Introduction
Точные и быстрые методы белок датчиков очень важно в медицинской диагностике и протеомики. Классические белковые обнаружения массивы, такие как биочипов, основаны на "заблокировать-и-ключа" принципом признания и требуют специфические рецепторы, такие как аптамеров, антитела, или имитаторов.
В последние годы, дифференциал зондирования вдохновлен человеческого обоняния и gustation стала альтернативной 1. Это электронный нос / язык (EN / ET) подход основан на дифференциальных связывания анализируемых на массив перекрестно реагирующих рецепторов (CRRs), которые не должны быть очень специфичными или селективными для молекул-мишеней, таким образом, позволяют преодолеть кропотливая Процесс разработки высокоселективных рецепторы. Это в сочетании ответ всех рецепторов, что создает отдельный шаблон для каждого образца, как отпечатки пальцев, обеспечивающее ее идентификацию.
Два ключевых проблем для развития электоприводтроник нос / язык для эффективного зондирования белка являются производство чувствительных элементов, которые имеют способность различать среди структурно подобных аналитов и соответствующей системы трансдукции для связывания события. До сих пор, исследования показали, различные подходы к развитию массива 2. Например, в одном исследовании на основе массивов идентификация белков была разработана с использованием CRRs, полученных из производных тетра-carboxyphenylporphyrin путем сочетания карбоксильных групп в различных аминокислот или дипептидов, чтобы обеспечить дифференциальные рецепторы, обладающие гидрофобную сердцевину для сродством к белкам и различных заряженных периферии для придания дифференциального связывания. Используя эту систему, различные белки и белковые смеси были определены путем измерения тушение флуоресценции рецепторов при взаимодействии с аналитов 3,4. В другом исследовании, библиотека 29 CRRs содержащих трипептид и остатки борной кислоты синтезируются в комбинаторной пути на hexasubstiщённые бензол эшафот был разработан для измерения белки с индикатором захвата колориметрического обнаружения 5,6. При такой конструкции, каждая из рецепторов показали, дифференциальный связывающую способность с белками на основе различий в пептидных оружия, и борной кислоты при содействии в дифференциации белков из гликопротеинов. Совсем недавно, массив состоит из различных катионных функционализованный наночастиц золота, сопряженных с анионным флуоресцентного полимерной поли (п-phenyleneethynylene) (СИЗ) был создан для обнаружения и идентификации белков 7. Конкурентного связывания между белковыми аналитов и гасят СИЗ / золотые наночастицы комплексов регенерированных флуоресценции, создавая различные узоры распознавания для белков. В этом исследовании, функционализованные наночастицы-белковые взаимодействия были настроены путем изменения физико-химических свойств конечных наночастиц групп. Кроме того, было показано, что такой подход является эффективным для анализа белков в сложной и богатой белком среде, такойкак сыворотке крови человека в физиологически значимых концентрациях, таким образом показывая потенциал ET в профилирования реальные образцы для диагностики болезненных состояний 8.
Хотя очень перспективным, эти системы имеют некоторые ограничения, присущие. Они требуют разработки и синтеза от 5 до 29 CRRs с довольно сложными структурами. Кроме того, в отличие от обонятельной системы, который сбрасывается после каждого измерения, белок, чувствительный требует подготовки массив на выборку. Наконец, мониторинг в реальном времени обязательные мероприятия чрезвычайно трудно.
В этом контексте, комбинаторный подход был предложен с помощью небольшого количества простых и легко доступных молекул с различными физико-химическими свойствами (гидрофильными, гидрофобными, положительно заряженные, отрицательно заряженные, нейтральный и т.д..) В качестве строительных блоков (BBS) 9. Смешивая ББ в различной и контролируемых пропорции и позволяя смесей самостоятельно собираться на золотой поверхностипризма, был создан массив комбинаторных поверхностей с участием соответствующих настроек связывающий белок. Примечательно, что самоорганизующиеся монослои на данной системы позволяют легко настройку диапазона свойств поверхности в сильно расходящихся моды, что позволяет различные комбинаторные кросс-реактивные рецепторы (CoCRRs), чтобы быть быстро и эффективно получать. Белок зондирование проводилось с помощью оптической системы обнаружения, поверхностного плазмонного резонанса (SPRI). Вкратце, широкая балка монохромные поляризованный свет от светодиода освещает всю CoCRR области массива на поверхности призмы. CCD видео камера высокого разрешения в режиме реального времени разница изображения во всех пятен массива CoCRR. Она захватывает все локальные изменения на поверхности массива CoCRR, содержащие подробную информацию о связывающих событий и кинетических процессов 10. Между тем, с помощью ПО для обработки изображений, SPR изображения, соответствующие пятен автоматически преобразуются в вариациях отражения Versuпора, создавая серию кинетических кривых связывания называемых сенсограммы. Таким образом, SPRI позволяет без наклеек, синхронный, параллельно, и в режиме реального времени наблюдать обязательных мероприятий. Кроме того, полученный массив CoCRR является регенерировать и повторно для анализа белков.
