Introduction
Embryonale stamceller (ES-celler) er afledt fra den indre cellemasse af blastocyst embryoer 1. Under passende dyrkningsbetingelser de selv forny og forblive pluripotente. I 2006 demonstrerede Yamanaka og kolleger, at modne celler kan omprogrammeres i såkaldt induceret pluripotente stamceller (iPS-celler) ved tvungen ekspression af transskriptionsfaktorerne Oct-4, Klf-4, Sox-2, C-Myc (OKSM) 2. iPS-celler, som ES-celler, kan give anledning til alle celletyper i kroppen, men de er fri for de etiske begrænsninger omkring generation af ES-celler 3. Desuden iPS celler bærer løftet om personlig regenerativ medicin og hold enormt potentiale for applikationer som sygdomsmodeller og in vitro lægemiddel screening 4,5. For omprogrammering teknologi til at opfylde dette potentiale, den grundlæggende mekanisme af nukleart omprogrammering skal være fuldt forstået. Imidlertid har indsatsen dissekere omprogrammering patHway er blevet vanskeliggjort af, at kun et meget lille antal celler omprogrammere (0,1-1%). Succesfuld omprogrammering fibroblaster er blevet rapporteret til at gennemgå en særskilt række begivenheder, herunder en mesenkymale til epitelial overgang 6-10, og i de sidste stadier af omprogrammering, aktivering af det endogene kerne pluripotens netværk 11-14. Vi og andre 12,13,15-17 har for nylig identificeret et sæt af celleoverflade-markører, der giver mulighed for adskillelse af sjældne mellemprodukter fra den ildfaste bulkpopulation. Omprogrammering muse embryonale fibroblaster (MEF) undergå ændringer i ekspressionen af Thy-1.2 Ssea1 og EpCAM (blandt andre) i løbet af 2 uger lange omprogrammering proces 15. Tidligt i løbet af omprogrammering en delmængde af MEF'er nedregulerer ekspressionen af fibroblast identitetsmarkør (Thy-1.2) og derefter starte udtrykker pluripotens-associerede markør SSEA-1 12. I de afsluttende faser af omprogrammering Ssea1-positive celler reactivspiste endogene pluripotency gener, såsom oktober-4 10-13,15. Denne sidste overgang er markeret på celleoverfladen ved påviselig ekspression af EpCAM (se figur 1) eller på et senere tidspunkt PECAM 15. For nylig, O'Malley et al. Rapporterede brug af CD44 og ICAM1 som alternativer eller komplementære til Thy-1.2 og SSEA-1 for identifikation af omprogrammering mellemprodukter. Vi har tidligere FACS udvundet omprogrammering mellemprodukter fra dag 0, Dag 3, Dag 6 Dag 9 og Dag 12 omprogrammeringsbeslutninger kulturer, samt fra etablerede iPS cellelinier baseret på disse celleoverflademarkører 15,18. Af de nedenfor nævnte omprogrammering systemet og betingelser har vi vist på enkelt celle niveau, selvom befolkningerne er stille homogen, er der en vis grad af heterogenitet i de identificerede mellemliggende befolkninger. Det skal bemærkes, at kun en delmængde af celler i disse populationer er i stand til at gå videre til det respektive næste stage af omprogrammering processen og giver anledning til iPS-celle kolonier på forskellige effektivitetsgevinster, der er blevet grundigt karakteriseret tidligere 15,19. Desuden vil omprogrammering effektiviteten af disse populationer er afhængige så godt på de genindførte plating og dyrkningsbetingelser. At øge eksperimentelle reproducerbarhed bruger vi en reprogrammable mus stamme, der er blevet manipuleret til at udtrykke en transkriptionel transaktivator (m2rtTA) under kontrol af Rosa26 locus og en polycistronisk OKSM kassette under kontrol af en doxycyclin responsiv promotor 20,21. Brug af denne musemodel omgår de uønskede bivirkninger af traditionelle virale metoder til iPS-celle generation, dvs en heterogen udgangspunkt befolkning med celle til variabilitet celle i antallet og placeringen af integration lokaliteter af virale skær. To transgene musestammer (OKSM, m2rtTA), fås som homozygote Stamdyrene på Jackson Laboratory, der skal krydses for at etablere reprogrammable musemodel (se figur 2). I dette manuskript, vi beskriver i detaljer, hvordan man kan udlede MEF'er, generere iPS-celler og isolere de omprogrammeringsbeslutninger mellemprodukter på forskellige stadier af omstillingsprocessen FACS.
