Introduction
クラスリン依存性エンドサイトーシス（CME）の過程は、小胞1-3に貨物を収集し、原形質膜を操作するクラスリン媒介エンドサイトーシス機構の多くのコンポーネントの時宜を得た到着時に依存している。 CMEは、膜が変形し、エンドサイトーシス1の発生期の現場で一緒になる貨物アダプタータンパク質によって開始されます。これらのタンパク質は、クラスリン被覆ピット（CCP）4を形成し 、かご状構造に組み立てるコートタンパク質クラスリンを募集。 CCPが完全に球状に組み立てられると、膜の切断は、主に大規模なGTPアーゼの作用を介して、ダイナミンは、無料のクラスリン被覆小胞（CCVS）5,6を生成します。この内在化は、コンポーネントが、CMEの複数のラウンドのために再利用することができるように、クラスリンコートの急激な分解をトリガします。
CMEに関与するタンパク質の発見および特徴は、伝統的なbiochに根付いてきたemical、遺伝的および顕微鏡技術4-6,8。これらのアッセイは、これらのエンドサイトーシスのコンポーネントの役割と相互作用点を解明した。売買機構の必須成分を定義するために非常に有用であるが、これらのアッセイは、高度CMEコンポーネントまたは貨物濃度の動的挙動を捉えることに限定されている。 CMEが定義されたステップにおけるタンパク質のモジュールのセットの振り付けアセンブリによって駆動されるので、これは重大な制限であり、そして個別のエンドサイトーシスイベントのダイナミクスの小さな変化は、エンドサイトーシスに大きな累積的な結果をもたらすことができるからである。さらに、最近のデータは、個別の清算機関がこのプロセスの生理学的調節が非常に空間的および時間的に9-14を拘束されていることを示唆している、組成物中にと行動の両方で異なる場合がありますことを示している。個別のエンドサイトーシス事象の可視化、したがって、複数の冗長CMEに関与するタンパク質とどのようにこれらのタンパク質は、Bを制御することかもしれないがある理由を理解することが不可欠であるyの生理学的信号は、貨物内在化を調節する。
ここでは、生きた細胞内の個別のCCPのダイナミクスのレベルでCMEを観測する全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）の使用を記載している。 TIRFMは、カバーガラスとセル15,16の流体環境との間の屈折率の差に依存しています。励起光が臨界角以上で細胞に向けられるとき、それは内部カバースリップの上に、約100nmを拡張する照明の薄いフィールドを維持するエバネッセント波を作成し、反射される。これは、この狭いフィールド内の蛍光分子が励起されることを保証します。実際に、これは原形質膜上またはその近くの蛍光分子の励起を可能にし、細胞の内部部分からの蛍光を最小化する。これは、原形質膜、共同でイベントを視覚化するための有意に高い信号対雑音比、z軸の解像度を提供このような従来の落射蛍光または共焦点蛍光顕微鏡のようなより一般的に使用されるモードにmpared。また、入門、実用的なレベルで、個別の貨物エンドサイトーシスイベントの単純な形態学的特徴および動力学を分析し、定量するために一般に使用される画像解析プラットフォームの使用を記載している。
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Protocol
培養細胞における蛍光タグ付きCMEのコンポーネントの1の発現
HEK293細胞は、GPCRの生物学およびエンドサイトーシスを研究するために広く使用されているので、このプロトコルモデルとして使用される有用なモデル細胞である。過剰発現および低い細胞毒性のない均一な表現を提供する任意のトランスフェクションプロトコールを使用してください。
- 無菌層流フード内のすべての細胞培養物を処理します。 10％ウシ胎児血清（FBS）を含むダルベッコ改変必須培地（DMEM）1mlで12ウェルプレートの4ウェルを埋める。 HEK293細胞のコンフルエントT25フラスコから4つのウェルのそれぞれに、それぞれ1:50、1:25、1:16、1:10に希釈する。
- あるいは、製造業者の指示に従って、所望のサイズのマルチウェルプレートに細胞を播種する。 12ウェルプレートに2×10 4個の細胞- 0.4をシード。 5％CO 2および95％湿度で滅菌37°Cに一晩細胞を成長させる。
注：その成長rを考慮のATEは、条件および細胞株に依存して変化し、それがトランスフェクションのために次の日、または二重にトランスフェクションを実施する可能性を理想的な密集度を確保するための複数のウェルに接種することが好ましいかもしれない。
- あるいは、製造業者の指示に従って、所望のサイズのマルチウェルプレートに細胞を播種する。 12ウェルプレートに2×10 4個の細胞- 0.4をシード。 5％CO 2および95％湿度で滅菌37°Cに一晩細胞を成長させる。
- 翌朝、トランスフェクションのために〜70％コンフルエント（ 図1Bを参照）であるだけでなくを選択します。全くよくこの状態に達していない場合、別の日を待つ。
注：70％の密集度は、HEK293細胞に最適です。細胞死および毒性がよりまばらな結果である細胞をトランスフェクトする。貧しい式の過コンフルエント細胞の結果をトランスフェクション。 - 製造業者のプロトコルに記載されているように60μlのバッファー（トランスフェクションキット）からECを追加し、コードするプラスミド400ngのは、1.5mlのマイクロチューブにGPCRを、および/またはクラスリン機構の成分、およびエンハンサーの2.4μlのタグ付き。 2秒間のボルテックスは、十分な混合を確実にし、下部の液体を回収するために2秒間2000×gで微量スピンする。
