سير العمل عالية المحتوى، الكمي خلية فردية من نيون علامات من المجاهر البيانات العالمي، بدعم من برمجيات المصدر المفتوح

Summary

قدم هو المعلوماتية سير العمل المرن تمكين المضاعفة التحليل القائم على الصورة من خلايا fluorescently المسمى. سير العمل الكمي علامات النووية وحشوية ويحسب علامة النبات بين هذه الأجزاء. يتم توفير إجراءات اضطراب الخلايا باستخدام سيرنا ومنهجية موثوقة لكشف علامة المناعي غير المباشر في أشكال 96-جيدا.

Abstract

التقدم في فهم آليات الرقابة التي تحكم سلوك الخلايا في ملتصقة نماذج زراعة الأنسجة الثديية أصبحت تعتمد بشكل متزايد على وسائل التحليل وحيدة الخلية. طرق التي توفر بيانات المركبة يعكس متوسط ​​قيم المؤشرات الحيوية من السكان الخلية خطر فقدان ديناميات حيوانية التي تعكس عدم التجانس في النظام البيولوجي دراستها. وتمشيا مع هذا، يجري استبدال الأساليب التقليدية التي كتبها، أو دعمها مع، أشكال أكثر تطورا من الفحص الخلوي المتقدمة للسماح للتقييم بواسطة المجهر عالية المحتوى. هذه المقايسات يحتمل توليد أعداد كبيرة من الصور من المؤشرات الحيوية الفلورسنت، والتي مكنت من المرافق حزم البرمجيات الاحتكارية، ويسمح لقياسات متعددة حدودي لكل خلية. ومع ذلك، فقد منعت التكاليف الرأسمالية العالية نسبيا وزيادة التخصص في العديد من هذه الأجهزة إتاحتها للكثير من المحققين.

الموصوفة هنا هوسير العمل المعمول به عالميا لتقدير حجم متعددة شدة علامة فلوري من المناطق التحت خلوية معينة من الخلايا الفردية مناسبة للاستخدام مع الصور من معظم المجاهر الفلورية. المفتاح لهذا العمل هو تنفيذ متاحة بحرية البرمجيات التعريف خلية ¹ إلى التمييز بين الخلايا الفردية في هذه الصور، وجزء منهم في المناطق التحت خلوية محددة وتقديم كثافة مضان علامة قيم محددة لهذه المناطق. استخراج قيم الكثافة خلية فردية من بيانات الصورة هو الهدف الرئيسي لهذا العمل وسوف يتضح مع تحليل البيانات التحكم من شاشة سيرنا لG1 المنظمين تفتيش في الخلايا البشرية ملتصقة. ومع ذلك، فإن العمل المقدمة هنا يمكن تطبيقها على تحليل بيانات من وسائل أخرى للاضطراب خلية (على سبيل المثال، وشاشات المركبة) وغيرها من أشكال مضان مقرها علامات الخلوية، وبالتالي يجب أن تكون مفيدة لمجموعة واسعة من المختبرات.

Introduction

العمل المقدم هنا يصف استخدام متاحة بحرية التعريف البرمجيات خلية لأداء انهيار الموجهة الخوارزمية من الصور المجهري الفلورسنت من الخلايا الملتصقة لتحديد الخلايا الفردية والمناطق التحت خلوية محددة. هذا النهج، ويشار إلى تقطيع الصورة، يسمح لاحق التحليل متعدد حدودي من الخلايا المصورة عن طريق قياس علامات fluorescently المسمى المترجمة إلى كل خلية أو المنطقة التحت خلوية (يشار إلى كائنات مجزأة ع). ويشكل هذا العمل أساسا لتمكين تحليل عالية المحتوى، ويقصد لتكون بمثابة الأداة التي يمكن تطويرها وتعديلها لتناسب متعددة حدودي، ويحلل الخلايا الفردية في المختبرات دون الوصول إلى أدوات عالية المحتوى المتخصصة أو البرمجيات الاحتكارية. وتشمل الملفات المرفقة مع هذه المخطوطة مجموعة اختبار بيانات الصورة الخام ذات الصلة، وإعدادات خوارزمية والكتابات الداعمة لتوليد تحليل وصفها. وقدمت إعدادات خوارزمية وأو هي الأمثل التعريف خلية للبيانات المثال الذي والتفاصيل القسم مناقشة ما قد يكون التعديلات اللازمة لتمكين استخدام بيانات الصورة من الدراسات الأخرى.

مرة واحدة وقد تم استخراج البيانات الكمية باستخدام التعريف خلية، قد يكون مختبرات مختلفة متطلبات مختلفة عن كيفية استخدام المعلومات المقدمة من القيم خلية فردية في البيانات الخام. المبين هنا هو نهج واحد التي يتم من خلالها تطبيق البوابات إلى البيانات الخام لكل الفحص. باستخدام هذه البوابات، يتم تحويل البيانات إلى حيث ثنائية الاستجابة، مما يسمح التصور من الاتجاهات التي تربط بين العلاجات المختلفة مع مجموعات سكانية فرعية من الخلايا التي تمر استجابة محددة من الابواب. يتم تعيين بوابات بناء على ملاحظات توزيعات البيانات التي تم الحصول عليها لضوابط السلبية والإيجابية المناسبة لكل قياس ذات الصلة. استخدام البوابات هو مجرد مثال واحد من كيفية إدارة، والقياسات المعتمدة على الخلايا الخام. كما هو موضح هنا هو استخدام كثافة DNA النووية ليasurements في شكل الخام على أنها مجموعة من القيم المستمر في تركيبة مع البيانات بوابات. وينبغي النظر في المناهج الأخرى لإدارة البيانات تحليل الصور، وهذا يتوقف على طبيعة الدراسة؛ تم الإبلاغ عن بدائل إحصائية لاستخدام بوابات لتعيين الخلايا لمجموعات سكانية فرعية ² ومنهجية المقارنات استراتيجيات لتلخيص البيانات عالية المحتوى عبر تم الإبلاغ عن أعداد كبيرة من المعلمات ^3.

وقد وجدت تحليلات عالية المحتوى من بيانات الصورة استخدامها في الدراسات الخلوية من الاستجابة المخدرات، عكس الوراثة والإجهاد البيئي يشير ^4-6. ميزة تحليل عالية المحتوى تنبع من حقيقة أن تحليل حسابي من البيانات مضان المجهر يسمح المعلمات الكمية والمكانية التي سينظر فيها في وقت واحد عبر الخلايا الفردية ^(7). وبهذه الطريقة، يمكن للنتائج الخلوية لفحوصات متعددة يكون، والسلوك التفاضلي عبر المشار إليها من فحص-ديمكن تتبع القطعان خلية efined ضمن الظروف التجريبية وفحوصات يمكن أن تشمل النظر في المتغيرات المورفولوجية. الاستراتيجيات وتحليل سير العمل تناقش هنا، كما لنهج عالية المحتوى الأخرى، هي قادرة على تقديم البيانات المضاعفة التي يتم الرجوع إليها العابرة إلى الخلايا الفردية. دراسات عالية المحتوى أساليب الدعوى التي تولد الصور المجهر الفلورسنت وتنطبق على تحليل البيانات التي تتراوح بين عشرات الصور التي تنتج في انخفاض الإنتاجية التقليدية المجهري القائم على مضان من خلال لآلاف من الصور المنتجة باستخدام منصات فحص عالية المحتوى الآلي.

ويتضح سير العمل هنا مع البيانات المثال من الذي تقاس فحوصات منفصلة سواء من حيث شدة النووية علامة فلوري أو النبات حشوية / النووي من البروتين مراسل الفلورسنت، على التوالي. سير العمل يتسم بالمرونة في ذلك يمكن اعتبار هذه المقايسات على حدة أو مجتمعة تبعا EACح نظرا سؤال البحث من قبل المحققين مختلف. ويتم إنتاج البيانات المثال كجزء من التدخل RNA (رني) تجربة (الشكل 1). وتستخدم التدخل أليغنوكليوتيد] RNA الصغيرة (سيرنا) لضربة قاضية بروتينات معينة في HCT116 القولون البشري خلايا سرطان التي تؤدي إلى تغييرات لاثنين من الصحفيين الفلورسنت من التي تعتمد على السيكلين كيناز (للمعلمين) النشاط. ويتم تقييم الفسفرة التي تعتمد على CDK6 من البروتين الشبكية النووي في سيرين 780 (P-S780 RB1) من خلال تلوين الأجسام المضادة. في نفس الخلايا، ويتم تقييم الفلورسنت مراسل البروتين الموسومة الأخضر من النشاط CDK2 (مراسل GFP CDK2) من خلال برنامجها النووي إلى نسبة حشوية حيث في غياب النشاط CDK2 مراسل يقيم في النواة، وبناء على المكوكات تفعيل CDK2 إلى السيتوبلازم ^8. بالإضافة إلى ذلك، ملطخة DNA النووي من كل خلية باستخدام صبغ الإقحام DNA، Bisbenzimide، والتي هي بمثابة وسيلة لتحديد الخلايا وتحديد الحدود النوى في الصور بالإضافة لمقياس سا من وفرة DNA توفير المعلومات عن موقف دورة الخلية للخلية (الشكل 2).