Protocol
1. Instrument indstillinger / Reagensforberedelse / Genotypning
- Forbered iPS cellemedium: Supplement 500 ml Knockout DMEM medier med 75 ml føtalt bovint serum (FBS), 5 ml L-glutamin, 5 ml ikke-essentielle aminosyrer, 500 pi β-mercaptoethanol, 5 x 10 5 enheder leukæmi inhibitorisk faktor ( LIF). Der henvises til Materialer liste til produkt og købe oplysninger om reagenser, der anvendes i forbindelse med dette manuskript.
- Forbered MEF medium: Supplement 500 ml DMEM-medium med 50 ml FBS, 5 ml L-glutamin, 5 ml ikke-essentielle aminosyrer, 5 ml natriumpyruvat, 500 pi β-mercaptoethanol.
- Forbered frysemedium: Til 10 ml kombinere 9 ml FBS med 1 ml DMSO.
- Forbered Gelatine skåle coatet Tilføj 3-5 ml 0,1% porcint gelatineopløsning til en T75 kolbe, der inkuberes ved stuetemperatur i mindst 10 minutter og aspireres lige før brug.
- Forbered FACS mærkning medium: Til 10 ml, kombinere 9,9 ml PBS med 0,1 ml FBS.
- Udføren genotypebestemmelse PCR for Rosa26 m2rtTA locus: Udfør reaktioner med Taq DNA-polymerase i henhold til producentens anvisninger. Brug en modificeret MgCl2 -koncentrationen på 3,5 mM, og følgende 3 primere: oIMR8052: 5 'GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC 3', oIMR8545: 5'AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT 3 ', oIMR8546: 5' GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG 3 '. Cykling betingelser: 94 ° C i 3 minutter; 35 cykler af (94 ° C i 30 sek, 65 ° C i 1 min, 72 ° C i 1 min); 72 ° C i 2 minutter; hold ved 12 ° C. Forventet produkt størrelse: 650 bp til vildtypeallelen og 340 bp for mutantallelen.
- Udfør en genotypebestemmelse PCR for collagen-StemCa / OKSM locus: Udfør reaktioner med Taq DNA-polymerase som pr instruktioner. Brug en modificeret MgCl2 -koncentrationen af 2,5 mM og følgende 3 primere: col / FRT-B: 5 'CCCTCCATGTGTGACCAAGG 3', col / frtA1: 5 'GCACAGCATTGCGGACATGC 3', col / frtC1: 5 'GCAGAAGCGCGGCCGTCTGG 3 '. Cycling betingelser: 95 ° C i 1 min: 2 cykler af (94 ° C i 30 sek, 70 ° C i 45 sekunder), 6 cykler af (94 ° C i 30 sek, 68 ° C i 45 sekunder) og 30 cykler af (94 ° C i 20 sek, 60 ° C i 1 min); 72 ° C i 5 minutter; hold ved 12 ° C. Forventet produkt størrelse: 331 bp til vildtypeallelen og 551 bp for mutantallelen.
- Foretag alle centrifugeringstrin ved 400 xg i 3 minutter ved 4 ° C.
2. Generering af mus embryofibroblaster
- Udfør en tidsindstillet parring mellem et dyr af den OKSM stamme med et medlem af det modsatte køn m2rtTA stamme. Harvest embryoner på embryonal dag 13,5 ved nedslagning moderen og fjerne livmoderhorn. Forud for fjernelse af livmoderhorn, spray maveregionen med en 80% ethanol opløsning, for at undgå mikrobiel forurening.
- Overfør uterushornet i en 10 cm vævsdyrkningsskål indeholdende 10 ml sterilt phosphatbufret saltvand (PBS). Brug steriliserede kirurgiske karakteren saks til at klippe uterushornet i stykker indeholdende et embryon (se figur 3A, B).
- Brug en dissektion mikroskop (ideelt placeret i en vævskultur hætte) og steriliserede pincet til forsigtigt at fjerne livmoderen kuvert og de ekstra-embryonale membraner, der omgiver hvert foster. Overfør hver embryo til en separat 10 cm skål med 10 ml PBS.
- Fortsæt ved at fjerne fosterets hoved, lemmer, hale og indre organer (hjerte, lever, tarm etc.) med tangen (se figur 3C). Overfør fosterets hoved i et 1,5 ml rør og fryse ned, så det kan anvendes til genotypebestemmelse, hvis nødvendigt.
- Overfør embryonet torso i en tom 10cm plade og bruge to kirurgiske knive til at hakke embryo i 2 min. Tilsæt 200 pi af trypsin / EDTA-opløsning på toppen af hakket embryoner og inkuberes i 3-5 minutter ved stuetemperatur. Fortsæt med hakning i yderligere 2 min, tilsættes 2 ml af MEF medier i aktivere trypsin, og derefter overføre til et 15 ml rør.
