Introduction
Embryonala stamceller (ES-celler) är härledda från den inre cellmassan av embryon blastocyststadiet 1. Under lämpliga odlingsbetingelser som de själv förnya och förblir pluripotenta. Under 2006 Yamanaka och kollegor visade att mogna celler kan omprogrammeras till så kallade inducerade pluripotenta stamceller (iPS-celler) genom forcerad uttryck av transkriptionsfaktorer oktober-4, Klf-4, Sox-2, c-Myc (OKSM) 2. iPS-celler, som ES-celler, kan ge upphov till alla celltyper i kroppen, men de är fria från de etiska restriktioner omger generering av ES-celler 3. Dessutom iPS-celler bär ett löfte om personlig regenerativ medicin och håll en enorm potential för tillämpningar som sjukdomsmodeller och in vitro drog screening 4,5. För att programmera om teknik för att uppfylla denna potential behöver den grundläggande mekanismen av kärn omprogrammering till fullo förstås. Men ansträngningarna dissekera omprogrammering patHway har hindrats av det faktum att endast ett mycket litet antal celler omprogrammera (0,1-1%). Framgångsrikt omprogrammering fibroblaster har rapporterats att genomgå en distinkt serie händelser, inklusive en mesenkymala till epiteliala övergång 6-10, och i slutskedet av omprogrammering, aktivering av endogena kärn pluripotens nätet 11-14. Vi och andra 12,13,15-17 har nyligen identifierat en uppsättning cellytemarkörer som möjliggör separation av sällsynta mellan från eldfasta bulk befolkningen. Omprogrammering mus embryonala fibroblaster (MEF) genomgår förändringar i uttryck av Thy-1.2, Ssea1 och EpCAM (bland andra) under 2 veckor långa omprogrammering process 15. Tidigt under omprogrammering en delmängd av MEF nedreglera uttrycket av fibroblast identitetsmarkör (Thy-1.2) och sedan börja uttrycka pluripotens relaterade markör SSEA-1 12. Under slutskedet av omprogrammering Ssea1-positiva celler reaktivåt endogena pluripotens gener såsom oktober-4 10-13,15. Denna sista övergång markeras på cellytan genom påvisbar uttryck av EpCAM (se figur 1) eller i ett senare skede PECAM 15. Nyligen O'Malley et al. Rapporterade användningen av CD44 och iCAM1 som alternativ eller komplement till Thy-1.2 och SSEA-1 för identifiering av omprogrammering intermediärer. Vi har tidigare FACS extraherade omprogrammering intermediärer från dag 0, dag 3, Dag 6, Dag 9 och dag 12 omprogrammering kulturer samt från etablerade iPS cellinjer utifrån dessa cellytemarkörer 15,18. För nedan beskrivna omprogrammering systemet och villkor har vi visat på enskild cellnivå att även populationerna är tyst homogena, det finns en viss grad av heterogenitet i de identifierade mellanliggande populationer. Det bör noteras att endast en delmängd av celler inom dessa populationer kan gå vidare till respektive nästa staGE av omprogrammering processen och ger upphov till iPS cellkolonier vid olika verkningsgrader, som har varit föremål för omfattande karakteriseras tidigare 15,19. Dessutom kommer omprogrammering effektiviteten i dessa populationer beror såväl på de åter plating och odlingsbetingelser. För att öka experimentella reproducerbarhet använder vi en omprogrammerbar musstam som har utvecklats för att uttrycka en transkriptionstrans (m2rtTA) under kontroll av ROSA26 lokus och en polycistroniskt OKSM kassett under kontroll av en doxycyklin lyhörd promotor 20,21. Med användning av denna musmodell kringgår de oönskade biverkningarna av traditionella virala metoder för iPS cellgeneration, dvs en heterogen startpopulationen med cell till cell variation i antalet och placeringen av integrations områden av virala skär. Två transgena musstammar (OKSM, m2rtTA), som finns som homozygota grundardjur vid Jackson Laboratory, har passeras för att fastställa reprogrammable musmodell (se figur 2). I detta manuskript beskriver vi i detalj hur man härleda MEF, generera iPS-celler, och isolera omprogrammeringar mellan i olika skeden av omvandlingsprocessen med FACS.
Protocol
1 Instrumentinställningar / Reagensberedning / Genotypning
- Förbered iPS cellmedium: supplement 500 ml Knockout DMEM media med 75 ml fetalt bovint serum (FBS), 5 ml L-glutamin, 5 ml icke-essentiella aminosyror, 500 | il β-merkaptoetanol, 5 x 10 5 enheter Leukemia inhibitory factor ( LIF). Se Materiallista för produkt-och inköpsinformation för reagenser som används i samband med detta manuskript.