أنشطة CDK6 وCDK2 يتم كشفها كخلايا العبور من G1 إلى S مرحلة من مراحل دورة الخلية ⁵ وينجح بعضها ^9،10 الآخرين، وعلى هذا النحو، ومن المتوقع التوافق الوثيق بين صحفيين اثنين في الخلايا الفردية. مجموعة البيانات مظاهرة المستخدمة هنا يحلل كمثال تأثير سيرنا يستهدف CDK6 والبروتين الشبكية (RB1) والسيطرة السلبية عدم استهداف (الجدول 1). ضربة قاضية من CDK6 يجب أن يثير على حد سواء انخفاضا من RB1 حاتمة P-S780 وتراكم الخلايا في المرحلة G1 من دورة الخلية. تخدم ضربة قاضية RB1 كعنصر تحكم كاشف لخصوصية الأجسام المضادة الفوسفات-S780. صور المجهر مضان من الفورمالين ثابتة ^11، وتستخدم الخلايا زراعة الأنسجة HCT116 الملون fluorescently لتحليل الصور حسابي. ثم يتم استخدام البيانات الرقمية مما أدى إلىترافقي للصحفيين وقياس تأثير الدول ضربة قاضية مختلفة.

الحجم المحتمل للبيانات التي ينتجها هذا النوع من التحليل يمكن أن يمثل تحديا لأدوات التحليل العادية. على سبيل المثال، يمكن للبيانات خلية فردية يكون أكبر من بعض البرامج جدول سوف تستوعب. وشملت هي مخطوطات برل التي تؤدي بسيطة، ودرجة عالية من التكرار، وتجهيز أشرف من البيانات لمساعدة تحليل مجموعات البيانات الكبيرة. تتم كتابة البرامج النصية بيرل خصيصا لملفات الإخراج التي تنتجها التعريف الخلية، عند معالجة ملفات الصور مع ملف تسمية اتفاقية محددة (الشكل 3)، والسماح لأعداد متفاوتة من الحقول لكل بئر لاستخدامها في التحليل. ومن المهم في كثير من الأحيان إلى فحص البيانات خلية فردية بوابة لتتبع الاتجاهات فى فئة خلية ⁵ والمبين هنا هو استخدام برنامج نصي بيرل لعلم كل خلية على أساس البوابة مجموعة محددة سلفا لكل نوع الفحص. كما شملت البرامج النصية بيرل اختياريالتي تلخص نتائج البيانات للآبار الفردية (أو الشروط)، وتقديم: النسبة المئوية للخلايا داخل البوابة مجموعة والقيم المتوسطة من عشرات فحص الخام. وهذا الأخير الطريقة، أكثر تجانسا من عرض البيانات، غير صالح حيث تؤثر على استجابات كل أو غالبية الخلايا داخل البئر. وكما ذكر أعلاه، فإن هذا التقييم هو أقل فائدة من تلك الممنوحة من قبل الأفراد النابضة بيانات الخلية حيث ينحصر ردا على مجموعة فرعية من الخلايا داخل السكان.

الأداة المساعدة من العمل صفه لا يقتصر على اضطراب من قبل سيرنا أو المقايسات علامة وصفها. وقد استخدمت دراسات هذا النهج لفحص الاستجابات في تجارب زراعة الأنسجة باستخدام مزيج من سيرنا، مثبطات الكيميائية والعلاج الإشعاعي وللتقييم من علامات أخرى من CDK6 والنشاط CDK2 ^5.

من الناحية النظرية، فإن استراتيجية تجريبية تسمح مجموعة متنوعة من المناطق التحت خلوية مفيدة من الناحية البيولوجية أن تكون مسجلة تلقائيافي الخلايا الفردية الموجودة في الصور المجهر الفلورسنت. على هذا النحو، يمكن لهذا النهج تسفر الكمية والبيانات المضاعفة الكشف عن المعلومات البيولوجية التي قد تضيع من خلال التقنيات التي تركز على السكان بدلا من الخلايا الفردية. مع تعديلات طفيفة، وسير العمل النهج وتحليل ووصف يمكن أن تسفر عن كمية بيانات الخلية، الفردية لأي مخرجات فحص القائم على مضان واستجابات الخلايا البيولوجية، حيث التقييم الكمي للمحتوى الحمض النووي، الكمي لمضان النووي أو حشوية أو مكوكية من علامات بين هذه اثنين من مقصورات إما بشكل فردي أو بطريقة المضاعفة هي التي تهم. كما تميل متطلبات النشر بشكل متزايد نحو تقديم البيانات الخام يمكن الوصول إليها بشكل علني، والوصول إلى والألفة مع أدوات مجانية لتحليل الصور المجهري مثل تلك الموصوفة هنا سيكون أيضا من مصلحة مباشرة إلى مختبرات تبحث لreanalyze البيانات المنشورة.

Protocol

1. التجريبية التشويش وصفها الخليوي لعلامات الاستجابة (عكس ترنسفكأيشن سيرنا الشاشة)

1. في غطاء نسيج الثقافة العقيمة ماصة 70 ميكرولتر من 200 نانومتر سيرنا في المخزن 1X سيرنا في الآبار لمعقمة، سهل 96 لوحة جيدا. تمييع ترنسفكأيشن الدهون في 40 مجلدا من وسائل الاعلام DMEM المصل خالية والاستغناء 105 ميكرولتر في كل منها يحتوي أيضا سيرنا.
   ملاحظة: تمييع 262.5 ميكرولتر من المادة الدهنية إلى 10.5 مل من المصل خالية DMEM ينتج مزيج الرئيسي مناسبة لكامل 96 لوحة جيدا من سيرنا، وتقديم 2.6 ميكرولتر من الدهون لكل بئر. واستخدام 200 نانومتر سيرنا تركيز ابتداء من الساعة هذه الخطوة تقديم تركيز العمل من 20 نانومتر في الخطوة 1.3، ولكن إجراءات العمل لتركيزات العمل وصولا الى 5 نانومتر، مع تركيز بدءا تبعا لذلك (أي 50 نانومتر). انخفاض تركيز العمل قد يقلل من خارج الهدف عشرات إيجابية كاذبة، على الرغم من أنها يمكن أن تقلل من حجم رد على الهدف، مما يؤدي إلى زيادة من على targeر معدلات سلبية كاذبة.
2. مزيج من لوحة عن طريق الاهتزاز لطيف لمدة عشر دقائق في درجة حرارة الغرفة. تقسيم الفرعي مما أدى 175 ميكرولتر إلى ثلاثة 50 ميكرولتر يعيد لكل هدف على ومبهمة، وزراعة الأنسجة المعالجة، لوحة 96-جيدا مع قاعدة شفافة.
3. بالنقل العكسي التي كتبها الاستغناء 8،000 خلايا لكل بئر في 150 ميكرولتر DMEM تحتوي على 10٪ مصل مباشرة على مجمعات للدهن سيرنا 50 ميكرولتر. استخدام HCT116 خلايا القولون والمستقيم الإنسان يعبرون عن مستقر علامة GFP الموسومة الإبلاغ عن النشاط CDK2 ^5،8. لا مزيد من الخلط هو ضروري. ختم لوحة مع لاصقة غشاء تنفس معقم للسيطرة على الرطوبة ومنع لوحة "حافة الآثار" ووضع لوحة في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO ₂ لمدة 48 ساعة.
4. نضح في وسائل الإعلام بحيث كمية صغيرة متبقية من وسائل الإعلام لا يزال في الآبار. إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من 4٪ الفورمالديهايد مخزنة إلى كل بئر واحتضان في غطاء الدخان لمدة 10 دقيقة في غرفة رemperature.
5. إزالة الحل تحديد بواسطة الشفط لوحة. عند هذه النقطة إما إيقاف التجربة عن طريق غسل لوحة ثلاث مرات مع 100 ميكرولتر الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ومن ثم تخزين مختومة، وأقل من 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في الظلام في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع، أو المضي قدما في permeabilization من الخلايا.
   ملاحظة: نوصي لوحات المعالجة في أقرب وقت ممكن بعد التثبيت، وبشكل عام نفضل تخزين لوحات المجهزة بالكامل. يمكن إضافة المواد الحافظة مبيد الأحياء مثل ثيميروسال، أزيد الصوديوم، أو البدائل التجارية لمنع نمو micoroganismal. إضافة مثبطات إنزيم الفوسفاتيز يساعد على الحفاظ على الفوسفات-الحواتم، وغيرها من الوسائل للحفاظ على الدول تعديل البروتين قد تكون مفيدة في سياقات فحص ذات الصلة
6. إزالة PBS من لوحة وpermeabilize الخلايا بإضافة 100 ميكرولتر من حل permeabilization. احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة دون أن تهتز. نضح حل permeabilization باستخدام multichannel ماصة. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
7. منع الخلايا من خلال إضافة 100 ميكرولتر حل كتلة لكل بئر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة حل كتلة بواسطة الشفط لوحة، ثم التحقيق مع 50 ميكرولتر من مكافحة P-S780 RB1 الأجسام المضادة المخففة 500 أضعاف في حل كتلة لمدة 2 ساعة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
8. غسل لوحة ثلاث مرات مع 100 ميكرولتر حل لوحة غسل، وترك الحل على طبق من ذهب لمدة 5 دقائق في كل مرة. بحث لوحة بين عشية وضحاها في الظلام في 4 درجة مئوية مع 50 ميكرولتر fluorescently الموسومة الأجسام المضادة الثانوية المخفف 1،000 أضعاف في حل كتلة تستكمل مع 2 ميكرومتر من لونين محددة DNA صبغ Bisbenzimide. غسل لوحة ثلاث مرات كما كان من قبل، ومتجر مختومة، وأقل من 100 ميكرولتر PBS في الظلام في 4 درجات مئوية. صورة لوحة في غضون أسبوعين.