- Brug en 1.000 gl pipette til yderligere mekanisk dissociere vævet ved forsigtig pipettering. Overførsel til en gelatine belagt 10 cm skål og tilføje en ekstra 10 ml MEF medier. Bemærk: Både normoxiske og hypoxiske kuvøser kan bruges til kultur, henvises til diskussion for mere information.
- Efter 24-48 timer pladen bør tæt dækket med MEF.
- Alternativt kan cellerne derefter formeres yderligere eller frosset ned. For indefrysning af celler, skal du fjerne dyrkningsmedier, skylles skål med 10 ml PBS for at fjerne spor af medier og overlay med 3 ml trypsin / EDTA-opløsning. Inkuber i 3-5 min ved 37 ° C, inaktivere trypsinfordøjelse ved tilsætning af 5 ml MEF medier og overføres til et 15 ml centrifugerør. Spin ned, og pellet resuspenderes i 3 ml frysning medier. Overførsel til 3 kryoglas og fryse ned i en celle frysning beholder.
3. Omprogrammering af MEF'er
ove_content "> BEMÆRK: Udpelleter cellerne ved centrifugering ved 200 xg i 5 min ved 4 ° C og brug normoxiske vævskultursystemer inkubatorer til omprogrammering Det kan være gavnligt at udlede og udvide MEF'er under hypoxiske betingelser (5% ilt, se diskussionen for mere information. ).- Hurtigt tø en lavpassage cryovialet (P0-P1, 2-3 mio celler) i et vandbad (37 ° C), og indholdet overføres til et rør med 10 ml forvarmet MEF medier. Pellet celler resuspenderes i 12 ml frisk MEF medier, overførsel til en gelatine belagt T75 kultur fartøj, og tillade celler til at komme sig i 24-48 timer, før du fortsætter. Bemærk: MEF'er kan også anvendes direkte efter afledning.
- Efter fjernelse af dyrkningsmedier, vask MEF'er med PBS og cellularize ved overlejring med en trypsin / EDTA-opløsning (3 ml i 3-5 min ved 37 ° C). Quench trypsin ved tilsætning af 5 ml af MEF medier og yderligere dissociere celler ved forsigtig blanding med en 10 ml pipette. Bestem celle numre ved hjælp af et hæmocytometer.
- For reprogramming eksperimenter frø MEF'er onto gelatineovertrukne T75 kolber ved densiteter på 6,7 x 10 3 celler / cm 2 (~ 0.5 mio celler pr kolbe) i IPSC medier indeholdende 2 pg / ml doxycyclin. Se Tabel 1 om såning anbefalinger for at opnå omkring 2 mio omprogrammering mellemprodukter til hvert tidspunkt. Bemærk: Omprogrammering begynder med tilsætning af doxycyclin (2 mg / ml) suppleret medier
- For de første 6 dage erstatte medier hver anden dag med frisk doxycyclin suppleret IPSC medier (12 ml medium pr T75 kolbe). Ud over dette punkt forny medier på daglig basis, hvis der er høje celletal. Dobbelte volumen kulturen hvis medieændringer kun kan udføres hver anden dag.
- Høst omprogrammering mellemprodukter på de krævede tidspunkter (forslagskasser: Dage 3, 6, 9, 12) ved at fjerne medier, skylning med passende volumen af PBS (10 ml til en T75 kolbe), og overlejring med trypsin-EDTA-opløsning (3 ml til en T75 kolbe). Inkuberi 3-5 min ved 37 ° C og slukke ved tilsætning af 5 ml af IPSC medier efterfulgt af forsigtig pipettering.
- Tæl cellesuspension med et hæmocytometer (se ovenfor), pellet ved centrifugering aspireres supernatanten og resuspender cellerne i 10 ml PBS for at fjerne alle spor af trypsin. Bundfælde cellerne igen, aspireres supernatanten og fortsætte med trin 4.1 at isolere omprogrammering mellemprodukter. Bemærk: Celler undergår omprogrammering kan være kryopræserveres og optøet til FACS isolation på et senere tidspunkt.
- At etablere fuldt omprogrammerede iPS kulturer, dyrke celler i DOX-fri IPSC medier i yderligere 4-7 dage. Bemærk: Succesfuld omprogrammering kulturer vil indeholde et stort antal kolonier efter dag 12 (se figur 4). I løbet af denne tid, vil afvigende iPS-celler, der stadig kræver OKSM udtryk forsvinde.
- Alternativt at udbrede de resterende fuldt omprogrammeres iPS kulturer: Indledningsvis frø bestrålede MEF ved en densitet på 15 x 10 3 celler / cm2
- Dernæst cellularize iPS cellekulturer ved fjernelse af medier, skylning af T75-kolbe med 10 ml PBS, overlejring med 3 ml trypsin-EDTA-opløsning og inkubering i 3-5 minutter ved 37 ° C. Quench trypsin ved tilsætning af 5 ml IPSC medier efterfulgt af forsigtig blanding, overførsel til en 15 ml konisk rør, spin ned og derefter resuspenderet i 10 ml iPS medier.