- 加えるのEffecteneμlの6製造業者のプロトコルに記載のように。マイクロフュージ中2秒間2000×gで2秒間ボルテックスし、スピンが下部の液体を収集します。トランスフェクション複合体ミセルの形成を可能にするために20分間待ちます。
- ウェルから培地を吸引除去し、トランスフェクトされる。静かにトランスフェクション試薬混合物に、10％FBSを含むDMEM 0.8mlのを追加し、ミセルを壊す減らすためにゆっくりとピペッティングして混ぜる。非常にゆっくりと横からだけでなく、メディアおよびトランスフェクション混合物を追加します。ピペットを用いて、マイクロチューブからウェルに残っているトランスフェクション混合物を追加します。
注：必要に応じて、細胞の穏やかなトランスフェクションおよび下一過発現を生じる余分な栄養を与えるためにトランスフェクトウェルに10％FBSを含むDMEMの余分な0.5ミリリットルを追加します。 - 5時間37℃のインキュベーターにセルを返します。
- トランスフェクション混合物を含有する培地を吸引する。 10％FBSを含む1mlのDMEMと交換してください。許可する細胞は一晩成長させる。
- 次の日、以前にオートクレーブ滅菌コーティングされていないカバーガラスに細胞を渡す。
- 各ウェルに1 mMのEDTAでリン酸緩衝生理食塩水（PBS）の0.5ミリリットルを追加します。代わりに、0.05％トリプシン-EDTAを0.5ミリリットルを使用しています。 1分間インキュベーター内にしておきます。
- 3ラウンド、6ウェルプレートの個別のウェルに滅菌した25mmのカバースリップを置きます。メディア2mlで各ウェルを埋める。静かにカバーガラスの底に成長してから細胞を防止するために、ウェルの底にカバースリップをプッシュ。
- 手動で井戸の底から細胞をリフトオフするだけでなくを攪拌。再懸濁するために10％のFBSを含むDMEMを1mlを追加します。 3カバーガラスに均等に12ウェルプレートの1ウェルから持ち上げ細胞を配布します。別の方法として、3ガラス底のディッシュに細胞をプレー。
- 細胞はイメージング前に少なくとも48時間、カバーガラス上で成長させる。細胞が広がって平られていることを確認します。
2。TIRFMを使用したCCPと貨物ダイナミクスのイメージング
- 製造業者のプロトコルに従ってアレクサフルオロタンパク質標識キットを用いてAlexa色素と共役M1抗FLAG抗体。あるいは、プレジュゲート抗体は、購入することができる。
- （イメージング、37℃で10分間、50mMのHEPES（pH7.4）および10％のFBS、10％のFBS、またはのOpti-MEMで予め温めリーボビッツ培地1mlで1,000希釈：1での抗体で細胞をプレインキュベート培地）、細胞表面上のFLAG標識GPCRを標識する。 GFPなどの遺伝的にコード化された蛍光タンパク質は、タグとして使用されている場合（詳細については説明を参照）の手順を省略します。
- 生細胞イメージング室にカバースリップを転送します。別の方法として、ガラス底ディッシュ、吸引抗体標識メディアの予め温めた画像形成媒体700μlのを追加します。
- ピンセットを使用したフックに25ゲージの針の先端を曲げる。
- 利き手でピンセットを持ちます。 OTHに曲がった針をホールドえー。下にしてガラス面に向けてフックカーブまで針を回します。それはカバースリップの上にフックまで、慎重6ウェルプレートの下部に、上下針、フック側をドラッグします。それは細胞を剥離するように、カバースリップの表面を傷つけないように注意してください。ゆっくりウェルの底からカバースリップを上に持ち上げます。サポートのためのウェルの壁にカバースリップのバランスをとる。
- カバースリップの縁付近に把握し、画像化チャンバにカバースリップセル側を上に移動し、チャンバーを組み立てるために鉗子を使用してください。予め温めイメージング媒体700μlの（あるいは適切な量）を追加します。割れや破損を防ぐために圧力なしに慎重にカバースリップを処理します。
- 顕微鏡にチャンバーを移し、ステージヒータまたは同封インキュベーターを使用し、37℃での細胞の温度を保つ。
- 100Xまたは60X TIRF油浸対物レンズ（上記1.45 NAまたは）を使用して焦点に細胞を持参してください。イメージ従来のエピ蛍光または詐欺のセル適切な構築物を発現する細胞を同定するための照明の焦点モード（ すなわちないTIRFM）。ピンボケ細胞は、それが困難焦点面および細胞を見つけることがTIRF照明の薄い深さはほぼ見えない。
注：一部のシステムでは、臨界角より上のレーザーの入射角を移動することによって、従来の落射蛍光画像にTIRFMで同じレーザーを使用しています。重要な安全上の予防措置として、常にレーザビームの角度を認識しており、常に観察者から離れてそれを指示。 - 細胞周囲の原形質膜の輪郭が消え、セルの中心が表示されるまで発現する細胞の底面にまで焦点を当てる。これは、μ-オピオイド受容体（ 図2Aを参照）のように、原形質膜局在化カーゴタンパク質と最も明らかである。
- TIRFイメージングに切り替えます。
- 従来のエピ蛍光撮像に同じレーザを使用する場合は、の入射角を大きくする細胞の内部で焦点外の蛍光までレーザが消失し、細胞周囲の原形質膜のない輪郭が見られない。 （ 図2Aおよび2Bに図2Cの比較）