2. التصوير وتقطيع الصورة

1. استخدام المجهر مبائر أو الغزل القرص مضان مع الهدف 20X لاتخاذ منفصلة 16بت والصور TIFF اللون الرمادي في ثلاث قنوات المقابلة لصبغ DNA، GFP وfluorophores المناعية تلطيخ. القبض على العديد من مجموعات صورة غير متداخلة، المشار إليها هنا كما الإطارات، لصورة ما يقرب من 1،000-2،000 خلايا لكل بئر.
2. تسمية ملفات الصور بشكل منتظم بحيث يكون كل اسم الملف هو مزيج فريد من 'اسم التجربة'، 'عنوان جيدا'، 'رقم الإطار "و" معرف القناة، في هذا النظام (الشكل 3). مجموعة البيانات المثال يستخدم "الأزرق" (الكروماتين تلطيخ DNA) أو "الخضراء" (GFP) أو "الأحمر" (وfluorophore الملطخة المناعية)، ومعرفات القناة. وكذلك على المشار عنوان جيدا، ورقم الإطار وقناة المعرف باسم الفوقية الصورة. استخدام الرمز تسطير لتجنب الخلط جيدا والإطار الفوقية.
3. تسمية الملفات مع هذه العناصر الوصفية في الترتيب المحدد. وهذا أمر ضروري لضمان أن الخطوات اللاحقة البرمجيات كورمجموعات مجموعة ctly من الصور للتحليل.
4. تحميل وتثبيت التعريف خلية مجانية، النشطة بيرل الجماعة الطبعة، R بيئة البرمجة الإحصائية وRStudio. قبول كافة الخيارات الافتراضية أثناء التثبيت. يجب على المستخدمين PC تركيب أحدث بيرل تمكين جميع الخيارات المتعلقة PATH وتكوين الجمعيات ملحق الملف ورسم الخرائط النصي حيث يطلب منك ذلك. نشط بيرل هو اختياري لمستخدمي ماك، لكنها لن تحتاج إلا لتشغيل البرنامج النصي بيرل في الخطوة 3.2 من سطر الأوامر المحطة الطرفية بدلا من استخدام رمز النقر.
5. فتح برنامج التعريف الخلية، انقر فوق 'ملف'، 'استيراد خط أنابيب' ثم 'من ملف' وحدد 3_channels_pipeline.cppipe الملف (أرقام S1A وS1B). يحتوي ملف التعليمات اللازمة للبرنامج لتفسير البيانات الوصفية للصورة الملف من الاتفاقية اسم الملف وصفها. التعريف خلية يتعلق الآن الصور، ومقتطفات DNA النووي وشدة الأجسام المضادة من عشرويستخدم جنوب شرقي القناة GFP لحساب نسبة النووية مقابل كثافة السيتوبلازم لكل خلية الكشف عن (أرقام 4 و 5).
6. انقر على الزر "عرض إعدادات إخراج" في الزاوية السفلى اليسرى من النافذة التعريف الخلية. في الجزء العلوي من الشاشة الجديدة ومربعات النص المسمى "المجلد الافتراضي الإدخال" و "مجلد الإخراج الافتراضي". في وقت واحد، انقر فوق-الرموز المجلد إلى حق هذه الصناديق وحدد موقع الملفات صورة للتحليل وجهة للبيانات المستخرجة، على التوالي (الشكل S1C).
7. بدء تحليل الصور عن طريق الضغط على زر "تحليل الصور" في الزاوية اليسرى السفلى من التعريف الخلية. في الجزء السفلي من الشاشة مراقبة الوقت المتبقي لاستخراج البيانات، و"تحليل وقف 'وأزرار" وقفة ". إذا لزم الأمر وقفة تحليل عن طريق اختيار زر 'وقفة' في أي وقت، وهو مفيدعند مشاهدة الصور التي يجري تحليلها (موضح في الخطوة 2.8).
8. اختياريا، فتح النوافذ لأي من الخطوات تحليل الصور عن طريق النقر على العين الرموز في لوحة على اليسار المتطرف من إطار البرنامج (الشكل S1D). مراقبة النافذة "IdentifyPrimaryObjects" وتلك ل"الثانوية" و "كائنات العالي" للتأكد من أن الإعدادات الحالية في التعريف خلية لأداء تقطيع الصورة هي مناسبة (انظر الشكل 1 ومناقشة لتقديم المشورة بشأن تعديل هذه الإعدادات).
9. انقر فوق "موافق" في مربع الرسالة التي تظهر عند تحليل كامل. الذهاب إلى 'افتراضي المجلد الإخراج "الموقع حيث يتم حفظ كافة ملفات البيانات مع النتائج على النحو مفصولة بفواصل ذات القيمة (CSV) الملفات (الشكل S2A).

