli ytterligere formeres eller fryses ned. For frysing av celler, fjerne kulturmedier, skyll fatet med 10 ml PBS for å fjerne spor av media og overlay med 3 ml Trypsin / EDTA løsning. Inkuber i 3-5 minutter ved 37 ° C, inaktivere trypsin fordøyelse ved å tilsette 5 ml av MEF medier og overføring til en 15 ml sentrifuge røret. Spinn ned og resuspender pelleten i 3 ml frysemediet. Overfør til 3 kryorør og fryses ned i en celle frysebeholder.
3. omprogrammering av MEFs
ove_content "> MERK: Pellet cellene ved sentrifugering ved 200 xg i 5 min ved 4 ° C og bruke normoksisk vevskulturstudier inkubatorer for omprogrammering Det kan være gunstig å utlede og utvide MEFs henhold hypoksiske forhold (5% oksygen, se diskusjon for mer informasjon. ).- Raskt tine en lav passasje cryovial (P0-P1, 2-3 Mio-celler) i et vannbad (37 ° C) og overføre innholdet til et rør med 10 ml forvarmet MEF medier. Pellet celler, resuspender i 12 ml frisk MEF media, overføre til en gelatin belagt T75 kultur fartøy, og la cellene til å gjenopprette for 24-48 timer før du fortsetter. Merk: MEFs kan også brukes direkte etter derivasjon.
- Etter fjerning av kulturmedia, vaskes med PBS og MEFs cellularize ved over med en trypsin / EDTA-løsning (3 ml av 3-5 min ved 37 ° C). Quench trypsin ved å tilsette 5 ml av MEF medier og videre dissosierer celler ved forsiktig omrøring med en 10 ml pipette. Bestem celle tall ved hjelp av en hemocytometer.
- For reprogramming eksperimenter, frø MEFs bort på gelatin belagt T75 kolber med en tetthet på 6,7 x 10 3 celler / cm 2 (~ 0,5 Mio celler per flaske) i IPSC medier som inneholder 2 mikrogram / ml doksycyklin. Se Tabell 1 angående seeding anbefalinger for å få rundt 2 Mio omprogrammering mellomprodukter for hvert tidspunkt. Bemerk: Omprogrammering starter med tilsetning av doksycyklin (2 ug / ml) supplert medier
- For de første seks dagene erstatte media annenhver dag med frisk doksycyklin supplert IPSC media (12 ml av media per T75 kolbe). Utover dette punktet fornye mediet på en daglig basis dersom det er høye celleantall. Doble volumet kultur hvis medie endringer kan kun utføres hver alternative dag.
- Innhøsting omprogrammering mellomprodukter ved de nødvendige tidspunkter (Forslag: Days 3, 6, 9, 12) ved å fjerne media, skylling med passende volum av PBS (10 ml for en T75 kolbe) og overliggende med Trypsin-EDTA-løsning (3 ml for en T75 kolbe). Inkuberi 3-5 min ved 37 ° C og slukke ved å tilsette 5 ml av IPSC medier, etterfulgt av forsiktig pipettering.
- Tell cellesuspensjon med et hemocytometer (se ovenfor), pellet ved sentrifugering, Aspirer supernatanten og resuspender cellene i 10 ml PBS for å fjerne alle rester av trypsin. Pellet celler igjen, aspirer supernatant og fortsett med trinn 4.1 å isolere omprogrammering mellomprodukter. Merk: Celler som gjennomgår omprogrammering kan fryses ned og tines for FACS isolasjon på et senere tidspunkt.
- Å etablere fullt omprogrammeres iPS kulturer, vokse celler i DOX-free IPSC media i ytterligere 4-7 dager. Merk: Vellykket omprogrammering kulturer vil inneholde et stort antall kolonier på dag 12 (se figur 4). I løpet av denne tiden, vil avvik iPS-celler som fortsatt krever OKSM uttrykk forsvinne.