Этот протокол описывает конструкцию электронного языка, используя только два небольших молекул в качестве строительных блоков и иллюстрирует его применение для анализа общих белков на основе непрерывных моделей распознавания, полученных с SPRI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Подготовка различные решения и белковых проб
- Приготовьте 100 мл фосфатного буферного раствора (PBS-G), содержащем 50 мМ NaH 2 PO 4, 50 мМ NaCl, 10% глицерина при рН 6,8.
- Приготовьте 250 мл буферного раствора HEPES, содержащего 10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 0,005% Tween 20 при рН 7,4.
- Подготовка исходного раствора строительного блока 1 (BB1) лактозы и строительный блок 2 (BB2) сульфатной лактозы (Рисунок 1) на 0,2 мм в PBS-G.
- Подготовить 1 мл белковых растворов в HEPES: рахис hypogaea лектин (АХЛ) при 500 нм, миоглобина при 1 мкм, и лизоцим при 500 нМ.
- Подготовка 20 мл 1% SDS в сверхчистой воде.
2 Получение массива CoCRR
- Очистите золотую поверхность призмы 48 часов до использования очистителем плазмы в течение 3 мин в этих условиях: 75% кислорода, 25% аргона, 0,6 мбар, мощность 40 Вт
- Подготовьте одиннадцать чистых и смешанных SOLUTIOнс ВВ1 и ВВ2 с BB1 [] / ([BB1] + [BB2]) соотношение между 0 и 100% с шагом 10% при общем BB концентрации 0,1 мМ в PBS-G.
- Депозит 8 NL капли этих чистых и смешанных растворов на поверхности призмы, используя бесконтактную корректировщик в четырех экземплярах для каждого коэффициента с 44 мест в общей сложности (рисунок 2).
Примечание: 10% глицерина добавлен в PBS-G очень важно, чтобы уменьшить испарение растворителя и изменение концентрации ВВ после осаждения. - Поместите призму внутри чашку Петри, содержащую 1 мл сверхчистой воды и оставить его O / N при комнатной температуре самосборки BB1 и ВВ2 на поверхности золота. При этом предполагается, что средний состав поверхности в смешанном ЗРК отражает состав осаждения смешанного раствора (фиг.3) 11.
- Тщательно промойте призму с особо чистой воды, а затем высушить его в потоке аргона.
3 Белки зондирования по SPRI
- Установите incubatoR, в котором устройство SPRI помещают при 25 ° С, чтобы избежать изменения показателя преломления, вызванные изменением температуры во время зондирования белка.
- Вставьте нефункционализированных полоскания призму в 10 мкл полиэфирэфиркетон (PEEK) ячейка соединена с компьютерным управлением шприцевой насос, дегазатор и 6-порта клапана впрыска среднего давления потока (Рисунок 4). Заполните проточной системы с свежеотфильтрованная и дегазированной работает буферных HEPES.
- Снимите полоскания призму и вставьте призму, содержащий массив CoCRR в проточную ячейку. Выполнить HEPES в / мин скоростью потока 100 мкл. С помощью ПЗС-камеры удалить пузырьки воздуха, присутствующие на поверхности призмы путем передачи подвижного буфера быстро.
- Определите область исследования для каждого пятна рисуя круг такого же диаметра для интересующей области, основанной на хорошо получается контрастное изображение массива и с помощью интегрированного программного обеспечения в системе SPRI.
- Трассировка плазмонного кривые, которые представляют отражаютКривые ivity в зависимости от угла падающего, для всех пятен.
- Выберите угол (положение, при котором будет записан кинетические кривые) рабочих на самом высоком наклона кривых отражательной. Поверните сканирования зеркало, чтобы установить выбранный рабочий угол для кинетических измерений.
- Продолжение работы HEPES через систему потока до тех пор, отражательная сигнал для всех пятен не является стабильным и постоянным.