3. استخراج البيانات

1. العثور على الملف الجديد "Nuclei.csv"، والتي يتم تضمينها بينالإخراج من التعريف الخلية. هذا الملف يحتوي على بيانات الخلية الفردية لالفلورسنت كثافة الأجسام المضادة النووي، وكثافة DNA النووية وGFP CDK2 القيم نسبة مراسل (أرقام 6A و S2A).
   ملاحظة: سوف مختبرات مختلفة يريدون لمعالجة هذا النوع من البيانات لتتناسب مع طبيعة المقايسات الخاصة بهم. اقترح للبيانات الحالية هي النابضة من خلايا من كل شرط المعاملة وفقا للبيانات الأجسام المضادة والقيم مراسل GFP CDK2 باستخدام بيرل النصي المقدمة "2_gate_classifier.pl".
2. نسخ بيرل ملف البرنامج النصي المقدمة "2_gate_classifier.pl" في نفس المجلد مثل ملف بيانات "Nuclei.csv" (الشكل S2A). انقر نقرا مزدوجا فوق الرمز للبرنامج النصي بيرل، وعند المطالبة، اكتب الاسم الكامل للملف بيانات تليها ". CSV 'اسم اسم الملف للملف الذي كانت الخلايا ليتم بوابات وأخيرا القيم بوابة للأجسام المضادةمضان والبيانات مراسل GFP CDK2.
   ملاحظة: كيفية تحديد أساسا إعدادات بوابة وتطبيق هذه لتحليل البيانات وتناقش أدناه في قسم البيانات الممثل والشكل 6 (لتحليل المقدمة على بيانات عن استخدام "0.004" و "1.5"، على التوالي). يجب على المستخدمين ماك تشغيل البرنامج النصي بيرل من سطر الأوامر المحطة الطرفية بكتابة: "بيرل 2_gate_classifier.pl".
3. لاحظ الملف الذي تم إنشاؤه حديثا والذي يجمع بين القيم الفردية فحص خلية الخام من بيانات التعريف الخلية الأصلية مع تسميات الفئات السكانية الفرعية التي تظهر كيف أن كل خلية من كل بئر ينفذ ضد كل من بوابات (الشكل 6C).
4. رسم البيانات لكل حالة تجريبية باستخدام الفردية تسميات حيوانية الخلية عن طريق فتح البرنامج RStudio. انقر فوق "ملف" و "فتح ملف"، ثم حدد "analysis.r" ملف المقدمة. مراقبة الأوامر لرسم الأرقام 6B، 8 في الإطار الأيسر العلوي من RStudio (الشكل S2B). في الإطار الأيسر العلوي، وبين رموز اقتباس مزدوجة على خطوط 5 و 6، اكتب عنوان الكمبيوتر من المجلد الذي يحتوي على البيانات بوابات. تتضمن حرف محرك الأقراص واسم الملف نفسه، على التوالي (على سبيل المثال، "C: / مجلد تحليل / تحليل المخرجات" و "nuclei_gated.csv").
   ملاحظة: إذا تم استخدام RStudio لأول مرة على جهاز كمبيوتر معين، فإن حزمة الرسومات R 'ggplot2 "تحتاج ليتم تثبيتها أولا. وهذه خطوة مرة واحدة فقط لتثبيت جديد من RStudio، وبعد ذلك تصبح هذه خطوة زائدة عن الحاجة. لتثبيت "ggplot2"، انقر فوق علامة التبويب يسمى "الحزم" فوق النافذة في الزاوية اليمنى السفلى من RStudio، انقر فوق الزر 'تثبيت الحزم "الذي يظهر أسفل هذه. سوف تظهر نافذة جديدة. نوع 'ggplot2 "(اقتباسات حذف) في" الحزم الصورةوتيرة في هذا الإطار الجديد وأخيرا انقر على زر "التثبيت" لإغلاق النافذة، وتثبيت وظائف ggplot2 اللازمة والعودة إلى إطار RStudio الرئيسي لمواصلة من الخطوة 3.6.
5. خطوط تسليط الضوء من 1 إلى 17 في الإطار الأيسر العلوي من RStudio، ثم انقر فوق الزر 'تشغيل'. هذا وسوف إدخال البيانات التجريبية، والقيم عتبة وتفاصيل المكان جيدا إلى R (الشكل S2C). سوف R الآن اجراء مؤقتا البيانات ذات الصلة بتهمة التآمر.
6. تسليط الضوء على كتل الفردية من قانون المتبقية تحت خط 17 وخلق المؤامرات المقابلة عن طريق النقر على زر 'تشغيل' كما كان من قبل. مراقبة المؤامرات في الإطار في الزاوية اليمنى السفلى من RStudio وحفظ عدد من الأشكال عن طريق النقر على زر 'تصدير' (الشكل S2D).
7. في حين إغلاق RStudio، انقر فوق "لا إنقاذ" عند المطالبة. وهذا ما يمنع التشويش على استخدام المقبل من RStudio، التي ستعقد البيانات غير ذلكعن الجلسة السابقة.

Representative Results

على سبيل المثال مجموعة من الصور ولدت باستخدام تم إعداد لعكس ترنسفكأيشن سيرنا بروتوكول الفحص وتحليلها باستخدام برنامج التعريف الخلية. البيانات الخام العددي الناتج هو من هذا القبيل أن كل خلية تتمثل بشكل فردي، يمكن عزوها إلى صورتها وكذلك المنشأ وقياس لعدة المعلمات كثافة مضان (الشكل 6A). لكل خلية حددت متوسط ​​كثافة مضان النووي لP-S780 RB1 الأجسام المضادة وكثافة DNA متكاملة لDNA أقنعة النووية محددة صبغ يتم تحديد. يعني قيم كثافة GFP للمناطق نواة وسيتوبلازم كل خلية وتسجل أيضا السماح للحساب النووية مقابل مضان حشوية لمراسل-GFP CDK2. المصب من هذه مضان حسابي قياسات كثافة استخدام مصنوع من هذه البيانات خلية فردية لتحديد بوابات لمدة المقايسات، وتلطيخ الجسم المضاد النووي ومراسل GFP-CDK2. الشرح لاحق من الخلايا على عشرأساس (ه) من نتائج الفحص واستخدام هذه التسميات لتمكين مجموعات سكانية فرعية محددة تتسم بمزيد من قياس الثالث (محتوى DNA النووي) وصفها.

المؤامرات الرسم البياني للبيانات كثافة مضان الخام التي تم جمعها عن كل الاختبار هي وسيلة فعالة لتقييم كيف تتصرف القطعان خلية في ظل ظروف مختلفة. رسوم بيانية في الشكل 6B تظهر توزيعات السكان من البيانات خلية فردية من الآبار ثلاث نسخ لكل حالة ضربة قاضية رني. إلى اليسار هي البيانات لكثافة الأجسام المضادة النووية، وعلى حق والبيانات المناظرة لمراسل GFP CDK2. يكشف البيانات RB1 الأجسام المضادة P-S780 أن الخلايا موجودة على نطاق واسع في اثنين من السكان فيما يتعلق هذا التعديل بعد متعدية وأن السكان الخلية مع فقدان RB1 فسفرته على S780 يمكن تمييزها باعتبارها ذروة الأيسر من شدة النووية التي يتم تخصيبها عندما طرقت CDK6 بنسبة سيرنا. هذا نفس الأيسر الذروةوينظر عندما RB1 في حد ذاته هو الهدف رني، مما يعكس إزالة صريحة من البروتين، وبالتالي P-S780 RB1 تلطيخ. في المقابل، فإن نفس الظروف التجريبية لنفس الخلايا، عندما لاحظ عبر-GFP CDK2 مراسل الفحص، تظهر ديناميكية مختلفة في بيانات الخلية الفردية. لوحظ والتوزيع المستمر، مع ذروة واحدة فقط، ولكن سيرنا الذي يزعج دورة الخلية (siCDK6) ويسبب تراكم في نتائج المرحلة G1 إلى تمديد الكتف الأيمن من أن التوزيع (أي يدل على تعزيز وجود خلايا مبديا زيادة في نسبة GFP النووية / السيتوبلازم، وتآمر على المحور X).

أظهرت أيضا على رسوم بيانية في الشكل 6B هي القيم بوابة (أشرطة عمودية) التي يتم اختيارها على أساس توزيعات كلتا المجموعتين من البيانات الفحص. حكم المستخدمة لP-S780 البيانات RB1 الأجسام المضادة هي لتحديد موقف بوابة باعتبارها نصف الطول: موقف الحد الأقصى-العرض على الكتف الأيسر من أهم(يمين) الذروة عند النظر في بيانات الخلية السيطرة السلبية (عدم استهداف سيرنا). أبرزت بيانات الأحمر هي الخلايا مع انخفاض وتغيب RB1 P-S780، والتي يتم تحديدها مع هذه البوابة. يتم استخدام البوابة مماثلة المتمركزة على الكتف المعاكس للتوزيع قيمة نسبة لمراسل GFP CDK2. مما أدى خلايا حيوانية نسبة عالية، والتي تفتقر أو ميزة انخفاض النشاط CDK2، وتظهر باللون الأخضر. لتوضيح تحليل المضاعفة من فحوصات اثنين من الشكل 6C معارض تنفيذ كل القيم البوابة باستخدام البرنامج النصي 2_gate_classifier.pl بيرل لتحويل البيانات الخام (الشكل 6A) في ملف المشروح أدناه. يتضمن هذا الملف الجديد على البيانات الأصلية إلى جانب عمود جديد من التسميات الطبقة لكل خلية والقيمتين بوابة المستخدمة لتمييزها (في هذه الحالة أبواب 0.004 للبيانات الأجسام المضادة و 1.5 لمراسل GFP-CDK2 استخدمت، على التوالي) .