- Alternativt til å forplante de rester fullt omprogrammeres iPS kulturer: utgangspunktet, seede bestrålte MEFs med en tetthet på 15 x 10 3 celle / cm 2
- Deretter cellularize IPS cellekulturer ved å fjerne medium, skylling T75 kolbe med 10 ml PBS, belegge med 3 ml trypsin-EDTA-oppløsning, og inkubering i 3-5 min ved 37 ° C. Quench trypsin ved å tilsette 5 ml av IPSC medier, etterfulgt av forsiktig blanding, overføring til et 15 ml konisk rør, spinne ned, og deretter resuspendert i 10 ml iPS medier.
- Overfør 500 mL av denne cellesuspensjon på de bestrålte MEFs (T75 kolbe) og la kulturer å vokse i 4-5 dager. Merk: Etablerte iPS kulturer kan fryses ned eller brukes til eksperimenter. Klonal cellelinjer kan utledes ved å plukke enkelt IPSC kolonier under en disseksjonsmikroskop 22.
- Cryo bevare konfluente IPSC kulturer som beskrevet i 2.8 for MEFs.
4. Antistoff Merking
- Resuspender celle pellets av omprogrammering kulturer, som er utarbeidet i § 3 iFACS merking medier supplert med antistoffer (anti-Thy-1.2 Pacific Blue 1: 400, anti-Biotin SSEA-1 1: 400 og anti-EpCAM FITC 1: 400). Bruk 200 ul supplert merking blanding pr 5.000.000 celler og inkuber på is.
- Etter 10 min banke forsiktig på røret for å resuspendere cellene og inkuberes i ytterligere 10 min på is. Tilsett 10 ml kald PBS per tube og spinne ned.
- For hvert rør å bli farget forberede 200 pl av merking medier supplert med 1 pl streptavidin-PeCy7 (1: 200) 5 millioner celler pr. Når cellene har pelletert, nøye aspirer supernatanten og resuspender i en passende mengde merking media supplert med Streptavidin-PeCy7.
- Hold cellene på is i 10 min, trykk for å resuspendere, ruge for en annen 10 min på is, tilsett 10 ml kald PBS per tube, spinner ned og aspirer supernatant.
- Resuspender cellepellets i merking medier supplert med propidium jodid (PI) (2 ug / ml) ved omtrent 1 x 10 7 celler / ml. Fjern celle klumper ved å føre suspensjonen gjennom en 70 um sil. Overfør cellene til en passende FACS røret og holde dem på is.
- Forbered separate prøver med individuelle antistoffer (anti-Thy-1.2, anti-SSEA-1 og anti-EpCAM). MERK: Disse er nødvendig for å utføre farge kompensasjon i de tre kanalene som brukes i analysen. I tillegg er umerkede celler som trengs for å sette spenning og porter for sortering. Ideelt iPS celler brukes for kompensasjon: bestander av 0,5-1 x 10 6 iPS-celler holdt på bestrålte MEFs lagres i cryovials i flytende nitrogen. Tilstedeværelsen av MEFs er viktig for å få et signal i Thy-1.2-kanal.
- Tine en cryovial av iPS-celler som beskrevet for MEFs (§ 3). Etter sentrifugering, er resuspender celler i 800 mL av merking buffer og 200 mL av dette utvalget satt til side som den umerkede kontroll.
- Bruk de resterende cellene som kompensasjon kontroller. Divide celler mellom tre 15 ml rør og legge antistoffersom følger: Pacific Blue kompensasjon kontroll: Tilsett 0,5 mL av den anti-Thy-1.2 Pacific Blue antistoff. FITC kompensasjon tube: tilsett 0,5 mL av anti-EpCAM-FITC antistoff. Pe-Cy7 kompensasjon kontroll: 0,5 ul av anti SSEA-1-biotin-antistoff.
- Hold celle-antistoffprøvene på is i 10 minutter, bland ved å banke og inkuberes i 10 min på is.
- Vaskeprøver med 10 ml kald PBS for å fjerne ubundet antistoff, spinne celler ned og suge supernatanten. Suspender celle pellets i 200 mL av FACS merking medier.