注：TIRFMでは、焦点面を移動すると、フォーカスおよび/または薄暗いから完全に行くために画像を引き起こし、全体的な蛍光レベルは、照明の小さい深さに起因して減少する。 TIRFM照明に切り替える別の方法は、従来の/共焦点落射内のセルの中央にピントを固定しているため、その後は蛍光の大部分を失うまで、入射角を増加させ、その後、細胞膜にダウンして焦点を当てています。 - 一度TIRFMにおいて、励起レーザーを対物レンズを通して戻って反映しており、客観的な上記の表示されていないことを確認してください。レーザスポットが表示されているかどうかをチェックすることによって、これを確認してください。
注：従来の落射蛍光または共焦点モードでは、レーザー照射は、客観的な上記の表示されている天井など。 - 鮮明な画像を得るために焦点を絞り込む。エンドサイトーシス機構の主なコンポーネントは、そのようなクラスリンなどの、涙点に表示されます。罰金にフォーカスを調整しますので、涙点は可能な円形のとおりである。
注：糸状仮足が区別表示されるまで、膜局在貨物については、細かいピントを調整します。 - ミラーや全反射角など、すべての撮影パラメータを保存するために取得プログラムを使用してください。必要なすべての波長に対してこれを行います。
- 従来のエピ蛍光撮像に同じレーザを使用する場合は、の入射角を大きくする細胞の内部で焦点外の蛍光までレーザが消失し、細胞周囲の原形質膜のない輪郭が見られない。 （ 図2Aおよび2Bに図2Cの比較）
- 図3Aに示す例では、μ-オピオイド受容体とアダプターβ-アレスチン：すべての必要なエンドサイトーシスのマーカーを発現する細胞を見つけることをカバースリップの周りにスキャンします。表現するが、過剰発現されていないセルを選択します。詳細については、説明を参照してください。
- 細胞が同定されたら、10分間の画像毎に3秒を取得する。これらの条件下で撮像されたHEK293細胞におけるCCPの平均寿命は、アロであるので、これは、CCPの寿命を捕捉するのに十分であるウント40秒10-11。これは、CCPを観察する約12〜14フレームを可能にします。たとえば、 ムービー1を参照してください。画像追加のセルへのすべての手順を繰り返します。
手動検査によるエンドサイトーシスダイナミクス3。解析
CCP寿命の手動検証を大幅に検出することが可能と清算機関の数によって制限されていますが、静止画および検出アーティファクトの全体的な変化によって引き止められていない検出の正確な手段残る。詳細については、説明を参照してください。
- ImageJの中のファイルを開きます。画像は、インタリーブチャンネルのTIFFファイルの単一のスタックとして保存されます。 hyperstacksに画像を変換します。 Hyperstackへのイメージ> Hyperstacks>スタックに移動します。取得されたチャネル数を入力します（ すなわち 、β-アレスチンとμ-オピオイド受容体を画像化する場合には、2を入力します）、（TIRFMは単一の平面である）、Zスタックに1を入力して、映 画のフレーム数（ すなわち 10分1フレームごとに3秒iにおける映画ポップアップウィンドウ内の200）。
- hyperstackフォーマットは2つのスクロールバーを持つウィンドウを生成します。時間を移動するチャネルおよび底部を通って移動するには、トップバーを使用します。寿命アッセイするタンパク質のチャネルにスクロールします。
- 全体の持続時間表示されていない既存の清算機関を含めることを減らすために、映画の10または15をフレームに移動します。無作為に選ばれたスポットを中心にカラーボックスを描画します。
- スポットが表示されているフレームの数をカウントします。
注：エンドサイトーシス事象10,11,16-19の3形態学的分類の例については、 図3B及び図3Cを参照してください。
客観的認識によるエンドサイトーシスダイナミクス4。解析
客観的認識は、細胞内で画像化されたCCPの事実上すべての検出を可能にするが、誤構造のスプリアス検出の誤差を受けやすいことができます。 Eの長所と短所を計量する詳細については説明を参照してくださいACH法。特注のアルゴリズムを含むいくつかのプログラムは、客観的に清算機関を検出するために使用され得る。このプロトコルは、Imaris、画像解析ソフトを（ 材料を参照） を使用して、清算機関の客観的認識を説明しています。
- 開始するには、画像解析ソフトウェアで、RAW画像ファイルを開きます。デフォルトでは、マージされたカラー画像が表示されます。チャンネルの明るさを調整する「画面の調整」ウィンドウを使用します。表示された色を変更するチャンネルの名前をクリックします。その表示を防止するためのチャネルの横にチェックボックスをオフにした（ 図4Aを参照してください）。
- オレンジ色の斑点が付いたアイコンをクリックして、「スポット」を作成します。 図4Bを参照してください。セルの周囲関心領域（ROI）を選択します。 図4Cを参照してください。間違って明るく前縁とプラークを検出した領域を除外するようにROIを使用してください。別途異なる発現レベルを有する複数のセルを分析します。
- 専らするスポットの直径を測定しますアルゴリズムのデ初期推定。 「スライス」モードに切り替えて、その直径を測定するために、スポットの極性両端をクリックしてください。 図4Eを参照してください。形成後切断する前に、その安定性の高さで、CCPの指標と見て4または5ラウンドのスポットのためにこれを行います。ミクロンの四捨五入までの平均直径を計算するために、これらの測定値を使用します。