وبعد تصنيف الخلايا الفردية Fمدمج كل حالة ضربة قاضية على أساس اثنين من المقايسات هو عليه الآن من الممكن استخدام هذه التسميات الطبقة لمساعدة الشرح من المؤامرات من البيانات فحص الشكل مبعثر 7 العروض قطع بيانات الخلية الفردية لP-S780 RB1 وGFP- المقايسات CDK2 من البيانات حذو لجميع الظروف رني الثلاثة. أرقام التأشير الأرباع على scatterplots تظهر النسب المئوية النسبية لكل حيوانية بوابات على كامل عن هذا السياق ضربة قاضية ولدت في R باستخدام تسميات الطبقة المذكورة أعلاه. وتكشف هذه المؤامرات التي، بالمقارنة مع خلايا transfected مع عدم استهداف سيرنا (الشكل 7B)، وخلايا transfected مع siCDK6 تكشف عن توزيع البيانات صافي تحول كل من أسفل على المحور Y (تشير إلى عدم وجود RB1 الفسفرة في سيرين 780) وإلى اليمين على المحور X (تشير إلى النشاط CDK2 منخفضة، والشكل 7C). ومن المتوقع لضربة قاضية من هذا الهدف كل من هذه التحولات. وعلى النقيض من ذلك، فإن البيانات من السيرالخلايا B1 transfected (الشكل 7A) تظهر فقدان تلوين الأجسام المضادة وذلك تمشيا مع فقدان حاتمة، ولكن تأثير يذكر في توزيع البيانات لمراسل CDK2 مقارنة مع الضوابط transfected مع عدم استهداف سيرنا، مما يشير إلى أي تأثير كبير على GFP ينشأ مراسل -CDK2 من RB1 ضربة قاضية.

لمزيد من استكشاف واستخدام بيانات الخلية الفردية، تصنيف حيوانية وفحص مضاعفة الشكل 8 يدل على مؤامرة مبعثر للبيانات siCDK6 من ملامح الرسم البياني الشكل 7C تقرن جنبا إلى جنب مع لشدة DNA متكاملة. أزواج من رسوم بيانية تتعلق نصفين معارضة من مجموع السكان، مقسمة على أساس إما كثافة الأجسام المضادة (حق مخطط التشتت) أو GFP-CDK2 مراسل القيم نسبة (فوق مخطط التشتت). الكمي لشدة DNA النووية لهذه التجمعات السكانية يظهر اثنين من قمم المميزة ل2N و4N المحتوى DNA كما قمم اليسار واليمين، على التوالي. طntentions البوابات هو مبين في أرقام 6 و 7 و 8 هي من هذا القبيل أن الخلايا حددت منخفضة تصل لP-S780 RB1 (المسمى: P-S780-) أو مع قيمة نسبة عالية من مراسل GFP-CDK2 (المسمى: G1) سوف تكون في المرحلة G1 من دورة الخلية. وبالفعل، فإن رسوم بيانية الحمض النووي لالقطعان التي تم تحديدها مع أي من هذه المقايسات تحتوي في الغالب خلايا مع محتوى 2N DNA. الحمض النووي من السكان بوابات معاكس (المسمى: P-S780 + أو غير G1) يحتوي على خلايا مع التوزيعات تتراوح بين 2N إلى 4N، وذلك تمشيا مع مثل هذه الخلايا تتبنى مجموعة من دورة الخلية المواقف مرحلة ما بعد G1.

على الرغم من أن التركيز هنا كان جيل وتحليل البيانات خلية فردية من الصور الملون fluorescently، فمن المفيد أيضا أن يكون قادرا على اتخاذ هذه البيانات وتلخيص كل مقايسة على أساس جيدا من قبل جيدا لمراقبة التباين بين مكررات والأداء جميع الآبار للمقايسة معينة عبر لوحة كاملة من البيانات. A) البيانات RB1 P-S780 وباء) البيانات مراسل GFP CDK2. ويتم إنتاج هذه القيم تآمر في ألف وباء من قبل اثنين من مخطوطات بيرل الإضافية المقدمة مع هذه المخطوطة. "antibody_fluorescence_summary.pl" و "G1assay_summary.pl"، على التوالي. هذه البرامج النصية استخدام البيانات الخام التي تم إنشاؤها من قبل خلية التعريف (Nuclei.csv) وبيانات التقرير في جانب ط) مجموع الخلايا قياس لكل بئر، والثاني) عدد الخلايا داخل البوابة، الثالث) خلايا من المائة في خلال البوابة والرابع) في علم الحساب يعني من قياس، والبيانات الخام لذلك جيدا. يتم تضمين هذا كخيار مناسب لتبحث عبر مجموعات كبيرة من البيانات الفحص، قبل التركيز على البيانات المعالجة الفردية باستخدام تقييم المضاعفة من بيانات الخلية الفردية كما هو موضح في 8. المخططات المعروضة هنا مؤامرة "ج) خلايا من المائة في خلال بوابة" لكلا المقايسات، والتي تتناسب مع التوزيعات بيانات غير العادية ينظر للبيانات P-S780 RB1 وGFP-CDK2 في رسوم بيانية في الشكل 6B. أيضا حساب هذه البرامج النصية "الرابع) في المتوسط ​​الحسابي للقياس، والبيانات الخام لذلك جيدا"، والتي من شأنها أن تناسب تحليل البيانات للاستجابات السكان متجانسة وتوزيع البيانات العادي قبل وبعد اضطراب التجريبية.