- For anti-SSEA-1-Biotin merkede prøver, legge til en Streptavidin-PeCy7 konjugatvaksine (1 mL per 200 mL celler). Etikett celler som beskrevet for primære antistoff (SSEA-1-biotin).
- Før alle prøvene, inkludert den umerkede kontroll gjennom en 70 um sil og tilsett PI (2 ug / ml). Overfør cellene til FACS rør og holde på is inntil nødvendig.
5. FACS Isolering av mellomprodukter
MERK:Celler ble sortert ved hjelp av et Fluorescence Activated Cell Sorter med 405 nm, 488 nm og 560 nm eksitasjon lasere og en dyse 100 mikrometer.
- Sett opp spenninger for forover og sidespredning, slik at cellepopulasjonen er riktig visualisert. Tegn en gate rundt cellene som vist i figur 5A å utelukke rusk. Merk: Riktig satt opp av spenninger på cellen sorter kan være komplisert og krever en erfaren FACS operatør.
- Bruk Forward scatter (FSC) høyde versus FSC-området for å utelukke tilslag (Figur 5B).
- Visual PI kanal versus FSC til gate inn på PI negative levende celler (figur 5C).
- Bruk umerkede celler til å justere spenning for de fluoriserende kanaler med PB, FITC / GFP, Pe-Cy7. Ideelt posisjonere cellepopulasjonen ved den nedre ende av den respektive kanal.
- Sett porter med de umerkede kontrollcellene som vist i Figur 6A, B til sidefraksjon omprogrammering kulttiltak i dag 3, 6 og 9 populasjoner: SSEA-1 / Thy-1.2 + celler; SSEA-1 / Thy-1.2- celler; og omprogrammering mellomprodukter SSEA-en + / Thy-1.2- celler.
- Videre dele opp Dag 9 SSEA-1 + / Thy-1.2- brøkdel bruker Pe-Cy7 versus FITC blot; tegne gates rundt SSE-a1 + / EpCAM + celler og SSEA-en + / Epcam- celler. Sett porter med de umerkede kontrollcellene som vist i figur 6C, D.
- Forhåndsutfyll riktige innsamlings rør med iPS celle media (1-2 ml) før du sorterer de ønskede undergruppen (se Figur 7 for representative FACS profiler for MEFs, dag 3 / Dag 6 / Dag 9 / Dag 12 kulturer og iPS-celler).
- Utfør FACS sortering ifølge produserer protokollen.
- Etter FACS isolasjon sende celler til molekylær profilering (RNA / protein utvinning, kromatin immunoprecipitation, DNA methylome analyse etc.). Alternativt kan de forskjellige cellefraksjoner dyrkes.
Representative Results
Etter disseksjon, dekomponering og plettering av en E13.5 mus embryo, blir en 10 cm plate forventes å nå konfluens i omtrent 1 til 2 dager. På dette stadiet, er det normalt for kulturen til å inneholde noen tilhenger biter av vev som ikke er cellularized riktig. Disse vil forsvinne etter passaging.
Ved doksycyklin induksjon, omprogrammering MEFs gjennomgå forskjellige morfologiske endringer. Rundt dag 6, bør tidlige kolonilignende flekker begynner å dukke opp (figur 4C). Dette vil fortsette å vokse i størrelse ved nærmere kultur (se figur 4d, e). En god omprogrammering eksperiment bør resultere i> 500 kolonier per T75 som opprinnelig ble sådd med 5 x 10 5 celler (Figur 4E). Etablerte iPS kulturer besitter karakteristiske kuppel formet kolonier og bør stort sett være blottet for differensierte celler (figur 4F). Av og til, ekstra aging av iPS CULTUres kan bli pålagt å fjerne udifferensierte / delvis omprogrammeres celler; en kolbe av sammenflytende celler kan deles i et forhold på 1:10 mot en mate lag av bestrålte MEFs.