- スポットを検出。 「サーパス」モードに戻ります。検出のための適切なチャンネルを選択します。平均測定直径、通常は0.3または0.4ミクロンを入力してください。スポットを定量化するために青色の右矢印をクリックします。 図4Eを参照してください。スポットの直径が過小評価されている場合は、蛍光のスプリアス点がスポットとして識別されます。直径が大きすぎると、真のスポットは無視される。ときにわからない、少し低く推定し、それ以降の不正な検出を除外する。
- 品質によってスポットをフィルタリングします。バックすることなく、できるだけ多くのスポットを捕捉するフィルタを調整する地面。品質フィルタは、デフォルト20によって選択される。 図4Fを参照してください。
- 適切なしきい値を設定するためのガイドとして「品質」曲線を使用してください。曲線のこの最初のディップにマウスの左ボタンでフィルターの底のしきい値を移動します。この位置は通常は目に見えるスポットに検出を洗練ので、これは、フィルタのための良い出発点である。 図4Fを参照してください。
- 検出されたスポットは、球体または中央画素としてムービーに表示されます。 「色」タブを使用して、それが簡単にそれらを見るようにすること対照的な色にスポットの色を調整します。各フレーム内のスポットを確認するには、ムービーをスクロールします。目標は、その寿命全体のためにできるだけ多くのスポットを検出することである。
- 彼らは生涯の過程で十分に検出されないように、調光スポットを排除するか、後で手動での継続的なトラックに接続してください。
- 「強度」FIL明るい斑を削除するター、必要に応じて。新しいフィルタを追加するには、緑色のプラス記号をクリックします。 図4Fを参照してください。与えられた蛍光シグナルのスポットやフィルタリングする強度フィルタを作成します。しきい値を設定する（品質曲線に類似したが、4.5で説明します）、生成された強度曲線を使用してください。明るいスポットを表す曲線の極端な左端を削除するには、マウスの左ボタンを使用します。
注：大プラーク構造は、セル内の明るい要素のうち通常は、それらは容易にフィルタで除外される。 - 清算機関は、スポットとして検出されず、明るい斑がもはや検出されたことを確認するために、ムービーをスクロールします。 図3Dは、（白い球で示される）のCCPの検出は、高品質のフィルターを用いて最適化したプラークが品質で除外されたセルを示しているフィルター。
- 品質のフィルタの明るいセルエッジを減らします。明るい物体は、まだ次のステップでは、手動で削除する必要があるかもしれません。青を続行矢印。
- 編集スポット画面で異常スポットを削除します。モードを「選択」に切り替えます。スポットをクリックします。それは黄色に変わります。 「削除」をクリックしてください。アルゴリズムの構築を継続して青い矢印をクリックします。 図4Gを参照してください。
- トラックを測定します。 「ブラウン運動は、「CCPはどんな監督の動き、原形質膜を横切って、最小限のドリフトを示してはならないようにトラックを設定します。このアルゴリズムは、その動きのために最も適切である。 図4Hを参照してください。
- 0.7μmのような小さい値に最大距離を設定します。 図4Hを参照してください。
注：小さな距離を設定すると、隣接するスポットの接続を最小限に抑え、まだCCPスルーセルスポットや細胞運動の継続追跡を可能にします。 - これは、連続して不足している1つのフレームのみが存在する場合、トラックが継続することができます1に最大ギャップサイズを設定します。トラックを計算するために青い矢印をクリックします。 図4Hを参照してください。
注：G3つ以上の原因が異なるトラックのpサイズが誤って一緒にリンクする。 - に表示して、スイッチ·トラック「ドラゴンテール。「スクロール検出品質を観察映画を通して。隣接するスポットが接続されている場合は、0.7ミクロン以下の最大距離を減少させる。スポットがあまりにも容易に分解されている場合、最大ギャップサイズを大きくします。トラックを作成するには青い矢印をクリックします。これは、フィルタトラック画面につながる。 図4Hを参照してください。
- 0.7μmのような小さい値に最大距離を設定します。 図4Hを参照してください。
- トラックとデータのエクスポートをフィルタリングします。追加の明るいプラークを除去するために「インテンシティ」フィルタを使用します。 TIRFフィールドを入力エンドソームを削除するには「変位」フィルタを使用します。長いスポットが同様に長い変位を持っているように、十分に注意してください。プロトコルを完了するために、緑色の二重矢印をクリックします。 図4Iを参照してください。
- フィルタによって除去することができなかったトラックの誤認検出を削除するには、鉛筆のアイコンで、編集トラック]タブを使用します。 discontをチェックinuitiesまたはfalseの接続。二つのトラックを接続するには、[編集]トラック]ボックスに「接続」をクリックし、Ctrlキーを押しながら左クリック使用してそれらを選択します。個別のスポットにトラックを切断するには、トラックを選択し、「切断」を押してください。を持つ複数のスポットを選択してCtrlキー+左クリックして、新しいトラックを作成するために「接続」をクリックします。この方法は、4.5.7で説明した編集スポット、についても同様である。 図4Jを参照してください。
- データをエクスポートするには、統計]タブに移動します。選択した統計をエクスポートするために、単一のフロッピーディスクのアイコンをクリックします。すべての統計情報をエクスポートするフロッピーディスクの一連のようなアイコンをクリックします。 「トラック時間」統計は、エンドサイトーシスのトラックの長さが含まれます。 図4Kを参照してください。