الشكل (1): نظرة عامة على خطوات في سير العمل لتحليل البيانات الكمية صورة المجهر fluorescently المسمى ويمثل العمل هنا كما أربع خطوات (A) أولا لا بد من إعداد تجريبيا خلايا للتصوير الفلورسنت. المثال الموصوفة هنا هو أن لالشاشة التي تزرع الخلايا السرطانية البشرية ملتصقة المعالجة سيرنا لمدة 48 ساعة، ثابتة وملطخة على 96-جيدا لوحة زراعة الأنسجة. شروط رني مختلفة موجودة في ثلاث نسخ في الآبار منفصلة داخل اللوحة. هي ملطخة الخلايا مع صبغة DNA، وهي الأجسام المضادة المحددة لRB1 فسفرته على CDK4 و 6 انتقائية الموقع المستهدف سيرين-780 (P-S780 RB1)، وأنها أيضا عن ثابت عن GFP-CDK2-مراسل والإبلاغ G1 دورة الخلية الخروج. هذه جماعي تحقيقات الفلورسنت تشكل تحليلين تقييم منفصل ضمن سير العمل. (B) يتم إنشاء الصور المجهر موازية لكل التحقيق الفلورسنت (قناة) واسمه مثل لتشمل التفاصيل التي برنامج تحليل الصور يمكن تنظيم البيانات. (C) و يتم تحميل ملفات الصور في البرنامج التعريف خلية، والذي يعرف حسابيا الخلايا الفردية وأزواج المرتبطة بها من النوى والسيتوبلازم قبل الرضوخ قياسات كثافة للتحقيقات الفلورسنت ثلاثة كشفإد في كل منهما. (D) وأخيرا، يتم استخدام برنامج نصي بيرل لتنظيم البيانات الكمية الخام المنتجة. تنطبق هذه الخطوة بوابات للبيانات كثافة مضان لكل خلية، binning فعال الخلايا في القطعان التي يمكن رسم، تعقبها وللاستجواب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: البيانات التجريبية التي يمكن الحصول عليها عن طريق تحليل الصور و، سيرنا المعاملة، وخلايا fluorescently المسمى الثابتة من البيانات المثال الذي تم تصوير وقياسات كثافة المقابلة تؤخذ لكل خلية. وتظهر بيانات الصورة التمثيلية لكل معلمة سجلت خلال تحليل الصور كثافة (A) DNA النووي: ويستخدم كثافة تلطيخ صبغ DNA النووي ل تحقق قدرا من الحمض النووي في النواة (B) كثافة النووية من الفوسفات-RB1: محددة لP-S780 RB1 باستخدام الابتدائي (أسود) الأجسام المضادة والموسومة fluorescently الضد الثانوية (أحمر) تمكين قياس شدة RB1 الفسفرة في تلطيخ المناعي . S780 في النواة (C) GFP-CDK2 مراسل: الخلايا المستخدمة التعبير عن ثابت بروتين مراسل GFP الموسومة أن translocates بين النواة والسيتوبلازم في نمط مجموعة مع دورة الخلية. قياس المزدوج للالنووية وحشوية كثافة GFP يقترن لكل خلية يسمح حساب نسبة لكل خلية التي يمكن استخدامها للتمييز المرحلة G1 من بقية دورة الخلية. وسيتم استخدام ثلاثة أهداف سيرنا لتوضيح التحليل؛ وعدم استهداف سلبي تحكم سيرنا. CDK6 سيرنا كعنصر تحكم إيجابية في الاقلاق الفسفرة RB1 والتقدم دورة الخلية؛ RB1 سيرنا لإنشاء الأجسام المضادة خصوصية.ك "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: تنظيم ملفات الصور قبل تحليل الصور تسمية الصور الملتقطة من لوحة زراعة الأنسجة بشكل منتظم من أجل السماح للبرنامج تحليل الصور لربط بيانات الصورة مرة أخرى إلى سياق تجريبي الأصلي. يتم وضع هذه المعلومات في اسم الملف لكل صورة. (A) وكما كل بئر على لوحة التجربة قد تتوافق مع أهداف رني مختلفة أو العلاجات، ويشكل جزءا عنوان جيدا من اسم الملف. (ب) عدد الإطار هو جزء من اسم الملف . كما كل بئر يتم تصويرها لجمع متعددة، غير متداخلة الإطارات (C) يتم تصوير تحقيقات الفلورسنت من كل إطار على حدة. وبالتالي تحتاج أيضا أسماء لتعكس القناة التي تتعلق كل صورة ل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: استخدام التعريف خلية لقياس DNA النووي وتلوين الأجسام المضادة مع الإعدادات في ملف خط أنابيب المقدمة (3_channels_pipeline.cppipe)، والتعريف خلية التدابير برامج تحليل صورة مضان قيم الكثافة لDNA النووي والأجسام المضادة ملزم المتعلقة الخلايا الفردية . ويتم تحديد (A) نوى في 'الزرقاء' صورة قناة DNA الملون. (B) < / قوي> وتعقد مواقف نوى DNA الملون مؤقتا في 'قناع نوى ". ثم يتم مضافين قناع النواة على (C) وتسجل الصور زرقاء وحمراء قناة (بيانات الحمض النووي والأجسام المضادة مضان، على التوالي)، والقيم مضان من شرائح الصورة التي تتداخل مع قناع ضد كل خلية التي تم تحديدها. تحديد الناجح منفصلة، ​​نوى المجاورة يمكن تقييم بصريا في مظهر القناع النواة. للتوضيح، كما هو موضح حلقت في هذه الصورة قناع، هي أمثلة حيث الإعدادات المختارة لخوارزمية حددت سوء نوى المجاورة كنواة واحدة. ضبط إعدادات خوارزمية للحد المقدمة في قسم مناقشة هذه الأحداث. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

/ftp_upload/51882/51882fig5highres.jpg "/>
الشكل 5: استخدام التعريف خلية لقياس شدة GFP النووية وحشوية مراسل CDK2 الموسومة GFP translocates بين النواة والسيتوبلازم بالنسبة لموقف دورة الخلية من الخلايا. في الوقت نفسه إلى أن التعريف خلية بحساب DNA والأضداد شدة النووية في الخلية (الشكل 4)، فإنه يحسب أيضا النووي إلى نسبة السيتوبلازم من شدة GFP لكل خلية. (A) يتم استخدام البيانات صبغ DNA لكل صورة لتوليد قناع نوى. التعريف (B) الخلية يستخدم قناع نوى بالتزامن مع الصورة GFP من مراسل GFP CDK2 البذور موقف كل خلية ثم توسع إلى محيط كل خلية لتقدير البصمة كاملة من كل خلية. ويصبح هذا الجديد، "قناع خلية". (C) وطرح قناع نواة من خلية قناع لتسفر عن سلسلة مثل دونات من السيتوبلازم الخطوط العريضة، والتي أصبحتيتم استخدام "قناع السيتوبلازم. (D) نوى قناع وقناع من السيتوبلازم التعريف خلية لقياس أزواج من القيم GFP النووية وحشوية. ثم يتم استخدام هذه القيم التي تقرن التعريف خلية لحساب النسب الذي إبلاغ لموقف كل خلية في دورة الخلية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: استخراج البيانات - معالجة البيانات خلية فردية الخام من خلال فرض بوابات على القيم فحص الاتجاهات البيولوجية من بيانات الخلية الفردية لتلوين الأجسام المضادة والمقايسات مراسل GFP CDK2 يتم استخراج باستخدام بيانات بوابات. رسوم بيانية للبيانات الخام تمكن تحديد القيم بوابة مناسبة. ثم يتم فرض هذه مع نصي بيرل. (A) والمنتج النهائي لتحليل ملفات الصور مع الإعدادات المنصوص عليها التعريف خلية هم مفصولة بفواصل ذات القيمة (CSV) الملفات. هذه الملفات ج ontain بيانات الخلية الفردية المتعلقة بكل من قطاعات الفرعية الخلوية المختلفة. الملف 'Nuclei.csv "يحتوي على كافة قياسات محددة تتعلق باستخدام القناع النواة. وتشمل هذه القياسات كثافة الأجسام المضادة النووية، وكثافة DNA النووية ونسبة GFP (نواة / السيتوبلازم). (ب) المدرج الإحصائي من كثافة الأجسام المضادة النووية (يسار) ونسب مراسل GFP-CDK2 (يمين) تآمر من بيانات الخلية الفردية لكل حالة ضربة قاضية سيرنا . القضبان على رسوم بيانية عرض تظهر مواقف بوابة المطلوب لهذه المقايسات. البيانات الملونة على رسوم بيانية تدل على مجموعات سكانية فرعية بوابات. (C) يتم تطبيق البوابات لمدة المقايسات موضح في B إلى البيانات الخام باستخدام البرنامج النصي بيرل "2_gate_classifier.pl". السيناريويخلق نسخة معدلة من الأصلي الناتج التعريف خلية (Nuclei.csv) ملف لمساعدة التآمر لاحق. وتسجل القيم بوابة اثنين في ملف جديد (سلط عليها الضوء في اللون هنا) ويتم إضافة العمود 'تسمية' الجديدة. التسميات بن كل خلية في واحدة من أربع مجموعات فرعية الممكنة استنادا الى اثنين من القيم فحص بوابات لكل خلية. وتستخدم هذه التسميات في مؤامرات اللاحقة التي تتميز حسابات مساهمات كل حيوانية وكذلك المراجع العرضي للمعلمات إضافية ولدت في التعريف الخلية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7: المؤامرات مبعثر لكل حالة سيرنا تصور البيانات الخام للخلايا الفردية والمواقف بوابة مبعثر قطع indiviبيانات الخلية المزدوجة من جميع الصور لظروف سيرنا أشارت: (A) siRB1؛ (ب) مراقبة استهداف سينون السلبية؛ (C) siCDK6. تآمر ضد Y-محاور هي قيم مضان النووي من مكافحة-P-S780 RB1 تلطيخ. تآمر ضد محاور X هي القيم نسبة المقابلة المحسوبة من مراسل GFP CDK2. أشرطة حمراء وخضراء تشير الى مواقع البوابات لبوابة RB1 P-S780 وبوابات مراسل GFP CDK2، على التوالي. بوابات اثنين من تقسيم الخلايا إلى أربع مجموعات سكانية فرعية والأرقام على مدى الأرباع الناتجة عدد في المئة من الخلايا من كل من هذه. شروح حول محاور لوتشير إلى أربعة عناصر تسمية الممكنة تطبيقها على كل خلية من قبل بيرل النصي 2_gate_classifier.pl. وتظهر هذه التسميات فيما يتعلق بوابة فحص كل منها وتستخدم في R-النصي (analysis.r) لتوليد المؤامرات في أرقام 6 و 7 و الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 8: خلية مجموعات سكانية فرعية محددة من قبل اثنين من المقايسات G1 عبور تظهر 2N 4N والحمض النووي ملامح تمشيا مع نتائج الفحص يتم تكرار مؤامرة مبعثر من البيانات للخلايا siCDK6 من الشكل 7C. المحيطة مؤامرة مبعثر هي رسوم بيانية للكثافة متكاملة DNA النووي المتعلقة مجموعات فرعية من السكان. تلك فوق مخطط التشتت تتصل-GFP CDK2 مراسل الفحص. تلك لحق مخطط التشتت تتصل قياسات الأجسام المضادة النووي الفوسفات-RB1 وحدها. وتمتد خطوط بوابة الملونة لإظهار علاقتها رسوم بيانية. وتظهر أيضا علامات البوابة التي تم اختيار بيانات الخلية لهذه المؤامرات إضافية. الخلايا مع فقدان RB1 فسفرته على سيرين 780 (P-S780-) أو تلك التي لديها عالية GFP-CDK2 مراسل النووية إلى نسبة حشوية (تشير إلى النشاط CDK2 منخفض) تظهر ملامح DNA 2N-تشبه في الغالب، في حين أن نظرائهم المعاكس لكل منهما الفحص تظهر توزيع 2N و4N، سمة من مختلط، بعد G1-السكان المرحلة من الخلايا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 9: المؤامرات ملخص القيم فحص بوابات لكل سيرنا حالة المؤامرات ملخص البيانات من بوابات (A) P-S780 البيانات RB1 والبيانات (B) GFP-CDK2 من الآبار ثلاث نسخ لكل حالة ضربة قاضية سيرنا. تم حساب القيم من الناتج الخام التعريف خلية (Nuclei.csv) باستخداممخطوطات برل، "antibody_fluorescence_summary.pl" (A) أو "G1assay_summary.pl" (B). قيم تآمر وسيلة للخلايا من المائة في خلال البوابة تطبيقها على كل فحص. الحانات تشير الأخطاء المعيارية تحسب من الآبار ثلاث نسخ. وترد المفردة، homoscedastic القيم T-P اختبار لكل حالة ضربة قاضية مقابل عدم استهداف سيرنا فوق البيانات المرسومة حيث P <0.001 (**) وP <0.05 (*). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم S1. إنشاء برنامج التعريف الخليوي لتحليل الصور. (A) لقطة من التعريف خلية قبل أن يتم إدخال أي إعدادات تحليل الصور. (B) لقطة من التعريف خلية بعد تفاصيل الخوارزمية الواردة في "3_channels_pipeline.cppipe" تم تحميلها. ارتفاع علامة التبويب مضاءة في الزاوية اليسرى العليا يشير إلى أن هذه الشاشة تظهر المعلمات للمرحلة 'LoadImages "للتحليل. النقر على أجزاء أخرى من القائمة أدناه هذه تكشف تفاصيل عن الخطوات اللاحقة في التحليل. (C) لقطة من التعريف الخليوي مع تفاصيل عن مجلد المدخلات والمخرجات دخلت المجلد. (D) لقطة من التعريف خلية بعد 'تحليل وقد تم النقر على زر الصور "لبدء التحليل. فرضه ثلاثة نوافذ جديدة توضح أقنعة تنتج حسابيا المولدة عن طريق البرنامج من الصور قيد التحليل. يتم الوصول إلى هذه النوافذ عن طريق النقر على 'العين' الرموز إلى الوضع المفتوح بالقرب من الخطوات ذات الصلة في التحليل، في الزاوية العليا اليسرى من النافذة التعريف خلية الرئيسي. هذه الآراء تساعد المستخدم للتحقق ما إذا كانت إعدادات توليد أقنعة حلويات اللون تتفق مع المرفقة، الأصلي، والبيانات اللون الرمادي.