- Förbered MEF medium: Tillägg 500 ml DMEM media med 50 ml FBS, 5 ml L-glutamin, 5 ml icke-essentiella aminosyror, 5 ml Natriumpyruvat, 500 l β-merkaptoetanol.
- Förbered frysmedium: För 10 ml, kombinera 9 ml FBS med en ml DMSO.
- Bered gelatinbelagda dishes Lägg 3-5 ml 0,1% porcint gelatinlösning till en T75-flaska, inkubera vid RT under åtminstone 10 min och aspirera just före användning.
- Förbered FACS märkning medium: För 10 ml, kombinera 9,9 ml PBS med 0,1 ml FBS.
- Utfören genotypning PCR för ROSA26 m2rtTA locus: Utför reaktioner med Taq DNA-polymeras enligt tillverkarens anvisningar. Använd en modifierad MgCl2 -koncentration av 3,5 mM och följande 3 primers: oIMR8052: 5 'GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC 3', oIMR8545: 5'AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT 3 ', oIMR8546: 5' GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG 3 '. Cykling betingelser: 94 ° C under 3 min; 35 cykler av (94 ° C under 30 sek, 65 ° C under 1 min, 72 ° C under 1 min); 72 ° C under 2 min; håll vid 12 ° C. Förväntade produktstorlek: 650 bp för vildtyp-allelen och 340 bp för mutant allel.
- Utför en genotypning PCR för kollagen-StemCa / OKSM locus: Utför reaktioner med Taq DNA-polymeras enligt instruktionerna. Använd en modifierad MgCl2 -koncentration av 2,5 och följande 3 primers: col / FRT-B: 5 'CCCTCCATGTGTGACCAAGG 3', col / frtA1: 5 'GCACAGCATTGCGGACATGC 3', col / frtC1: 5 'GCAGAAGCGCGGCCGTCTGG 3 '. Cykling betingelser: 95 ° C under 1 min: 2 cykler av (94 ° C under 30 sek, 70 ° C under 45 sek), sex cykler av (94 ° C under 30 sek, 68 ° C under 45 sek) och 30 cykler av (94 ° C under 20 sek, 60 ° C under 1 min); 72 ° C under 5 min; håll vid 12 ° C. Förväntade produktstorlek: 331 bp för vildtyp-allelen och 551 bp för mutant allel.
- Utför alla centrifugeringssteg vid 400 xg under 3 min vid 4 ° C.
2 Generering av Mouse embryonala fibroblaster
- Utför en tidsinställd parning mellan djur av OKSM stam med en medlem av det motsatta könet på m2rtTA stammen. Harvest embryon vid embryonala dag 13,5 genom utslaktning modern och tar bort livmoderhornet. Före avlägsnande av livmoderhornet, spraya bukhålan med en 80% etanollösning, för att undvika mikrobiell kontaminering.
- Överför livmoderhornet i en 10 cm vävnadsodlingsskål innehållande 10 ml steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Använd steriliserade kirurgiska grade sax för att klippa livmoderhornet i bitar som innehåller ett embryo (se figur 3A, B).
- Använd en dissektion mikroskop (idealiskt beläget i en vävnadsodling huva) och steriliserade pincett för att försiktigt ta bort livmoder kuvert och extra-embryonala membran som omger varje embryo. Överför varje embryo till en separat 10 cm skål med 10 ml PBS.
- Gå vidare genom att ta bort embryot huvud, armar och ben, svans och inre organ (hjärta, lever, tarmar etc.) med tången (se Figur 3C). Överför embryot huvud in i ett 1,5 ml rör och frysa ned så att den kan användas för genotypning om nödvändigt.
- Överför embryot bål i en tom 10 cm platta och använda två kirurgiska knivar att mala embryot för 2 min. Lägg 200 pl av trypsin / EDTA-lösningen på toppen av det malda embryot och inkubera i 3 till 5 min vid RT. Fortsätt mals i ytterligare 2 minuter, tillsätt 2 ml MEF media i aktivera trypsin, och sedan överföra till en 15 ml tub.
- Använd en 1.000 l pipett för att ytterligare mekaniskt dissociera vävnaden genom försiktig pipettering. Överföring till en gelatinbelagd 10 cm skål och tillsätt ytterligare 10 ml MEF media. Notera: Både normoxiska och hypoxiska inkubatorer kan användas för odling, se diskussionen för mer information.
- Efter 24-48 timmar plattan bör tätt täckt med MEF.