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Representative Results
生細胞TIRF顕微鏡を用いて、私たちは、Gタンパク質共役受容体（GPCR）とそのエンドサイトーシスアダプタータンパク質β-アレスチンをμ-オピオイド受容体（MOR）のエンドサイトーシスダイナミクスを記録している。 β-アレスチン構築物は一過性に、図1で概説したプロトコルを用いて安定に発現MOR細胞株にトランスフェクトし、96時間後に画像化した。安定した細胞株におけるMORはN末端pH感受性GFPでタグ付けされる。この蛍光タンパク質は、中立的な細胞外液に蛍光を発する。また、MORは一度だけ、アゴニストによって活性化endocytoses、それ以外均等に原形質膜に分散されたままである。薄暗い蛍光で満たされている細胞内の共焦点モード結果にカバーガラスの上に座っている接着性の細胞質膜に着目。これは、原形質膜のみをセルの周囲の蛍光のリングとして見られているセルの中心に焦点を当てて異なっている。左の比較図2（a）の右のパネル。誤った角度で、従来の落射蛍光またはTIRFに切り替えると、 図2（b）に示すように、同じ細胞で明らかになるように、焦点蛍光からなる。 TIRF角が正しい場合は、原形質膜は、非常に、鮮明なはっきりと明るくされず、焦点蛍光のうち、もはやイメージを破壊する。 図2Aおよび2Bに図2Cを比較してください。
MORが大きくTIRFフィールド内にある接着性の細胞質膜、上にあるため、画像が鮮明である。これとは対照的に、β-アレスチンは、まだエンドサイトーシス涙点に動員されていないときの細胞質ゾルプールに残り、それがTIRFフィールドではないため、かすんで、焦点の外に表示されます。 MORは、アゴニストによって活性化されると、β-アレスチンは、原形質膜に動員され、β-アレスチンと受容体の両方が清算機関（ 図3Aおよびムービー1に再配布されている 、赤、緑、MOR中のβ-アレスチンは、オーバーレイ）が黄色です。
図3Bに示すように、これらのクラスタの寿命を手動で完了し、エンドサイトーシスのための3つのパラメータを用いて定量化することができる。清算機関は完全に消失するか示すスポットはオンとオフを「点滅」以上の構造を「ピンチオフ」、（これも図3Cを参照）。後者の2つの条件が空間的にあまりにも接近している独立したイベントとして解決すべきイベントを表す。 図4に概説されるようImarisにおけるスポット検出アルゴリズムは、清算機関を定量化することも有用である。 図3Dは、CCPの非動的プラーク構造を除去するために濾過した後、Imarisを用いて検出表す。オーバーレイ白い球が検出されたスポットを示す。彼らの全体の寿命のために検出することができなかったディマースポットも「品質」のフィルターで除外された。
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図1：トランスフェクション手順のフローチャート。 （A）まず、12ウェルプレートに（1:50 25,1 1:16、1:10）希釈液を、さまざまなシード。細胞は一晩増殖させます。次の日には、描かれているように、約70％コンフルエントであり、かつ均等に分散よく探します。これは、トランスフェクトされ順調です。（B）は、マイクロ遠心チューブにECバッファー60μlのとDNAの400 ngのを追加します。 10秒間ボルテックスし、チューブの底に液体をスピン。エンハンサーの2.4を添加する。 2秒間ボルテックスし、チューブの底に液体をスピン。 3分間室温でインキュベートする。エフェクテンの6を添加する。 2秒間ボルテックスし、チューブの底に液体をスピン。 20分間室温でインキュベートする。（C）ゆっくりとトランスフェクションの10％FBSを含むDMEM 0.8 mlで混合する。以前よく、選択中の細胞に加える。 37℃で5時間、細胞をインキュベートする。新鮮と交換10％FBSを含むDMEM。
図2：TIRFMフィールドを見つける。 （A）共焦点で撮像された原形質膜。左のパネルは、セルの中心を中心とした共焦点内のセルを示している。原形質膜のみを細胞周囲に「リング」として見られる。基底細胞膜にダウン中心に、カバーガラスに隣接するセルは薄暗い蛍光で埋めされます。原形質膜「環」シンナーTIRFフィールドに表示されないようにしてください。（B）試料を透過、従来の落射蛍光照明を生産浅いTIRF角基底原形質膜。これは、セルの上からセル全体とフォーカス蛍光のうち多くが存在しているが点灯します。（C）TIRF形質膜を。糸状仮足を中心に、この平面を見つけるのに役立ちます。それがあることに注意してください滑らかな単一面。スケールバーは10μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：TIRFにおけるエンドサイトーシス事象を可視化し、定量化。 （A）エンドサイトーシスを誘導するアゴニストの添加前と後のμ-オピオイド受容体（MOR）とβ-アレスチンを発現する細胞。アゴニストは、エンドサイトーシス涙点に両方のタンパク質の再分配を引き起こす。スケールバーは10μmである。（B）アレスチンのダイナミクスは、前述の形態と一致して可視化することによって見たエンドサイトーシス事象、の3種類。 「安定」、急速に消えて1着実信号。これはCCPが出芽し、全反射を出たことを示す、主なタイプです。 