والأنف والحنجرة "> الشكل S2. استخدام بيرل وRStudio لبوابة بيانات الخلية الفردية ورسم القطعان الخلايا الناتجة عن ذلك. (A) وتظهر اللوحة اليمنى المجلد المختار لتلقي ملفات الإخراج. CSV (الرموز الخضراء) من التحليل التعريف الخلية. يتم نسخ البرامج النصية Perl المتوفرة مع مخطوطة (الرموز الزرقاء) في هذا المجلد. تسلط الضوء هو السيناريو بيرل "2_gate_classifier.pl"، التي كانت نقرا مزدوجا النقر بالماوس لإنتاج مربع الحوار في اللوحة اليمنى. أظهرت هي المطالبات والمقابلة كتبته الإجابات اللازمة لبوابة بيانات الخلية الفردية من الملف 'Nuclei.csv ". (B) لقطة من RStudio مباشرة بعد تحميل البرنامج النصي' analysis.R" وأبرز هي الأوامر لتحميل البيانات بوابات من الألف إلى يقوم البرنامج قبل بالتآمر (تفاصيل المذكرة في خطوط 5 و 6 تحتاج إلى تعديلها وفقا لحيث يقع البيانات بوابات على حسابص المستخدمة في التحليل). (C) لقطة من RStudio مرة واحدة تم تحميل البيانات. (D) لقطة من RStudio تبين أبرزت كتلة من التعليمات البرمجية اللازمة لإنتاج هذه المؤامرة هو مبين في الإطار الأيمن السفلي. يتم فصل رموز لكل مؤامرة من قبل أسطر فارغة وتجميعها حسب نوع المؤامرة.

الهدف سيرنا	عناوين وحة جيدا
عدم استهداف (NT)	E5، F5، G5
الشبكية (RB)	E7، F7، G7
السيكلين كيناز تعتمد 6 (CDK6)	B2، C2، D2

الجدول 1: حسنا عناوين وما يقابلها من ظروف سيرنا المستخدمة في البيانات المثال تعيين.

Discussion

سير العمل صفه يشكل اجراءات لperturbance multiwell من الخلايا باستخدام سيرنا، كشف علامة لاحق واستخدامها في نهاية المطاف من سلسلة من الخطوات التي تدعمها البرمجيات لتسهيل استخراج البيانات الكمية من الناتج الصور فلوري المجهر. ويركز المنهج على تقديم قيم الكثافة النووية وحشوية عن الخلايا الفردية، التي لديها التطبيق العملي واسع في العديد من التطبيقات المستندة إلى الخلية. تم إنشاء البيانات المثال المستخدمة هنا في الإعداد الشاشة سيرنا التي يتم اختبارها تحليلين الفلورية للمرحلة G1 دورة الخلية العبور والمترابطة إلى مقياس فيزيائي حيوي أكثر مباشرة من المحتويات DNA النووي.

استخدام وصمة عار DNA الفلورسنت لصورة DNA النووي هو خطوة لا غنى عنها في عملية تقطيع الصورة لأنها تتيح تحديد الخلايا الفردية وما نتج عن ذلك "قناع نوى" بمثابة نقطة انطلاق لتحديد المقابلة cytoplasmiمناطق ج. مراسل CDK2 الموسومة GFP، وهو ما يعبر عنه مستقر في الخلايا، ويعطي متغير بعد أعلى باستمرار من إشارة الخلفية في السيتوبلازم التي يمكن أن توضح هذه المقصورة. يجب أن يكون خط أنابيب التحليل نفسه ينطبق على تحليل الأحداث البروتين إزفاء باستخدام آخرين للصحفيين المرتبطة مضان مناسبة واستجابتها لperturbance. أيضا، فإن استبدال مراسل GFP CDK2 مع السيتوبلازم محددة الأصباغ الفلورية تسمح باستخدام بديل من هذه الخوارزمية لقياس أبعاد السيتوبلازم والأحجام النسبية للخلايا في الصور.

آخر الاعتبار تصميم في استراتيجية تجزئة الصورة الموضحة هنا هو استخدام التعريف خلية لتقديم قيم الكثافة متكاملة لتقدير DNA. التكامل من شدة قيم DNA النووي البيانات تلطيخ تسمح التغيرات المحتملة في حجم النواة، ويمثل مباراة وثيقة لمحات الكمي ينظرليوديد propidium الملون FACS البيانات. ومع ذلك، وكثافة متكاملة قد لا توفر وسيلة مناسبة لتقييم وظيفة البروتين حيث متوسط ​​تركيز، ومن أمثلته كثافة متوسط ​​للمستضد مضان، هو أكثر أهمية من الناحية البيولوجية المبلغ الإجمالي متكاملة من البروتين (ومضان المرتبطة بها) داخل حجرة الخلية. لذلك يعني استخدمت قيم الكثافة لP-S780 RB1 والبيانات GFP. الخيار لتغيير بين وضعي (يعني أو متكاملة) تقييم البيانات يتم العثور على لوحة "ExportToSpreadsheet" من البرنامج التعريف الخلية.