Som nevnt ovenfor, er morfologiske og molekylære forandringer under omprogrammering reflekteres av endringer i FACS-profiler for Thy-1.2, SSEA-1 og til slutt EpCAM (se Figur 7A-F). Som rapportert tidligere 12,15, mens MEFs er overveiende positive for Thy-1.2 og negative for de andre markører, dag 3 kulturer allerede ser markant annerledes. En stor andel av cellene har begynt å ned-regulere ekspresjon av Thy-1.2, og en svært liten undergruppe av disse Thy-1.2-negative celler er blitt positivt for SSEA-1, selve omprogrammering mellomprodukt for dette tidspunkt. Antallet omprogrammering mellomprodukter som kan hentes ut fra dag tre kulturer er svært uforutsigbar som prosentandelen av SSEA-1 + / Thy-1.2- vanligvis ligger i et område mellom 1-10% av viable celler. På dag 6 og 9 en økt prosentandel av SSEA-1 +-celler, vanligvis godt over 10%, kan detekteres. Rundt dag 12 en undergruppe av SSEA-1 positive celler kan oppdages at også merke positivt for EpCAM. Dag 12 kulturer, som dag tre kulturer, representerer en flaskehals i rensing av mellomprodukter, som prosentandelen av SSEA-1.2 + / EpCAM + celler er variabel og faller vanligvis i området fra bare 2-4% av alle levende celler. Forventet antall omprogrammering mellompresentert i tabell 1 kun fungerer som en grov tilnærming. Etablerte bona fide iPS cellekulturer vil være sterkt positivt for SSEA-1 og EpCAM.
Figur 1. overflate markør endringer i løpet av omprogrammering pathway: nedregulering av fibroblast identitetsmarkør Thy-1.2 er etterfulgt av oppregulering avSSEA-1. Overgangen av en undergruppe av SSEA-1 positive celler mot en pluripotent tilstand indikeres ved kjøp av EpCAM rundt dag 12. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Skjematisk fremstilling av reprogrammable musemodell:. M2rtTA uttrykk er under kontroll av ubiquitously aktiv Rosa26 locus I nærvær av doksycyklin (DOX) den m2rtTA proteinet binder seg til en tetracyklin avhengige promotor (tetOP) på kollagen 1A1 (Col1a1) locus som resulterer i ekspresjon av det fire-faktor kassett. To bicistronic kassetter er forbundet med en intern ribosomet oppføring hotellet (IRES). Åpne leserammer for Oct-4 / Klf-4 og Sox-2 / c-Myc er fu sed av selv spalte F2A og E2a sekvenser, henholdsvis. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Embryo disseksjon: (A) Overføring uterine horn inn i en 10 cm plate fylt med 10 ml PBS, og (B) kuttes i stykker som inneholder en embryo. (C) Bruk pinsett frigjøre embryoene fra ekstra embryonale vev og fjerne hodet, lemmer, hale og indre organer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
les / Ftp_upload / 51728 / 51728fig4highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 4. Morfologiske endringer under omprogrammering. Colony-lignende flekker bli tydelig i kulturer fra dag 6 og utover. Bona fide iPSCs er preget av et kuppelformet formet morfologi. (A) Dag 0 / MEFs, (B) Dag 3, (C) Dag 6, (D) Dag 9, (E) Dag 12, (F) Ips cellekultur. Målestokk:. 200 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Basic FACS oppsett. (A) Ekskluder rusk med sidespredning versus Forward Scatter området blot. (B)Ekskluder aggregater fra ikke-rusk ved gating på én celle befolkningen med Forward Scatter området versus Forward Scatter Høy blot. (C) Ekskluder døde celler fra én celle befolkningen ved gating på PI lave hendelser med PI kanal versus Forward Scatter området blott. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. gating. (A, B) Bruke de umerkede kontrollcellene satt opp porter for Thy-1.2 + / SSEA-1-celler, Thy-1.2- / SSEA-1 celler og Thy-1.2- / SSEA-1 + celler. (C) Bruk umerkede kontrollceller til å sette porter for EpCAM positive og EpCAM negative celler. (D) SSEA-1 + / Thy-1.2- celler kan skillesinn i en EpCAM positiv og inn i en EpCAM negativ befolkningen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Thy-1.2 versus SSEA-en FACS blotter på ulike stadier av omprogrammering prosessen. (A) Dag 0 / MEFs, (B) Dag 3, (C) Dag 6, (D) Dag 9, (E) Dag 12, (F) IPS cellekultur.