- Alternativt cellerna kan därefter ytterligare förökas eller frysas ned. För frysning av celler, ta bort odlingsmedia, skölj skålen med 10 ml PBS för att avlägsna spår av media och överlagring med 3 ml trypsin / EDTA-lösning. Inkubera i 3-5 min vid 37 ° C, inaktivera trypsindigerering genom att tillsätta 5 ml MEF media och överför till en 15 ml centrifugrör. Centrifugera ner och återsuspendera pelleten i 3 ml frysmediet. Transfer till 3 cryovials och frysa ner i en cell fryser behållare.
3 Omprogrammering av MEF
ove_content "> OBS: Pellets celler genom centrifugering vid 200 xg under 5 minuter vid 4 ° C och använd normoxiska vävnadskultur inkubatorer för omprogrammering Det kan vara fördelaktigt att härleda och expandera MEF under hypoxiska förhållanden (5% syre, se diskussionen för mer information. ).- Snabbt tina en låg passage cryovial (P0-P1, 2-3 Mio celler) i ett vattenbad (37 ° C) och överför innehållet i ett rör med 10 ml förvärmda MEF media. Pellets celler, återsuspendera i 12 ml färskt MEF medium, överföra i en gelatinbelagd T75 odlingskärlet och låta cellerna att återhämta sig efter 24-48 timmar innan du fortsätter. Obs: MEF kan också användas direkt efter härledning.
- Efter avlägsnande av odlingsmedier, tvätta MEF med PBS och cellularize genom att lägga med en trypsin / EDTA-lösning (3 ml för 3-5 min vid 37 ° C). Släcka trypsin genom att tillsätta 5 ml MEF media och ytterligare dissociera cellerna genom varsam blandning med en 10 ml pipett. Bestäm cell nummer med hjälp av en hemocytometer.
- För reprogramming experiment, utsäde MEFs på gelatinbelagda T75-kolvar vid tätheter av 6,7 x 10 3 celler / cm 2 (~ 0.5 miljoner celler per flaska) i IPSC media som innehåller 2 mikrogram / ml doxycyklin. Se Tabell 1 angående sådd rekommendationer för att erhålla cirka 2 Mio omprogrammering mellanprodukter för varje tidpunkt. Anmärkning: Omprogrammering påbörjas med tillsats av doxycyklin (2 | ig / ml) kompletterat medium
- För de första 6 dagarna ersätter media varannan dag med färska doxycyklin kompletterad iPSC media (12 ml medium per T75 kolv). Bortom denna punkt förnya media dagligen om det finns höga cellantal. Fördubbla odlingsvolymen om medie förändringar endast kan utföras varannan dag.
- Harvest omprogrammering mellan vid erforderliga tidpunkter (Förslag: Dag 3, 6, 9, 12) genom att ta bort media, sköljning med lämplig volym av PBS (10 ml till en T75 kolv) och överliggande med trypsin-EDTA-lösning (3 ml för en T75-kolv). Inkuberaför 3-5 minuter vid 37 ° C och släcka genom tillsats av 5 ml iPSC media följt av försiktig pipettering.
- Räkna cellsuspension med en hemocytometer (se ovan), pellet genom centrifugering, aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna i 10 ml PBS för att avlägsna eventuella spår av trypsin. Pellets cellerna återigen, aspirera supernatanten och fortsätter med steg 4.1 för att isolera omprogrammeringar intermediärer. Obs: Celler som genomgår omprogrammering kan vara kryokonserveras och tinas för FACS isolering i ett senare skede.
- Att etablera fullt omprogrammerade iPS kulturer odla celler i dox fritt iPSC media under ytterligare 4-7 dagar. Obs: Framgångsrikt omprogrammering kulturer kommer att innehålla ett stort antal kolonier vid dag 12 (se Figur 4). Under denna tid kommer avvikande iPS-celler som fortfarande kräver OKSM uttryck försvinna.
- Alternativt, för att propagera de återstående fullt omprogrammerade iPS kulturer: inledningsvis ympa bestrålat MEF vid en densitet av 15 x 10 3 celler / cm 2
- Härnäst cellularize iPS cellkulturer genom att avlägsna mediet, skölja den T75-flaska med 10 ml PBS, överlagra med 3 ml trypsin-EDTA-lösning och inkubera under 3-5 min vid 37 ° C. Släcka trypsin genom tillsats av 5 ml IPSC media följt av försiktig blandning, överför till en 15 ml koniskt rör, spinn ner och sedan suspenderades i 10 ml iPS media.