- Overfør 500 ul af denne cellesuspension på de bestrålede MEF'er (T75 kolbe), og lad kulturerne vokse i 4-5 dage. Bemærk: Etablerede iPS kulturer kan være kryopræserveres eller anvendes til forsøg. Kloncellelinjer kan afledes ved at vælge individuelle IPSC kolonier under et dissektionsmikroskop 22.
- Cryo bevare sammenflydende IPSC kulturer som beskrevet i 2.8 for MEF.
4. antistofmærkning
- Resuspender cellepellets af omprogrammering kulturer, som fremstillet i afsnit 3, iFACS-mærkning medier suppleret med antistoffer (anti-Thy-1.2 Pacific Blue 1: 400, anti-SSEA-1 biotin 1: 400 og anti-EpCAM FITC 1: 400). Brug 200 pi suppleret mærkningsblandingen per 5 millioner celler og inkuberes på is.
- Efter 10 minutter forsigtigt trykke røret for at opblande cellerne og inkuberes i yderligere 10 minutter på is. Der tilsættes 10 ml kold PBS pr rør og spin ned.
- Til hvert rør, der skal farves forberede 200 pi mærkning medier suppleret med 1 pi streptavidin-PeCy7 (1: 200) per 5 millioner celler. Når cellerne er pelleteret omhyggeligt aspireres supernatanten og resuspender i et passende volumen af etiketmediet suppleret med Streptavidin-PeCy7.
- Hold celler på is i 10 minutter, skal du trykke for at opblande, inkuberes i yderligere 10 minutter på is, tilsæt 10 ml kold PBS pr rør, spin ned og aspirat supernatanten.
- Resuspender cellepellets i mærkning medier suppleret med propidiumiodid (PI) (2 ug / ml) ved cirka 1 x 10 7 celler / ml. Fjern celleklumper ved at passere suspensionen gennem en 70 um si. Overfør celler til en passende FACS rør og holde dem på is.
- Der forberedes særskilte prøver med individuelle antistoffer (anti-Thy-1.2, anti-SSEA-1 og anti-EpCAM). BEMÆRK: Disse er forpligtet til at udføre farve kompensation i de tre kanaler, der bruges i analysen. Desuden er umærkede celler nødvendige for at indstille spændinger og porte til sortering. Ideelt er iPS-celler, der anvendes til kompensation: lagre af 0,5-1 x 10 6 iPS celler opretholdt på bestrålede MEF gemmes i kryoglas i flydende kvælstof. Tilstedeværelsen af MEF'er er afgørende for at få et signal i Thy-1.2 kanal.
- Tø en cryovialet af iPS-celler som beskrevet for MEF'er (afsnit 3). Efter centrifugering resuspender cellerne i 800 pi mærkning puffer og 200 pi af denne prøve afsat som det umærkede kontrol.
- Brug de resterende celler som kontroller kompensation. Opdel celler mellem tre 15 ml rør og tilføje antistoffersom følger: Pacific Blue kompensation kontrol: Tilsæt 0,5 ul af anti-Thy-1.2 Pacific Blue antistof. FITC kompensation rør: Tilsæt 0,5 ul af anti-EpCAM-FITC-antistof. Pe-Cy7 kompensation kontrol: 0,5 ul af anti SSEA-1-biotin antistof.
- Hold celle-antistof-prøver på is i 10 minutter, blandes ved at trykke og inkuberes i 10 minutter på is.
- Vask prøver med 10 ml kold PBS for at fjerne ubundet antistof, spinde cellerne ned og aspireres supernatanten. Resuspender cellepellets i 200 pi FACS etiketmediet.
- For anti-SSEA-1-Biotin mærkede prøver, tilføje en streptavidin-PeCy7 konjugat (1 pi pr 200 celler ul). Label-celler som beskrevet for det primære antistof (SSEA-1-biotin).
- Pass alle prøver inklusive umærkede kontrol gennem en 70 um si og tilsæt PI (2 mg / ml). Overfør celler til FACS-rør og holde på is, indtil det kræves.
5. FACS Isolering af mellemprodukter
BEMÆRK:Celler sorteres ved hjælp af en Fluorescence Activated Cell Sorter med 405 nm, 488 nm og 560 nm excitation lasere og en 100 um dyse.
- Opsæt spændingerne for fremad og sidespredning således at cellen befolkningen er korrekt visualiseret. Tegn en gate omkring celler som vist i figur 5A for at udelukke snavs. Bemærk: Den korrekte opsætning af spændinger på cellesorteringsapparatet kan være kompleks og kræver en erfaren FACS operatør.