Tabell 1. Anbefalte seeding tetthet, kolbe nummer og forventet resultat for P1 MEFs av et embryo heterozygote for OKSM og m2rtTA. Vennligst klikk here for å se en større versjon av dette tallet.
| Day | Antall T75 kolber sådd på dag 0 | Totalt antall Ssea1 + celler etter FACS | Totalt antall Ssea1 + / EpCAM + celler etter FACS |
| 3 | 8 | 2 millioner | |
| 6 | 4 | 2 millioner | |
| 9 | 4 | 2 millioner | |
| 12 | 10 | 10 millioner | 2 millioner |
Discussion
For å kunne omprogrammere MEFs inn iPS-celler og å rense omprogrammering mellomprodukter i høy kvantitet er det viktig å være klar over faktorer som har innvirkning på den totale effektiviteten. Spesielt batch av FBS brukes til å supplere iPS media kan ha en skadelig effekt. Generelt gode erfaringer ble gjort med embryonale stamceller (ES) celler kvalifiserte FBS men satsvis testing av sera fra en rekke leverandører kan identifisere et billigere alternativ.
En annen faktor som påvirker om omprogrammering effektivitet er genotypen av MEFs 15,20. Selv MEFs avledet fra mus heterozygote (het) for både OKSM og m2rtTA locus ikke omprogrammere, homozygousity på en eller begge loci resulterer i høyere omprogrammering effektivitet. Faktisk MEFs stammer fra avkom av OKSM og m2rtTA kors viser en økning i omprogrammering effektivitet i følgende rekkefølge (OKSM / m2rtTA): het / het <homo / het <het / homo <homo /homo (vær oppmerksom på at tallene i tabell 1 er for het / het dyr). På den sjeldne anledningen en mannlig homo / homo dyret er identifisert, kan en harem parring med flere m2rtTA hunner settes opp. Alle avkom fra disse korsene vil bli het / homo for OKSM / m2rtTA loci, henholdsvis. I tillegg er den raske genotyping av kull anbefalt som større kull erholdes ved anvendelse av yngre mus for avl (6-15 uker gamle).
Videre er bruk av lave passasje MEFs for omprogrammering streket 23. Hvis MEFs ble avledet og utvidet i en normoksisk vev kultur inkubator vi anbefaler på det sterkeste å bare bruke disse cellene opp til passasje 2. Men hvis eksperimentator har tilgang til et lavt oksygen inkubator (5% oksygen) for avledning og utvidelse av MEFs, passasje tall så høyt som 3 vil fremdeles gi gode resultater 23.
I tilfelle eksperimentator møter problemer knyttet til omprogrammering, som beskrevet, de mest sannsynlige forklaringer er høye passasje tall på tidspunktet for DOX tillegg feil genotype av mus eller bruk av FBS som ikke bidrar til IPS cellegenerering. Men i sjeldne tilfeller vi observert at MEFs var ikke i stand til å omprogrammere selv under ideelle forhold. I disse tilfeller vil en spontan de novo sletting innenfor m2rtTA største åpne leseramme ble identifisert som den underliggende grunn.
Denne metoden ble vellykket tilpasset for å trekke SSEA-1 + mellom via magnetisk celleisolasjon (MACS). Det er en klar fordel i gang ved hjelp av MACS, er imidlertid SSEA-1 + celle-populasjoner 'renhet redusert til 80-90%, i stedet for mer enn 95%, som avhengig av type eksperiment cellene er bestemt for kan utgjøre et problem. Dermed er et alternativ å bruke MACS å berike for SSEA-1 + celler etterfulgt av FACS å øke renhet og / eller brøkdel dem inn SSEA-en + / EpCAM + og SSEA-1 + / Epcam- celler.