- Överför 500 l av denna cellsuspension på de bestrålade MEF (T75 kolv) och låta kulturerna växa i 4-5 dagar. Obs: Etablerade iPS kulturer kan vara kryokonserveras eller användas för experiment. Klonala cellinjer kan härledas genom att välja individuella IPSC kolonier under ett dissektionsmikroskop 22.
- Cryo bevara sammanflytande IPSC kulturer enligt beskrivningen i 2.8 för MEF.
4. Antibody Labeling
- Resuspendera cell pellets av omprogrammering kulturer, som upprättats i avsnitt 3, iFACS märkning media kompletterat med antikroppar (anti-Thy-1.2 Pacific Blue 1: 400, anti-SSEA-1 biotin 1: 400 och anti-EpCAM FITC 1: 400). Använd 200 l av kompletterad märkning mix per fem miljoner celler och inkubera på is.
- Efter 10 min försiktigt knacka på röret för att resuspendera cellerna och inkubera under ytterligare 10 min på is. Tillsätt 10 ml kall PBS per rör och spinn ner.
- För varje rör som ska färgas förbereda 200 l av märkning medium kompletterat med 1 pl streptavidin-PeCy7 (1: 200) per fem miljoner celler. När cellerna har pelleterat, försiktigt aspirera supernatanten och återsuspendera i en lämplig volym av märkningsmedia kompletterat med Streptavidin-PeCy7.
- Håll celler på is i 10 minuter, tryck på för att suspendera, inkubera under ytterligare 10 minuter på is, tillsätt 10 ml kall PBS per rör, spinn ner och aspirera supernatanten.
- Återsuspendera cellpelletarna i märkningsmedia kompletterat med propidiumjodid (PI) (2 | ig / ml) vid ca 1 x 10 7 celler / ml. Avlägsna cellklumpar genom att passera suspensionen genom en 70 | im sil. Överför celler till en lämplig FACS rör och hålla dem på is.
- Bered separata prover med individuella antikroppar (anti-Thy-1.2, anti-SSEA-1 och anti-EpCAM). OBS: Dessa krävs för att utföra färg ersättning i de tre kanaler som används i analysen. Dessutom är omärkta celler som behövs för att ställa in spänningarna och grindar för sortering. Helst iPS celler används för ersättning: lager av 0,5-1 x 10 6 iPS-celler som upprätthålls på bestrålade MEF lagras i cryovials i flytande kväve. Förekomsten av MEF är viktigt att få en signal i Thy-1.2-kanal.
- Tina en cryovial av iPS-celler som beskrivits för MEF (avsnitt 3). Efter centrifugering, är återsuspendera cellerna i 800 l av buffert märkning och 200 l av detta prov avsättas som den omärkta kontroll.
- Använd de återstående cellerna som kontroller ersättning. Divide celler mellan tre 15 ml rör och lägga antikropparenligt följande: Pacific Blue kompensationsstyrning: till 0,5 l av anti-Thy-1.2 Pacific Blue antikropp. FITC ersättning tub: till 0,5 l av anti-EpCAM-FITC-antikroppen. Pe-Cy7 kompensationsstyrning: 0,5 pl av anti SSEA-1-biotin antikropp.
- Behåll cellantikroppsprover på is i 10 min, blanda genom att knacka och inkubera i 10 minuter på is.
- Tvätta prov med 10 ml kall PBS för att avlägsna obunden antikropp, snurra celler nedåt och aspirera supernatanten. Resuspendera cell pellets i 200 l av FACS märkningsmedier.
- För anti-SSEA-1-Biotin märkta prover, lägga till en streptavidin-PeCy7 konjugat (1 l per 200 | il celler). Etikett celler som beskrivs för primär antikropp (SSEA-1-biotin).
- Pass alla prover, inklusive omärkta kontroll genom en 70 um sil och lägg PI (2 mikrogram / ml). Överför celler till FACS rör och hålla på is tills de behövs.
5. FACS Isolering av intermediärer
NOTERA:Cellerna sorteras med hjälp av en fluorescensaktiverad cell Sorter med 405 nm, 488 nm och 560 nm excitation lasrar och en 100 nm munstycke.
- Sätt upp spänningar för framåt och sidospridning så att cellen befolkningen ordentligt. Rita en grind runt celler såsom anges i fig 5A för att utesluta skräp. Obs: Korrekt uppsättning av spänningar på cellsorterare kan vara komplexa och kräver en erfaren FACS operatör.
- Använd Forward Scatter (FSC) höjd kontra FSC-området för att utesluta aggregat (Figur 5B).