- Brug scatter Fremad (FSC) højde versus FSC område at udelukke aggregater (figur 5B).
- Visualiser PI kanal versus FSC til gate ind på PI negative levende celler (figur 5C).
- Brug umærkede celler til at justere spænding de fluorescerende kanaler PB FITC / GFP Pe-Cy7. Ideelt placere cellepopulation ved den nedre ende af den respektive kanal.
- Indstil porte med de umærkede kontrol celler som vist i figur 6A, B til sub fraktion omprogrammering kultstaltninger til dag 3, 6 og 9 populationer: SSEA-1 / Thy-1.2 + celler; SSEA-1 / Thy-1.2- celler; og omprogrammering mellemprodukter SSEA-1 + / Thy-1.2- celler.
- Yderligere underinddele Dag 9 SSEA-1 + / Thy-1.2- fraktion ved hjælp af Pe-Cy7 versus FITC blot; trække porte omkring SSØ-A1 + / EpCAM + celler og SSEA-1 + / Epcam- celler. Indstil porte med umærkede kontrol celler som vist i figur 6C, D.
- Prefill passende rør kollektion med iPS-celle medier (1-2 ml), før sorteringen de ønskede delpopulationer (se figur 7 for repræsentative FACS profiler til MEF'er, Dag 3 / Dag 6 / Dag 9 / Dag 12 kulturer og iPS-celler).
- Udfør FACS sortering efter fremstiller protokol.
- Efter FACS isolation indgive celler til molekylær profilering (RNA / protein-ekstraktion, kromatin immunofældning DNA methylome analyse etc.). Alternativt kan de forskellige cellefraktioner dyrkes.
Representative Results
Efter dissektion, opsplitning og forkromning af en E13.5 museembryo forventes en 10 cm skål at nå sammenflydning i ca 1 til 2 dage. På dette stadium, er det normalt, at kulturen indeholder nogle vedhængende stykker af væv, der ikke er blevet cellularized korrekt. Disse vil forsvinde efter passage.
Ved doxycyclin induktion, omprogrammering MEF gennemgå forskellige morfologiske ændringer. Omkring dag 6 bør tidlige koloni-lignende patches begynde at dukke op (figur 4C). Disse vil fortsætte med at vokse i størrelse efter yderligere kultur (se figur 4D, E). En god omprogrammering eksperiment bør resultere i> 500 kolonier pr T75, der oprindeligt blev podet med 5 x 10 5 celler (Figur 4E). Etablerede iPS kulturer besidder karakteristiske kuppelformet kolonier og bør hovedsagelig være blottet for differentierede celler (Figur 4F). Lejlighedsvis, ekstra passage af iPS kultures, kan være nødvendigt at fjerne udifferentierede / delvis omprogrammerede celler; en sammenflydende kolbe af celler kan opdeles i et forhold på 01:10 på et fødelag af bestrålede MEF.
Som nævnt ovenfor er morfologiske og molekylære forandringer i omprogrammering afspejles af ændringer i FACS-profiler for Thy-1.2, SSEA-1 og i sidste ende EpCAM (se figur 7A-F). Som tidligere rapporteret 12,15, mens MEF er overvejende positive for Thy-1.2 og negativ for de andre markører, der allerede dag 3 kulturer ser markant anderledes. En stor del af cellerne er begyndt at nedregulere ekspressionen af Thy-1.2 og en meget lille del af disse Thy-1.2 negative celler er blevet positive for SSEA-1, den faktiske omprogrammering mellemprodukt til dette tidspunkt. Antallet af omprogrammering mellemprodukter, der kan udvindes fra Dag 3 kulturer er meget uforudsigelig som procentdelen af SSEA-1 + / Thy-1.2- normalt ligger i et interval mellem 1-10% af viable celler. På dag 6 og 9 en større procentdel af SSEA-1 + celler, normalt godt over 10%, kan påvises. Omkring dag 12 en delmængde af SSEA-1-positive celler kan påvises, at også mærke positiv for EpCAM. Day 12 kulturer, som Day 3 kulturer, udgør en flaskehals i oprensning af mellemprodukter, som procentdelen af SSEA-1.2 + / EpCAM + celler er variabel og normalt falder i området på kun 2-4% af alle levende celler. Det forventede antal omprogrammering mellemprodukter præsenteret i tabel 1 kun tjener som en grov tilnærmelse. Etablerede bona fide iPS cellekulturer vil være stærkt positiv for SSEA-1 og EpCAM.