"> Mens IPS celler som produseres av den skisserte protokoll og musemodell har blitt vist å være pluripotent og effektivt medvirke til alle vev av kimære dyr 15,20, har en redusert evne til å produsere embryoer utelukkende består av disse iPS celler via tetraploid komplemente vært 24 viste. Aberrant metylering mønstre på DLK-DIØ3 clusteret har blitt identifisert som årsak 24. imidlertid vil tilsetningen av askorbinsyre i en konsentrasjon på 50 mikrogram / ml i mediet under omprogrammering produsere tetraploid komplemente kompetente celler 24 IPS. Vær oppmerksom på at en alternativ reprogrammable musemodell konstruert for å uttrykke omprogrammering faktorer på en annen støkiometri kan produsere tetraploide kompetente iPS-celler, selv i fravær av askorbinsyre behandling 25. Men i våre hender celler fra denne belastningen omprogrammere til betydelig lavere frekvens sammenlignet til det heri benyttes musemodusl.Metodikken er beskrevet i dette manuskriptet tillater separasjon av omprogrammering mellomprodukter fra den ildfaste parten av befolkningen, og bør bli sett på som verdifullt verktøy for å dissekere og forstå omprogrammering prosessen, fjerne de tidligere begrensningene av å måtte bruke en unfractioned befolkningen for profilering (f.eks, høyt signal støy fra de ildfaste celler). Antistoffet kombinasjon som her er beskrevet tillater isolering av mellomprodukter fra museceller ved høy renhetsgrad, men det er mulig at andre markører på celleoverflaten vil bli avdekket i fremtiden som vil tillate å oppnå mellomprodukter med enda høyere renhet. Vær oppmerksom på at SSEA-1 uttrykk er ikke et kjennetegn på menneskeskapte pluripotente stamceller og som sådan denne protokollen kan ikke brukes på omprogrammere celler av human opprinnelse. Som konklusjon kan omprogrammering gang isolerte mellomprodukter med den beskrevne fremgangsmåte kan brukes for molekylære analyser, inkludert ekspresjon profiling, kromatin Immunoutfellingsunder, methylome analyse, og proteinassay.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Vi ønsker å takke den økonomiske støtten fra Monash Larkins Program samt fra en NHMRC CDF og en NHMRC prosjektstøtte. Videre ønsker vi å takke Sue Mei Lim for hennes konstruktive forslag, Edwina McGlinn for hennes støtte og Monash Flowcore lag (særlig Adam Dinsdale) for deres hjelp i å produsere videoen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse CD90.2 (Thy1.2) Pacific Blue | eBioscience | 48-0902-82 | |
| Anti-Human/Mouse SSEA-1 Biotin | eBioscience | 13-8813 | |
| Streptavidin PE-Cy 7 | eBioscience | 25-4317-82 | |
| Anti-Mouse CD326(Epcam) Fitc | eBioscience | 48-5791-82 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| Embryonic Stem Cell qualified Foetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10439024 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-070 | |
| β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140 | |
| Propidium Iodide solution (PI) | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | |
| Gelatine from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Doxycyclin hyclate | Sigma-Aldrich | 33429-100MG-R | |
| Leukemia Inhibitory Factor (LIF) | Millipore | ESG1107 | |
| DMEM High Glucose | Life Technologies | 11960-044 | |
| DPBS (Dulbecco's phosphate buffer saline) | Life Technologies | 14190-144 | |
| KnockOut DMEM | Life Technologies | 10829-018 | |
| Irradiated MEFs | Life Technologies | S1520-100 | |
| 75-cm2 Tissue culture flasks | Corning/BD Bioscience | 430641 | |
| 15-ml centrifuge tubes | Corning/BD Bioscience | 430791 | |
| 50-ml centrifuge tubes | Corning/BD Bioscience | 430829 | |
| Disposable surgical blades | Clifford Hallam | SM0501 | |
| Cryogenic vials | Corning/BD Bioscience | 430487 | |
| 70 µm Cell strainer | BD Bioscience | 352340 | |
| Taq DNA Polymerase | Life Technologies | 10342-020 |
References
- Matsui, Y., Zsebo, K., Hogan, B. L. Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture. Cell. 70, 841-847 (1992).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Stadtfeld, M., Maherali, N., Borkent, M., Hochedlinger, K. A reprogrammable mouse strain from gene-targeted embryonic stem cells. Nature Methods. 7, 53-55 (2010).