- Visualisera PI kanalen kontra FSC till grinden in på PI negativa levande celler (figur 5C).
- Använd omärkta celler att justera spänningarna för de fluorescerande kanaler PB, FITC / GFP, Pe-Cy7. Helst placera cellpopulationen vid den nedre änden av respektive kanal.
- Ställ grindar med de omärkta kontrollceller såsom visas i fig 6A, B för att underfraktion omprogrammeringen kultgärder till dag 3, 6 och 9 populationer: SSEA-1 / Thy-1.2 + celler; SSEA-1 / Thy-1,2- celler; och omprogrammeringen mellanprodukter SSEA-1 + / Thy-1,2- celler.
- Ytterligare dela upp Dag 9 SSEA-1 + / Thy-1,2- fraktion med hjälp av Pe-Cy7 kontra FITC blot; rita grindar runt SSE-a1 + / EpCAM + celler och SSEA-1 + / Epcam- celler. Ställ grindar med de omärkta kontrollceller såsom visas i fig 6C, D.
- Prefill lämpliga samlingsrören med iPS-cell media (1-2 ml) före sortering önskade subpopulationer (se figur 7 för representativa FACS profiler för MEF, Dag 3 / Dag 6 / Dag 9 / Dag 12 kulturer och iPS-celler).
- Utför FACS sortering enligt tillverkar-protokollet.
- Efter FACS isolering lämna celler för molekylär profilering (RNA / protein extraktion, kromatin immunoprecipitation, DNA methylome analys etc.). Alternativt kan de olika cellfraktioner odlas.
Representative Results
Efter dissektion, uppdelning och plätering av en E13.5 mus embryo, är en 10 cm skål väntas växa samman i ca 1 till 2 dagar. I detta skede är det normalt att kulturen innehåller några vidhäftande bitar av vävnad som inte har cellulära korrekt. De försvinner efter passage.
Upon doxycyklin induktion, omprogrammering MEFs undergår distinkta morfologiska förändringar. Runt dag 6, bör tidigt koloniliknande fläckar börjar växa fram (Figur 4C). Dessa kommer att fortsätta att växa i storlek vid ytterligare kultur (se Figur 4D, E). En bra omprogrammering experiment bör resultera i> 500 kolonier per T75 som ursprungligen såddes med 5 x 10 5 celler (Figur 4E). Etablerade iPS kulturer besitter karakteristiska kupolformade kolonier och bör till största delen sakna differentierade celler (Figur 4F). Ibland ytterligare passage av iPS kultures kan krävas för att avlägsna odifferentierade / delvis omprogrammerade celler; ett sammanflytande kolv av celler kan delas i förhållandet 01:10 på ett matarskikt av bestrålade MEF.
Som nämnts ovan är morfologiska och molekylära förändringar under omprogrammering reflekteras av förändringar i FACS profiler för Thy-1.2, SSEA-1 och slutligen EpCAM (se figur 7A-F). Som tidigare rapporterats 12,15, medan MEF är övervägande positiva för Thy-1.2 och negativt för andra markörer, Dag 3 kulturer redan ser markant annorlunda. En stor andel av cellerna har börjat att nedreglera uttrycket av Thy-1.2 och en mycket liten undergrupp av dessa Thy-1,2 negativa celler har blivit positiv för SSEA-1, den verkliga omprogrammeringen mellanprodukt för denna tidpunkt. Antalet omprogrammeringar intermediärer som kan extraheras från Dag 3 kulturer är mycket oförutsägbar som andelen SSEA-1 + / Thy-1,2- vanligtvis ligger på mellan 1-10% av viable celler. Dag 6 och 9 en ökad andel av SSEA-1 + celler, oftast långt över 10%, kan detekteras. Omkring dag 12 en delmängd av SSEA-1-positiva celler kan detekteras som också märka positivt för EpCAM. Dag 12 kulturer, som Dag 3 kulturer utgör en flaskhals vid rening av mellanprodukter, som andelen SSEA-1.2 + / EpCAM + celler är rörlig och avtar vanligtvis inom intervallet endast 2-4% av alla levande celler. Det förväntade antalet omprogrammeringar intermediärer som presenteras i tabell 1 tjänar endast som en grov uppskattning. Etablerade bona fide iPS cellkulturer är starkt positiva för SSEA-1 och EpCAM.