Figur 1. overflademarkør ændringer i løbet af omprogrammering vej: Ned-regulering af fibroblast identitetsmarkør Thy-1.2 efterfølges af opregulering afSSEA-1. Overgangen af en delmængde af SSEA-1-positive celler i retning af en pluripotente tilstand indikeres ved køb af EpCAM omkring dag 12. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Skematisk repræsentation af omprogrammerbare musemodel:. M2rtTA ekspression er under kontrol af ubikvitært aktive Rosa26 locus I nærværelse af doxycyclin (DOX) det m2rtTA proteinet binder til et tetracyclin promotor (tetOP) på Collagen 1A1 (COL1A1) locuset resulterer i ekspression af fire-faktor kassette. To bicistronisk kassetter er forbundet af et internt ribosomindgangssted (IRES). Åbne læserammer for Okt-4 / Klf-4 og Sox-2 / C-Myc er fu sed ved selvspaltende F2A og E2A sekvenser henholdsvis. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. embryo dissektion: (A) Overførsel livmoderhorn i en 10 cm skål fyldes med 10 ml PBS og (B) skæres i stykker, som indeholder et foster. (C) ved hjælp af pincet befri embryoner fra ekstra fostervæv og fjern hoved, arme og ben, hale og indre organer. Klik her for at se en større version af dette tal.
les / ftp_upload / 51728 / 51728fig4highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 4. Morfologiske ændringer i løbet omprogrammering. Colony-lignende pletter bliver synlige i kulturerne fra dag 6 og fremefter. Bona fide iPSCs er kendetegnet ved en hvælvet formet morfologi. (A) Dag 0 / MEF'er, (B) Dag 3, (C) Dag 6, (D) Dag 9, (E) Dag 12 (F) IPS-cellekultur. Målestokken:. 200 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Grundlæggende FACS opsætning. (A) Udeluk vragrester med Side Scatter kontra Forward Scatter-området blot. (B)Udeluk aggregater fra ikke-affald ved gating på enkelt celle populationen med Forward Scatter Område versus Forward Scatter Høj blot. (C) udelukker døde celler fra enkelt celle befolkning ved gating på PI lave arrangementer med PI kanal versus Forward Scatter Area blot. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Gating. (A, B) Brug af umærkede kontrol celler oprettet porte til Thy-1.2 + / SSEA-1- celler, Thy-1.2- / SSEA-1- celler og Thy-1.2- / SSEA-1 + celler. (C) Brug umærkede kontrol celler til at indstille porte til EpCAM positive og EpCAM negative celler. (D) SSEA-1 + / Thy-1.2- celler kan adskillesind i en EpCAM positiv og ind i en EpCAM- negativ befolkning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. Thy-1.2 versus SSEA-1 FACS klatter på forskellige stadier af omprogrammering processen. (A) Dag 0 / MEF'er, (B) Dag 3, (C) Dag 6, (D) Dag 9, (E) Dag 12 (F) iPS cellekultur.
Tabel 1. Foreslået podningstæthed, kolbe nummer og forventet resultat for P1 MEF et foster heterozygote for OKSM og m2rtTA. Klik hførend at se en større udgave af dette tal.
| Dag | Antal T75 kolber podet på dag 0 | Samlet antal Ssea1 + celler efter FACS | Samlet antal Ssea1 + / EpCAM + celler efter FACS |
| 3 | 8 | 2 millioner | |
| 6 | 4 | 2 millioner | |
| 9 | 4 | 2 millioner | |
| 12 | 10 | 10 millioner | 2 millioner |
Discussion
For at kunne omprogrammere MEF'er i iPS-celler og rense omprogrammering mellemprodukter ved høj mængde er det vigtigt at være opmærksom på faktorer, der har indflydelse på den samlede effektivitet. Især det parti FBS anvendes til at supplere iPS medierne kan have en skadelig virkning. Generelt positive erfaringer blev foretaget med embryonale stamceller (ES) celle kvalificerede FBS men batch test af sera fra en række forskellige leverandører ville kunne identificere et billigere alternativ.
En anden faktor, der påvirker om omprogrammering effektivitet er genotypen for MEF 15,20. Selv MEF'er afledt fra mus heterozygote (het) for både OKSM og m2rtTA locus lader omprogrammere, homozygousity den ene eller begge loci resulterer i højere omprogrammering effektivitet. Faktisk MEF'er afledt fra afkom af OKSM og m2rtTA kors viser en stigning i omprogrammering effektivitet i følgende rækkefølge (OKSM / m2rtTA): het / het <homo / het <het / homo <homo /homo (bemærk, at tallene i tabel 1 er for het / het dyr). I de sjældne tilfælde en mandlig homo / homo dyr identificeres, kan et harem parring med flere m2rtTA hunner sættes op. Alt afkom fra disse krydsninger vil blive het / homo for OKSM / m2rtTA loci hhv. Derudover anbefales, den hurtige genotypning kuld som større kuld opnås ved brug af yngre mus til avl (6-15 ugers alderen).