「ブリンク」、点滅する信号低い信号へと同じ場所で第二CCPの組立のために同じ場所で再表示されます。 2清算機関があまりにもお互いに近い明瞭なスポットとして解決しようとする場合、筒状突起がスポットを外れ、「オフピンチ」、もう一方はエンドサイトーシスされる。ボックスには、2×2μmである。（C）のシングルイベント解像度でMORのクラスリン依存性エンドサイトーシスの可視化。 MORエンドサイトーシスイベントの大部分を表す2つの例が示されている。フレームごとに3秒です。ボックスには、2×2μmである。Imarisを使用して個別のエンドサイトーシスのイベント（D）検出。ホワイト球がスポットとして検出されたCCPを示す。スポット検出は、「品質」フィルターを使用して最適化した。生涯の全体のために検出することができなかったディマースポットは、品質フィルターで除外された。未検出されるものとして示されている大きなプラーク構造は「強度」フィルタを用いて除外した。ig3large.jpg "ターゲット=" _ブランク」>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：Imarisを使用してエンドサイトーシスのイベントのダイナミクスの客観的認識。ステップ4.1で説明したように、（A）表示の調整ウィンドウは、画像の表示を調整するために使用。（B）の 「スポット」アルゴリズムビルダーを開く。ビルダーは、以下のウィンドウに表示されます。（C）スポットアルゴリズムビルダーの第一段階。 「（時間をかけて）トラックスポット」をチェックし、必要に応じて」、関心の領域のみセグメント」を確認してください。（D）、ROIの選択画面。詳細は、 ステップ4.2を参照してください。（E）を測定したスポットの直径を定義するのに必要な複数のウィンドウ。パネルは表す：ナビを使用して、スライスモードへの突破からの切り替え測定された直径が測定された直径を入力するには、一般的にはるかに右側に、表示されたスポットの極性両端をクリック一番上にゲーションバー、。参照のステップ4.3から4.4。（F）4.5-4.5.3に記載されてスポット品質のフィルタ。4.5.7で説明した（G）の編集スポット]ウィンドウを開きます。（H）を測定トラックと表示トラックの窓、4.6で説明した。（I） 4.7に説明されているフィルタトラックウィンドウ。（J）編集4.7.1で説明したウィンドウを追跡します。4.7.2で説明した（K）のセーブデータ画面。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ムービー1 。
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Discussion
ここでは、リアルタイムで生きた細胞内の個別のCCPのレベルでクラスリン依存性エンドサイトーシス（CME）を可視化するTIRFMの使用を記載している。 CMEは、多くの空間的および時間的に独立した個別のイベントの累積効果により媒介される迅速かつ高ダイナミックなイベントです。そのような結合は、フローサイトメトリーまたは固定細胞アッセイは、内在化タンパク質の量、またはタンパク質の電子顕微鏡局在化を測定する表面ビオチンまたはリガンドを用いて、内在化の生化学的測定値として現在使用されているほとんどのアッセイは、固定された時点でのタンパク質局在のアンサンブルの変化を監視。これらの既存の方法は、CMEのために必要であるが、CMEや他の動的な膜輸送プロセスの生理的尺度に一致する空間的および時間分解能を欠くタンパク質を特定するのに非常に有用であった。最近の証拠は、清算機関がそのタンパク質組成とダイナミクス9-1に不均一であることを示唆しているので、これは重要です2、およびCMEはそう急速に空間的に離散的に規制されているように。ライブセルTIRFMは、生細胞中で、リアルタイムで、空間的に分離された単一のCCPのレベルでCMEを分析する機能を提供します。
細胞の健康とCMEのパラメータを徹底的に分析：この強力なアッセイの成功のアプリケーションは、2つの重要な要因に依存しています。タグ付けされたタンパク質や光毒性を最小限に顕微鏡技術の元、適切な発現のために重要である。発現レベルは確実に推定することができるように、目的のタンパク質を安定に発現する細胞株は、理想的である。私たちは、どちらかのN末端FlagエピトープまたはSPHタグ21-25で受容体にタグを付ける。厳密には必要でないが受容体を選択的実験の開始時に原形質膜上で検出することができるので、両方の標識系は、CMEのTIRFMを容易にする。所望の付加的なエンドサイトーシスの成分はまた、一過性に、これらの安定な細胞株にトランスフェクトすることができる。 TRansfectionプロトコルは、ここで注目TIRFMを用いた撮像CME用に最適化されています。まず、表現の偶数及び中程度のレベルに合わせて調整される。貧しい発現は検出のために、より高いレーザーパワーを必要とし、光毒性および光退色の両方のリスクを増加させる。このアッセイは内在化のCCPとして涙点の消失を記録ので、低信号と光退色は、分析にも有害である。私たちは、これらの状況下で、総持続時間および/または画像化の頻度を低減すること、を示唆している。第二に、細胞へのトランスフェクション試薬の短いインキュベーション、トランスフェクション実験、およびイメージングの前にカバーガラスへのトランスフェクションされた細胞の新鮮な継代の間隔は、すべてが画像化され、細胞が最適な健康であることを確認してください。第三に、これはクラスリン構造の大半はクラスリンやクラスリンプラークの平坦なシートのCCPであり、しないことを保証します。第四に、このプロトコルはショーされているトランスフェクトCMEの構成要素の過剰発現を、最小限に抑えるnはCMEのダイナミクス20,26を変更することができる。