Figur 1 ytmarkör förändringar under omprogrammering vägen: Nedreglering av fibroblast identitetsmarkör Thy-1.2 följs av uppreglering avSSEA-1. Övergången av en delmängd av SSEA-1-positiva celler mot ett pluripotent tillstånd indikeras genom förvärv av EpCAM runt dag 12. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 Schematisk representation av den omprogrammerbara musmodell:. M2rtTA expression är under kontroll av den ubiquitously aktiv ROSA26 locus I närvaro av doxicyklin (DOX) den m2rtTA protein binder till en tetracyklin beroende promotor (tetOP) vid Collagen 1a1 (Col1a1) locus vilket resulterar i uttrycket av fyra faktor kassett. Två bicistroniska kassetter är förenade genom en intern ribosominträdesställe (IRES). Öppna läsramar för oktober-4 / Klf-4 och Sox-2 / c-Myc är fu sed genom själv klyva F2A och E2A sekvenser, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 Embryo dissektion: (A) Överföring livmoderhorn i en 10 cm skål fylld med 10 ml PBS och (B) i bitar som innehåller ett embryo. (C) Använd pincett befria embryon från extra embryonal vävnad och avlägsna huvudet, armar och ben, svans och inre organ. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
les / ftp_upload / 51.728 / 51728fig4highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 4 Morfologiska förändringar under omprogrammering. Koloni-liknande fläckar blivit uppenbart i kulturer från dag 6 och framåt. Bona fide iPSCs kännetecknas av en välvd formad morfologi. (A) Dag 0 / MEF, (B) Dag 3, (C) Dag 6, (D) Dag 9, (E) Dag 12, (F) iPS cellodling. Skala bar:. 200 pm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 Grundläggande FACS setup. (A) Uteslut skräp med sidospridning kontra Forward Scatter Area blot. (B)Uteslut aggregat från icke-skräp genom gating på samma cellpopulation med Forward Scatter Area kontra Forward Scatter Hög blot. (C) Uteslut döda celler från en enda cell befolkningen genom att grind på PI låga händelser med PI kanal kontra Forward Scatter Area blot. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 gating. (A, B) Använda omärkta kontrollceller som inrättats portarna för Thy-1.2 + / SSEA-1-celler, Thy-1,2- / SSEA-1-celler och Thy-1,2- / SSEA-1 + celler. (C) Använd omärkta kontrollcellerna att ställa portarna för EpCAM positiva och EpCAM negativa celler. (D) SSEA-1 + / Thy-1,2- celler kan separerasi en EpCAM positiva och in i en EpCAM negativ befolknings. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7 Thy-1.2 kontra SSEA-en FACS blottar vid olika skeden av omprogrammering processen. (A) Dag 0 / MEF, (B) Dag 3, (C) Dag 6 (D) Dag 9, (E) Dag 12, (F) iPS cellodling.
Tabell 1 Föreslagna såddtäthet, kolv nummer och förväntat utfall för P1 MEF av ett embryo heterozygot för OKSM och m2rtTA. Klicka here för att se en större version av denna siffra.
| Dag | Antal T75-kolvar ympades på dag 0 | Totalt antal Ssea1 + celler efter FACS | Totalt antal Ssea1 + / EpCAM + celler efter FACS |
| 3 | 8 | 2 miljoner | |
| 6 | 4 | 2 miljoner | |
| 9 | 4 | 2 miljoner | |
| 12 | 10 | 10.000.000 | 2 miljoner |
Discussion
För att framgångsrikt omprogrammera MEF in i iPS-celler och att rena omprogrammeringar intermediärer vid hög kvantitet är det viktigt att vara medveten om faktorer som inverkar på den totala effektiviteten. I synnerhet det parti FBS användas som komplement till iPS medier kan ha en skadlig effekt. I allmänhet positiva erfarenheter gjordes med embryonala stamceller (ES) cell kvalificerade FBS men partiprovning av sera från en mängd olika leverantörer skulle kunna identifiera ett billigare alternativ.
En annan faktor som påverkar om omprogrammering effektiviteten är genotypen i MEF 15,20. Även MEFs härledda från möss heterozygot (het) för både OKSM och m2rtTA locus behöver omprogrammera homozygousity vid en eller båda loci resulterar i högre omprogrammering effektivitet. Faktum MEF härrör från avkomma OKSM och m2rtTA kors visar en ökning av omprogrammering effektivitet i följande ordning (OKSM / m2rtTA): het / het <homo / het <het / homo <homo /homo (observera att de nummer som anges i tabell 1 är för het / het djur). Vid de sällsynta tillfällen en manlig homo / homo djur identifieras, kan ett harem parning med flera m2rtTA honor inrättas. All avkomma från dessa korsningar kommer att Het / homo för OKSM / m2rtTA loci, respektive. Dessutom är den snabba genotypning av kullar rekommenderas som större kullar erhålls vid användning av yngre möss för avel (6-15 veckors ålder).