Desuden er brugen af lave passage MEF'er til omprogrammering fremhævet 23. Hvis MEF'er blev afledt og udvidet i en normoxisk vævsdyrkningsinkubator vi anbefaler kun at bruge disse celler op til passage 2. Hvis forsøgslederen har adgang til et lavt ilt inkubator (5% ilt) til afledning og udvidelse af MEF'er, tal så høje som 3 vil stadig give gode resultater 23 passage.
I tilfælde af forsøgslederen støder problemer forbundet med omprogrammering, som skitseret, er de mest sandsynlige forklaringer er høje antal passage på tidspunktet for dox desuden ukorrekt genotype musenes eller anvendelse af FBS, der ikke er befordrende for iPS-celle generation. I sjældne tilfælde observerede vi imidlertid, at MEF'er ikke var i stand til at omprogrammere selv under ideelle forhold. I disse tilfælde kan en spontan de novo deletion i m2rtTA åbne læseramme blev identificeret som den underliggende årsag.
Denne metode lykkedes tilpasset udtrække SSEA-1 + mellemprodukter via magnetisk celleisolering (MACS). Der er en klar tid fordel i at bruge Mac, er imidlertid SSEA-1 + cellepopulationer 'renhed reduceret til 80-90%, snarere end mere end 95%, hvilket afhængigt af eksperimentet cellerne er bestemt til kan udgøre et problem. Således er en mulighed er at bruge MACS at berige for SSEA-1 + celler, efterfulgt af FACS for at øge renheden og / eller brøkdel dem i SSEA-1 + / EpCAM + og SSEA-1 + / Epcam- celler.
"> Mens iPS celler produceret af den skitserede protokol og musemodel har vist sig at være pluripotente og effektivt bidrage til alle væv af kimære dyr 15,20, har en nedsat evne til at producere embryoner udelukkende sammensat af disse iPS celler via tetraploide komplementering været påvist 24. Afvigende methylering mønstre på Dik-DIØ3 genklyngen er blevet identificeret som den underliggende årsag 24. tilsætning af ascorbinsyre i en koncentration på 50 ug / ml til medierne under omprogrammering vil imidlertid frembringe tetraploid komplementerings- kompetente iPS celler 24. Vær opmærksom på, at en alternativ reprogrammable musemodel manipuleret til at udtrykke omprogrammeringsbestræbelser faktorer på en anden støkiometri kan producere tetraploide kompetente iPS celler selv i fravær af ascorbinsyre behandling 25. Men i vores hænder celler fra denne stamme omprogrammere til betydeligt lavere frekvens sammenlignet til anvendt heri musetilstandl.Beskrevet i dette manuskript metode tillader adskillelse af omprogrammering mellemprodukter fra den ildfaste størstedelen af befolkningen, og bør ses som værdifuldt værktøj til at dissekere og forstå omprogrammering processen fjerner de tidligere begrænsninger for at skulle bruge en ufraktioneret befolkning til profilering (f.eks, højt signal støj fra de ildfaste celler). Antistoffet kombination beskrevet heri tillader isolering af mellemprodukter fra museceller med høj renhed, men det er muligt, at yderligere celleoverflademarkører vil blive afsløret i fremtiden, som vil gøre det muligt at opnå mellemprodukter med endnu højere renhed. Bemærk venligst, at SSEA-1-ekspression er ikke kendetegnende for menneskeskabte pluripotente stamceller og som sådan dette protokol kan ikke bruges på at omprogrammere celler af human oprindelse. Som konklusion kan omprogrammering mellemprodukter gang isoleret med den beskrevne fremgangsmåde anvendes til molekylære analyser, herunder ekspression profiling, kromatin immunopræ-, methylome analyse og proteinanalyse.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne anerkende den økonomiske støtte fra Monash Larkins program samt fra en NHMRC CDF og et NHMRC projekttilskud. Desuden vil vi gerne takke Sue Mei Lim for hendes konstruktive forslag, Edwina McGlinn for hendes støtte og Monash Flowcore hold (især Adam Dinsdale) for deres hjælp i at producere videoen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse CD90.2 (Thy1.2) Pacific Blue | eBioscience | 48-0902-82 | |
| Anti-Human/Mouse SSEA-1 Biotin | eBioscience | 13-8813 | |
| Streptavidin PE-Cy 7 | eBioscience | 25-4317-82 | |
| Anti-Mouse CD326(Epcam) Fitc | eBioscience | 48-5791-82 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| Embryonic Stem Cell qualified Foetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10439024 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-070 | |
| β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140 | |
| Propidium Iodide solution (PI) | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | |
| Gelatine from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Doxycyclin hyclate | Sigma-Aldrich | 33429-100MG-R | |
| Leukemia Inhibitory Factor (LIF) | Millipore | ESG1107 | |
| DMEM High Glucose | Life Technologies | 11960-044 | |
| DPBS (Dulbecco's phosphate buffer saline) | Life Technologies | 14190-144 | |
| KnockOut DMEM | Life Technologies | 10829-018 | |
| Irradiated MEFs | Life Technologies | S1520-100 | |
| 75-cm2 Tissue culture flasks | Corning/BD Bioscience | 430641 | |
| 15-ml centrifuge tubes | Corning/BD Bioscience | 430791 | |
| 50-ml centrifuge tubes | Corning/BD Bioscience | 430829 | |
| Disposable surgical blades | Clifford Hallam | SM0501 | |
| Cryogenic vials | Corning/BD Bioscience | 430487 | |
| 70 µm Cell strainer | BD Bioscience | 352340 | |
| Taq DNA Polymerase | Life Technologies | 10342-020 |
References
- Matsui, Y., Zsebo, K., Hogan, B. L. Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture. Cell. 70, 841-847 (1992).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Stadtfeld, M., Maherali, N., Borkent, M., Hochedlinger, K. A reprogrammable mouse strain from gene-targeted embryonic stem cells. Nature Methods. 7, 53-55 (2010).