يتم تحسين إعدادات تحليل في ملف 3_channels_pipeline.cppipe للصور في مجموعة البيانات المثال. وتحليل الصور مجموعات جديدة مع هذا البروتوكول يتطلب أن أسماء الملفات تعتمد صفت اصطلاح التسمية فوق (الشكل 3). أيضا، تقدر حساسية لتتناسب مع سطوع تلطيخ DNA النووي وعتبات الخلفيةقد تحتاج شدة في مجموعات الصور الجديدة التي سيتم تعديلها ضمن إعدادات التعريف الخلية. نظرا للدور الرئيسي يحمل تلطيخ DNA لبناء مختلف الأقنعة تقطيع الصورة، وتطبيق الإعدادات حساسية الصحيحة لهذه القناة هو المفتاح لتحليل البيانات الناجح لصورة جديدة مع برنامج التعريف الخلية. ملف الإعدادات المقدمة التعريف خلية (3_channels_pipeline.cppipe) يحتوي الملاحظات على المعلمات الأكثر فائدة في كثير من الأحيان للتكيف مع تحليل لبيانات جديدة. هذه الملاحظات هي في مربع النص في أعلى الشاشة في خلية التعريف النافذة الرئيسية وتشمل توجيهات بشأن تغيير إعدادات حساسية وضبط عدد من القنوات ليتم تحليلها. كما اتهم في بروتوكول القسم 2.8، لاختبار إعدادات البيانات صورة جديدة قد يكون من الضروري لمراقبة تجزئة الصورة خلال تحليل الصور عن طريق النقر مفتوحة الرموز 'العين' لكل من 'تحديد ... كائنات "خطوات بروتوكول (الشكل S1D

الناتج الخام من بيانات الخلية الفردية من التعريف خلية يمكن تحليلها بطرق لتتناسب مع احتياجات دراسات أخرى متفاوتة. المبين هنا هو استخدام برنامج نصي بيرل لتطبيق البوابات لاثنين من المعلمات قياس لكل خلية من أجل مساعدة استخراج الاتجاهات البيولوجية من أحد البياناتتصريح د المراجع المتصالبة من القطعان التي تم تحديدها مع قياسات إضافية. على الرغم من أنه من الممكن بالتساوي لتشمل عناصر النابضة في إطار التعريف خلية، والطريق البديل المستخدم هنا يوفر قدرا أكبر من المرونة والسرعة، وتحديدا إذا تحتاج مجموعات كبيرة من البيانات ليتم تقييمها. أبطأ مرحلة في مراحل ما بعد الاستحواذ صورة البروتوكول الحالي هي قيد التشغيل للبرنامج التعريف الخلية. التعريف خلية هنا يتم تشغيل دون فرض البوابات لإنتاج الخام مجموعة البيانات بوابات الامم المتحدة والتي يمكن أعادوا تحليل مع بيرل النصي لاحق بسرعة أكبر، وإذا لزم الأمر، تكرارا مع القيم بوابة مختلفة. ليست كل الدراسات سوف نعرف مقدما القيم بوابة مناسبة لأن هذا قد تختلف مع الكواشف على أي مجموعة معينة من البيانات، وربما مع مرور الوقت. ولذا، ينصح لتوليد رسوم بيانية تصور توزيع البيانات الخام التي تم الحصول عليها من التعريف الخليوي لالضوابط الإيجابية وخلايا وهمية-إرتباك من أجل تحديد مناسبة بوابة VALUوفاق للمعلمات في المصالح.

يتم كتابة البرامج النصية Perl لقبول هيكل عمود تعريف صارم من البيانات من التعريف خلية وقد تتوقف عن العمل إذا كان المستخدم بتعديل عدد من إخراج المعلمات من قبل خلية التعريف باستخدام إعدادات "ExportToSpreadsheet". للمساعدة في تنفيذ تعديل الإعدادات يتم تضمين الملاحظات داخل ملفات البرامج النصية بيرل. لرؤية هذه عرض النصي في محرر النص، ويفضل تعيين محرر نصوص مبرمج لرمز اللون عناصر بيرل (على سبيل المثال، http://www.activestate.com/komodo-edit). هذه الملاحظات تشير إلى حيث لضبط النصي على التكيف مع التغيرات في تنسيق البيانات. وعلى غرار البرامج النصية بيرل، ملف R-كود المقدمة (analysis.r)، التي تحتوي على تعليمات بتهمة التآمر الأرقام من بيانات تحليل الصور، ويمكن أن تقرأ في محرر نص أو برنامج RStudio لمعرفة الملاحظات الإضافية عن استخدام والتكيف. ويمكن استكمال هذه الملاحظات مع التفاصيل حول التعابير العادية وبيرل <سوب> 12 وحزمة ggplot2 ¹³ لR، وكلاهما تشكل الأساس لكيفية قراءة البيانات، المشروح وتآمر على التوالي.

دراسات جديدة باستخدام المجهر مضان فضلا عن البيانات الأولية المودعة لدى منشورات مفتوحة المصدر قابلة للطرق التحليل مثل تلك التي وصفها هنا. طبيعة البيانات العالية المحتوى يفسح المجال لتحليل العودية مع التركيز تحليلية مختلفة تبعا لاهتماماته البحثية من أي مراقب معين. على الرغم من أن الأسئلة التي يمكن أن يطلب من بيانات محدودة بسبب تحقيقات المستخدمة في الأصل، بيانات الصورة كثيرا ما يمكن أعادوا تحليل هادف خارج نطاق الدراسات التي ولدت فيها.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AllStars negative control siRNA	Qiagen	1027280	Negative control siRNA.
CDK6 siRNA	Dharmacon/ Custom synthesis	NA	Antisense sequence: 5' CUCUAGGCCAGUCUUCUUCUU
RB1 siRNA	Dharmacon/ Custom synthesis	NA	Antisense sequence: 5' GGUUCAACUACGCGUGUAATT
5x siRNA buffer	Thermo Scientific	B-002000-UB-100	To be diluted with nuclease-free, non-DEPC treated water.
Nulcease-free water (non-DEPC)	Applied Biosystems	AM9937	For dilution of siRNA buffer.
Hiperfect	Qiagen	301705	Transfection lipid.
DMEM	Life Technologies	41966052	Pyruvate and high-glucose supplemented tissue culture media.
96 well tissue culture plate	Falcon	3072	Plain, 96 well tissue culture plate for the parallel, compartmentalized mixing of transfection complexes.
Packard Viewplate	Perkin Elmer LAS	6005182	96 well TC plate with optical base on which cells are transfected, grown, fixed and eventually imaged. Supplied with opaque, adhesive plate seals, which are used during storage of used plates.
Breathable membrane	Alpha Labs	LW2783	Sterile, gas-permeable, adhesive membrane.
Neutral buffered formalin, 10%	Sigma-Aldrich	HT5012-1CS	10% Formalin (4% formaldehyde) fixative used neat in protocol.
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100PC	Non-ionic detergent

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris	Sigma-Aldrich	T1503	Trizma base (tris(hydroxymethyl)aminomethane)
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287	For plate wash solution.
Anti-P-S780 RB1 antibody	Abcam	ab32513	Rabbit monoclonal
AlexaFluor647 Anti-rabbit	Invitrogen	A21245	Highly cross-adsorbed, fluorescently labelled secondary antibody.
Hoechst 33342 (Bisbenzimide)	Sigma-Aldrich	B2261	Fluorescent, chromatin-intercalating, DNA dye.
Permeabilization solution	NA	NA	0.1% Triton X-100 in 50 mM Tris-buffered saline, pH 8.0.
Plate wash solution	NA	NA	Tris-buffered saline containing 0.1% Tween-20.
Block solution	NA	NA	5% powdered milk in Tris-buffered saline and 0.1% Tween-20. For blocking plate prior to immuno-staining and dilution of antibodies.
Cell Profiler 2.1	Broad Institute		http://www.cellprofiler.org/download.shtml
Active Perl Community Edition	ActiveState		http://www.activestate.com/activeperl/downloads
R programming environment	The R Foundation		http://www.r-project.org
Rstudio	Rstudio		http://www.rstudio.com/