Dessutom är användningen av låga passage MEF för omprogrammering betonas 23. Om MEF härleddes och expanderade i en normoxisk vävnadsodling inkubator vi rekommenderar starkt att endast använda dessa celler upp till passagen 2. Om laboratoriet har tillgång till en låg syre inkubator (5% syre) för härledning och expansion av MEF, passagenummer så höga som 3 kommer fortfarande att ge goda resultat 23.
Vid försöks påträffar problem förknippade med omprogrammering, som beskrivs, de mest sannolika förklaringarna är höga passagenummer vid tidpunkten för dox dessutom felaktig genotyp av mössen eller användning av FBS som inte bidrar till iPS-cell generation. Men i sällsynta fall vi observerade att MEF inte kunde programmera även under idealiska förhållanden. I dessa fall en spontan de novo deletion inom m2rtTA s öppna läsram identifierades som den underliggande orsaken.
Denna metod har framgångsrikt anpassat för att extrahera SSEA-1 + mellan via magnetisk cellisolering (MACS). Det finns en tydlig tids fördel med att använda MACS dock de SSEA-1 + cellpopulationer "renhet minskat till 80-90%, i stället för mer än 95%, vilket beroende på typ av experiment cellerna är avsedda för kan utgöra ett problem. Således är ett alternativ att använda MACS att anrika SSEA-1 + celler följt av FACS att öka renhet och / eller fraktion dem i SSEA-1 + / EpCAM + och SSEA-1 + / Epcam- celler.
"> Medan iPS-celler som produceras av den skisserade protokoll och musmodell har visats vara pluripotenta och effektivt sätt bidra till alla vävnader i chimera djur 15,20, har en nedsatt förmåga att producera embryon som helt består av dessa iPS-celler via tetraploid komplemente varit visade 24. Avvikande metyleringsmönster på Dlk-DIØ3 genkluster har identifierats som den bakomliggande orsaken. 24 kommer dock att tillägg av askorbinsyra i en koncentration av 50 ug / ml till medierna under omprogrammering producera tetraploid komplemente kompetenta iPS-celler 24. Observera att en alternativ omprogrammerbart musmodell för att uttrycka de omprogrammeringar faktorer i en annan stökiometri kan producera tetraploida kompetenta iPS-celler även i frånvaro av askorbinsyra behandling 25. Men i våra händer cellerna från denna stam Programmera till betydligt lägre frekvens jämfört till häri används läget musl.Den metod som beskrivs i detta manuskript medger separation av omprogrammering mellan från eldfasta delen av befolkningen och bör ses som värdefullt verktyg för att dissekera och förstå omprogrammering processen, ta bort de tidigare begränsningarna för att behöva använda en ofraktionerat population för profilering (t.ex. hög signal buller från de eldfasta celler). Kombinationen antikropp som beskrivs häri medger isolering av mellanprodukter från musceller med hög renhet, men det är möjligt att ytterligare cellytmarkörer ska avslöjats i framtiden som gör det möjligt att få mellan på ännu högre renhet. Observera att SSEA-1 uttryck är inte ett kännetecken för mänskliga inducerade pluripotenta stamceller och som sådan här protokollet inte kan användas på omprogrammera celler av mänskligt ursprung. Sammanfattningsvis kan omprogrammeringsinstruktioner intermediärer gång isolerats med den beskrivna metoden användas för molekylära analyser inklusive uttryck profiling, kromatin immunoprecipitation, methylome analys och proteinanalyser.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi vill tacka för det ekonomiska stödet från Monash Larkins Program samt från en NHMRC CDF och NHMRC projektbidrag. Vidare vill vi tacka Sue Mei Lim för hennes konstruktiva förslag, Edwina McGlinn för hennes stöd och Monash Flowcore laget (särskilt Adam Dinsdale) för hjälpen med videon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse CD90.2 (Thy1.2) Pacific Blue | eBioscience | 48-0902-82 | |
| Anti-Human/Mouse SSEA-1 Biotin | eBioscience | 13-8813 | |
| Streptavidin PE-Cy 7 | eBioscience | 25-4317-82 | |
| Anti-Mouse CD326(Epcam) Fitc | eBioscience | 48-5791-82 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| Embryonic Stem Cell qualified Foetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10439024 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-070 | |
| β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140 | |
| Propidium Iodide solution (PI) | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | |
| Gelatine from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Doxycyclin hyclate | Sigma-Aldrich | 33429-100MG-R | |
| Leukemia Inhibitory Factor (LIF) | Millipore | ESG1107 | |
| DMEM High Glucose | Life Technologies | 11960-044 | |
| DPBS (Dulbecco's phosphate buffer saline) | Life Technologies | 14190-144 | |
| KnockOut DMEM | Life Technologies | 10829-018 | |
| Irradiated MEFs | Life Technologies | S1520-100 | |
| 75-cm2 Tissue culture flasks | Corning/BD Bioscience | 430641 | |
| 15-ml centrifuge tubes | Corning/BD Bioscience | 430791 | |
| 50-ml centrifuge tubes | Corning/BD Bioscience | 430829 | |
| Disposable surgical blades | Clifford Hallam | SM0501 | |
| Cryogenic vials | Corning/BD Bioscience | 430487 | |
| 70 µm Cell strainer | BD Bioscience | 352340 | |
| Taq DNA Polymerase | Life Technologies | 10342-020 |
References
- Matsui, Y., Zsebo, K., Hogan, B. L. Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture. Cell. 70, 841-847 (1992).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Stadtfeld, M., Maherali, N., Borkent, M., Hochedlinger, K. A reprogrammable mouse strain from gene-targeted embryonic stem cells. Nature Methods. 7, 53-55 (2010).