- Ebert, A. D., Svendsen, C. N. Human stem cells and drug screening: opportunities and challenges. Nature Reviews. Drug Discovery. 9, 367-372 (2010).
- Zhang, J., et al. A human iPSC model of Hutchinson Gilford Progeria reveals vascular smooth muscle and mesenchymal stem cell defects. Cell Stem Cell. 8, 31-45 (2011).
- Samavarchi-Tehrani, P., et al. Functional genomics reveals a BMP-driven mesenchymal-to-epithelial transition in the initiation of somatic cell reprogramming. Cell Stem Cell. 7, 64-77 (2010).
- Celià-Terrassa, T., et al. Epithelial-mesenchymal transition can suppress major attributes of human epithelial tumor-initiating cells. The Journal of Clinical Investigation. 122, 1849 (2012).
- Liao, B., et al. MicroRNA cluster 302–367 enhances somatic cell reprogramming by accelerating a mesenchymal-to-epithelial transition. Journal of Biological Chemistry. 286, 17359-17364 (2011).
- Cieślik, M., et al. Epigenetic coordination of signaling pathways during the epithelial-mesenchymal transition. Epigenetic., & Chromatin. 6, 1-22 (2013).
- Golipour, A., et al. A late transition in somatic cell reprogramming requires regulators distinct from the pluripotency network. Cell Stem Cell. 11, 769-782 (2012).
- Maherali, N., et al. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).
- Stadtfeld, M., Maherali, N., Breault, D. T., Hochedlinger, K. Defining molecular cornerstones during fibroblast to iPS cell reprogramming in mouse. Cell Stem Cell. 2, 230-240 (2008).
- Brambrink, T., et al. Sequential expression of pluripotency markers during direct reprogramming of mouse somatic cells. Cell Stem Cell. 2, 151-159 (2008).
- Wernig, M., et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448, 318-324 (2007).
- Polo, J. M., et al. A molecular roadmap of reprogramming somatic cells into iPS cells. Cell. 151, 1617-1632 (2012).
- Wright, A. J., Andrews, P. W. Surface marker antigens in the characterization of human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 3, 3-11 (2009).
- O'Malley, J., et al. High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells. Nature. , (2013).
- Hansson, J., et al. Highly coordinated proteome dynamics during reprogramming of somatic cells to pluripotency. Cell Reports. 2, 1579-1592 (2012).
- Stadtfeld, M., Maherali, N., Breault, D. T., Hochedlinger, K. Defining molecular cornerstones during fibroblast to iPS cell reprogramming in mouse. Cell Stem Cell. 2, 230-240 (2008).
- Stadtfeld, M., Maherali, N., Borkent, M., Hochedlinger, K. A reprogrammable mouse strain from gene-targeted embryonic stem cells. Nature Methods. 7, 53-55 (2009).
- Sommer, C. A., et al. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 27, 543-549 (2009).
- Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2, 3081-3089 (2007).
- Utikal, J., et al. Immortalization eliminates a roadblock during cellular reprogramming into iPS cells. Nature. 460, 1145-1148 (2009).
- Stadtfeld, M., et al. Ascorbic acid prevents loss of Dlk1-Dio3 imprinting and facilitates generation of all-iPS cell mice from terminally differentiated B cells. Nature Genetics. 44, 398-405 (2012).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 9, 588-598 (2011).