- Ebert, A. D., Svendsen, C. N. Human stem cells and drug screening: opportunities and challenges. Nature Reviews. Drug Discovery. 9, 367-372 (2010).
- Zhang, J., et al. A human iPSC model of Hutchinson Gilford Progeria reveals vascular smooth muscle and mesenchymal stem cell defects. Cell Stem Cell. 8, 31-45 (2011).
- Samavarchi-Tehrani, P., et al. Functional genomics reveals a BMP-driven mesenchymal-to-epithelial transition in the initiation of somatic cell reprogramming. Cell Stem Cell. 7, 64-77 (2010).
- Celià-Terrassa, T., et al. Epithelial-mesenchymal transition can suppress major attributes of human epithelial tumor-initiating cells. The Journal of Clinical Investigation. 122, 1849 (2012).
- Liao, B., et al. MicroRNA cluster 302–367 enhances somatic cell reprogramming by accelerating a mesenchymal-to-epithelial transition. Journal of Biological Chemistry. 286, 17359-17364 (2011).
- Cieślik, M., et al. Epigenetic coordination of signaling pathways during the epithelial-mesenchymal transition. Epigenetic., & Chromatin. 6, 1-22 (2013).
- Golipour, A., et al. A late transition in somatic cell reprogramming requires regulators distinct from the pluripotency network. Cell Stem Cell. 11, 769-782 (2012).
- Maherali, N., et al. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).
- Stadtfeld, M., Maherali, N., Breault, D. T., Hochedlinger, K. Defining molecular cornerstones during fibroblast to iPS cell reprogramming in mouse. Cell Stem Cell. 2, 230-240 (2008).
- Brambrink, T., et al. Sequential expression of pluripotency markers during direct reprogramming of mouse somatic cells. Cell Stem Cell. 2, 151-159 (2008).
- Wernig, M., et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448, 318-324 (2007).
- Polo, J. M., et al. A molecular roadmap of reprogramming somatic cells into iPS cells. Cell. 151, 1617-1632 (2012).
- Wright, A. J., Andrews, P. W. Surface marker antigens in the characterization of human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 3, 3-11 (2009).
- O'Malley, J., et al. High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells. Nature. , (2013).
- Hansson, J., et al. Highly coordinated proteome dynamics during reprogramming of somatic cells to pluripotency. Cell Reports. 2, 1579-1592 (2012).
- Stadtfeld, M., Maherali, N., Breault, D. T., Hochedlinger, K. Defining molecular cornerstones during fibroblast to iPS cell reprogramming in mouse. Cell Stem Cell. 2, 230-240 (2008).
- Stadtfeld, M., Maherali, N., Borkent, M., Hochedlinger, K. A reprogrammable mouse strain from gene-targeted embryonic stem cells. Nature Methods. 7, 53-55 (2009).
- Sommer, C. A., et al. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 27, 543-549 (2009).
- Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2, 3081-3089 (2007).
- Utikal, J., et al. Immortalization eliminates a roadblock during cellular reprogramming into iPS cells. Nature. 460, 1145-1148 (2009).
- Stadtfeld, M., et al. Ascorbic acid prevents loss of Dlk1-Dio3 imprinting and facilitates generation of all-iPS cell mice from terminally differentiated B cells. Nature Genetics. 44, 398-405 (2012).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 9, 588-598 (2011).