- Ebert, A. D., Svendsen, C. N. Human stem cells and drug screening: opportunities and challenges. Nature Reviews. Drug Discovery. 9, 367-372 (2010).
- Zhang, J., et al. A human iPSC model of Hutchinson Gilford Progeria reveals vascular smooth muscle and mesenchymal stem cell defects. Cell Stem Cell. 8, 31-45 (2011).
- Samavarchi-Tehrani, P., et al. Functional genomics reveals a BMP-driven mesenchymal-to-epithelial transition in the initiation of somatic cell reprogramming. Cell Stem Cell. 7, 64-77 (2010).
- Celià-Terrassa, T., et al. Epithelial-mesenchymal transition can suppress major attributes of human epithelial tumor-initiating cells. The Journal of Clinical Investigation. 122, 1849 (2012).
- Liao, B., et al. MicroRNA cluster 302–367 enhances somatic cell reprogramming by accelerating a mesenchymal-to-epithelial transition. Journal of Biological Chemistry. 286, 17359-17364 (2011).
- Cieślik, M., et al. Epigenetic coordination of signaling pathways during the epithelial-mesenchymal transition. Epigenetic., & Chromatin. 6, 1-22 (2013).
- Golipour, A., et al. A late transition in somatic cell reprogramming requires regulators distinct from the pluripotency network. Cell Stem Cell. 11, 769-782 (2012).
- Maherali, N., et al. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).
- Stadtfeld, M., Maherali, N., Breault, D. T., Hochedlinger, K. Defining molecular cornerstones during fibroblast to iPS cell reprogramming in mouse. Cell Stem Cell. 2, 230-240 (2008).
- Brambrink, T., et al. Sequential expression of pluripotency markers during direct reprogramming of mouse somatic cells. Cell Stem Cell. 2, 151-159 (2008).
- Wernig, M., et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448, 318-324 (2007).
- Polo, J. M., et al. A molecular roadmap of reprogramming somatic cells into iPS cells. Cell. 151, 1617-1632 (2012).
- Wright, A. J., Andrews, P. W. Surface marker antigens in the characterization of human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 3, 3-11 (2009).
- O'Malley, J., et al. High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells. Nature. , (2013).
- Hansson, J., et al. Highly coordinated proteome dynamics during reprogramming of somatic cells to pluripotency. Cell Reports. 2, 1579-1592 (2012).
- Stadtfeld, M., Maherali, N., Breault, D. T., Hochedlinger, K. Defining molecular cornerstones during fibroblast to iPS cell reprogramming in mouse. Cell Stem Cell. 2, 230-240 (2008).
- Stadtfeld, M., Maherali, N., Borkent, M., Hochedlinger, K. A reprogrammable mouse strain from gene-targeted embryonic stem cells. Nature Methods. 7, 53-55 (2009).
- Sommer, C. A., et al. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 27, 543-549 (2009).
- Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2, 3081-3089 (2007).
- Utikal, J., et al. Immortalization eliminates a roadblock during cellular reprogramming into iPS cells. Nature. 460, 1145-1148 (2009).
- Stadtfeld, M., et al. Ascorbic acid prevents loss of Dlk1-Dio3 imprinting and facilitates generation of all-iPS cell mice from terminally differentiated B cells. Nature Genetics. 44, 398-405 (2012).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 9, 588-598 (2011).