低い光毒性を有するイメージングのためには、最適な解像度と最大感度のためのイメージングシステムを最適化することが重要である。客観的で、カメラの検出器の大きさの倍率が過小またはオーバーサンプリングと空の倍率を最小にするようにマッチングさせる必要があります。高開口数（1.45以上）TIRFの目的は、可能な最大の光を収集するために使用されるべきである。私たちは高い量子効率、低い露光時間、及び高速読み出し速度に対して電子増倍電荷結合素子カメラで画像を取得する。さらに、細胞の健康を確保するために、それらはCO 2の独立したバッファリングされリーボビッツ培地に結像され、37℃に設定し、完全に囲まれたチャンバ内で、10％FBSが補充される。 TIRFMは非常に敏感であり、使用される高開口数の対物レンズであっても、最小限の周囲光を検出することができるので、自由囲ま撮像環境を作成することが重要である細かい焦点面が中断される場合があり、外光や振動から。
これは、CMEのほとんどの成分の絶対寿命とダイナミクスが重く細胞型、タンパク質の発現レベル、温度、めっき日後、培養条件7,10,14,17,20における他の変化に応じて変化することに留意することが重要で25,27。これは、この技術を用いて、異なるグループ間で観察されたタイムスケールと分布に大きなばらつき、このアッセイの明確な制限に反映されている。また、TIRFMで結像セルの底面上のCCPは、上面23,25とは異なって挙動することが可能である。正確に組織中の細胞外マトリックス成分によって囲ま「典型的な」セルを表すためにどの表面としては、議論の余地があるが、この技術によって見CCP動態の解釈は、この電位差を考慮する必要がある。アッセイの真の強さは、従って、dの変化を比較することにあるそのような活性化に応答するGPCRとしてカーゴ分子のクラスタリングを含む急性の操作の後、同一の培養条件下で、同じ細胞内でのCCPのynamics、、。この比較は、それによって、CCPの挙動の変化を誘発する可能性のある上記のすべてのパラメータをコントロールし、同じセルへの変更の正常化が可能になります。
手動検証およびImaris画像解析ソフトウェアを用いて認識対象：私たちは、典型的には、エンドサイトーシスイベントの継続時間を分析するために、上述の手動と自動の両方の分析を採用する。それは、ユーザーが数えることができる清算機関の数によって制限されているように手動検証は、労働集約および時間集約的であるが、それは間違いなく利用できる最も正確な手法である。訓練された人間の目は簡単に細胞運動を通じてCCPを追跡するために継続し、形状や焦点の変化を正確にプラークおよび欠陥画素を除くことができます。また、完成した前夜の指標とCCPの形態学的変化を検出することができます国税庁、 図3B及び図3Cに示すようにされている。それは、分析は、これらの制約の範囲内で可能な限り客観的なままであること、しかし、必須である。これは、すべてのデータセット全体で一貫して使用される特定の基準を定義する必要があります。さらに、当社は通常、条件が画像を分析者には不明のままであるように画像名がスクランブルされている二重盲検法、画像を分析します。自動検出は、 例えば、Imarisの「スポット」および「トラック時間」アルゴリズムを使用して、高いサンプル数を生成し、指定された映画の中のエンドサイトーシスのスポットのほとんどを検出するために用いることができる。非常に複雑なカスタムメイドのアルゴリズム3,14,23,26,27を含む多くのオプションが、生成されている間、スプリアス検出を回避しながら、正しいエンドサイトーシス事象を検出するためのこれらの方法の信頼性が最大の懸念残る。たとえば、Imaris、明るい前縁を作る細胞運動において、プラーク、および外それは完全にスポットで構成されていると、明るい構造を検出する傾向があるように、フォーカスフレームが簡単に、スポット検出アルゴリズムをオフに投げることができる。トラックに接続されているから、これらのスポットを防ぐために、それらはすべて除去されなければならない。接続されたスポットは、後で編集タブトラック使用して除去されてもよいようなプラークのような大きな構造に含まれていない単一の異常なスポットは、タブを編集してスポットを除去してもよい。異常スポットはまた、カスタムフィルタで除去することができる。例えば、 図3Dは、CCPの検出におけるプラークを含む避けるを制限するために使用される強度フィルタを示している。品質フィルタが誤ったスポットを削除するための別の非常に便利なフィルタです。 「品質」とは、明るさの累積測定値であり、スポット半径20の長さの¾によるスポットとガウシアンフィルタの蛍光強度を取ることによって発見および形状。品質曲線が選択されたフィルタの下に見出される。これは、検出されたスポットの数（y）を示している品質が一定の値（x）がある場合。品質が低いほど、より多くのスポットが検出されました。品質のフィルタが低すぎると品質のフィルタが高すぎると逆に、唯一の明るいスポットが検出され、目に見える蛍光がない場合、スポットが検出される。より大きな値（x）に向かって曲線に沿って従ってください。検出されたスポットの数（y）は、典型的には劇的に低下する。ここまで底のしきい値を移動します。これは一番下の閾値を配置する最小点である。 TIRFフィールドに誤ったスポットに他の主要な貢献者は、セルの周辺部に移動し、TIRFフィールドを入力してくださいエンドソームである。これらを除去するための堅牢な基準は、スポットの移動度であり、時間の経過とともにスポットの変位、すなわち 。エンドソームは、高速ブラウンまたは指向運動を呈するながらのCCPは、細胞全体の運動の一環として、いない限りはほとんど移動します。新しいアルゴリズムは、大幅に改善しながら、まだ洗練さ3,14,23,26,27最適化されています。これらが満たされるようにhods手動で各ポイントでそれらを検証しなくても、私たちは、スポットの数百または数千を分析することができ、より高度で信頼性の高いになる。しかし現在は、これら2つの分析精度のためにお互いを補完するために一緒に使用されることを示唆している。
私たちが説明したプロトコルは、簡単に貨物のエンドサイトーシスに関する多くの質問に答えるために適合させることができる。これは、CME成分と貨物の単純な共局在化を実行するために使用され、特定の刺激に起因するエンドサイトーシス機構の特定のコンポーネントに変更を表示するために使用することができる。アッセイはまた、容易に貨物やコート成分の離散的な濃度を示しており、特殊な細胞型におけるこれらの基本的なプロセスの研究にそのようなカベオラ28として、任意のエンドサイトーシスプロセスに適合させることができる。ゲノム編集は20,29,30主流になると将来、私たちはそれがコンポーネントをタグ付けするための好ましい方法となることを予測し、ダイナミクスと行動Oそのfのさまざまなコンポーネントは、さらに洗練される。細胞プロセスの理解が大きく、遺伝子、タンパク質修飾、およびインタラクトームの同定により駆動されたことを考えると、ここで記載されるアッセイは、すなわち、問い合わせの次のフロンティアのうちの1つを表す。これらのプロセスとメカニズムの時空間的動態の定義。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/High Glucose with L-glutamine and sodium pyruvate | Fisher Scientific | SH3024301 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Gibco, by Life Technologies | 21600-010 | |
| EDTA Free Acid | Amresco | 0322-500G | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco, by Life Technologies | 10437-028 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco, by Life Technologies | 21083-027 | |
| Opti-MEM | Gibco, by Life Technologies | ||
| HEPES | CellPURE by Fisher Scientific | BP2937-100 | |
| Effectene | Qiagen | 301425 | Transfection reagent |
| 25 mm coverglass | Fisher Scientific | 12-545-86 | |
| Corning cell culture treated flasks, 25 cm2 | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
| Cell culture 6-well plate | Greiner Bio-One, by VWR | 82050-896 | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M1 | Sigma Aldrich | F3040-5MG | |
| [D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-Enkephalin acetate salt (DAMGO) | Sigma Aldrich | E7384-5MG | |
| Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit | Life Technologies | A20173 | |
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| Imaris Image analysis software | BitPLane | http://www.bitplane.com/imaris/imaris, for automated analysis | |
| Nikon Eclipse Ti inverted microscope and required accessories including filter cubes and filters | Nikon | ||
| Nikon TIRF arm with required adapters for Nikon Eclipse Ti | Nikon | For adjusting angle of incidence | |
| iXon+ EMCCD camera and adapters | Andor |
References
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