- Введите 1 мл раствора AHL с помощью шприца в петлю образца (500 мкл) с инжекторного клапана в позицию "нагрузки". Затем положить впрыска клапан в положение "инъекцию". Скорость потока используется для всех инъекции белка 100 мкл / мин.
- Начните кинетических измерений путем мониторинга изменения отражательной способности на время одновременно на всех точках.
- В конце инъекции белка, промыть массив с рабочим буфером в течение 8 мин. И, наконец, вводят 1 мл 1% SDS, чтобы восстановить ее.
- Повторите ту же процедуру для другой рroteins.
4 Обработка и анализ данных
- После ввода белкового раствора в проточную кювету, молекулярного связывания происходит, и вызывает сдвиг кривых плазмонов и изменение отражательной способности. Программное обеспечение захвата изображений преобразует измеренные значения интенсивности света, чтобы Оттенки серого, давая SPR изображения Рисунок 5А, и генерирует изменение отражательной от времени, давая сенсограмм (Рисунок 5б).
- С помощью вычислительной математики программное обеспечение для построения отражательную способность (R%) в конце каждой инъекции белка по сравнению с [BB1] / ([ВВ1] + [BB2]) Соотношение генерировать 2D непрерывного профиля эволюции (СПФ) для каждого образца (рисунок 5C).
- Добавьте [BB1] / ([BB1] + [BB2]) соотношение в сенсограмм (5В) для генерации 3D непрерывной эволюции ландшафта (CEL) для каждого белка (Рисунок 5D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы исследовать возможность электронного языка для общего анализа белка, были использованы три белка: AHL, миоглобина и лизоцим. Для каждого белка, особым 2D постоянная эволюция профиль, CEP, было сгенерировано ET, как показано на рисунке 6.
Кроме того, благодаря SPRI, который способен контролировать в режиме реального времени адсорбции и десорбции кинетики, для каждого белка время зависит шаблон непрерывное признание, называется 3D постоянная эволюция ландшафта (КВЖД), был создан. На рисунке 7, характерные CELS из этих трех белков показаны.
Рис.1 Химические структуры двух строительных блоков, используемых в данном протоколе, чтобы подготовить массив CoCRR.51901 / 51901fig1highres.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2 фото призмы после депонирования 44 капель чистых и смешанных растворов BB1 и ВВ2 используя бесконтактную пьезоэлектрический корректировщик с каждого коэффициента в четырех экземплярах. Призма был помещен рядом с трубки Эппендорф 1,5 мл.
Рисунок 3 Схематическое изображение массива CoCRR содержащей 11 дифференциальных рецепторы, которые были получены с чистых и смешанных решений BB1 и ВВ2 в различных соотношениях и позволяя смеси самостоятельно собираться на золотой сюрЛицо призму.
Рис.4 схематическое изображение системы обнаружения SPRI в сочетании с микрожидком системы.
Рисунок 5 Схематическое изображение обработки данных для генерации двух типов непрерывного распознавания образов с развитой электронный язык: 2D непрерывного профиля эволюции и 3D непрерывной эволюции ландшафта.
Рисунок 6 Continuouс профилями эволюции в течение трех чистых белков:. AHL (500 Нм), миоглобина (1 мкм) и лизоцима (500 нМ) Они были получены путем построения изменение отражательной (R%) в конце инъекции белка по сравнению с [BB1 ] / ([ВВ1] + [BB2]) отношение.
Рисунок 7. Пейзаж вкуса: характерные 3D CEĻŠ из АХЛ, миоглобина и лизоцима, порожденной электронный язык.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наиболее важные шаги для построения этой ET посвящены обеспечить хорошую воспроизводимость системы. Например, очистка золотую поверхность призмы с стандартизированной процедуры перед использованием, добавляя 10% глицерина в одиннадцати чистых и смешанных растворов ВВ1 и ВВ2, чтобы исключить испарение растворителя при ББ самосборки на золотой поверхности призмы, хранение нескольких повторов для каждого [BB1] / ([BB1] + [BB2]) соотношение, и т.д.. Что касается белка зондирования по SPRI, выбор рабочего угла имеет решающее значение. Как правило, это фиксируется на самом высоком наклона кривых отражательной. Кроме того, очень важно использовать стандартизированные условия эксперимента для каждого зондирования белков, таких как рабочая температура, расход, и т.д.. После каждой инъекции белка, массив CoCRR необходимо регенерировать для повторного использования с соответствующим решением, которое позволяет полное восстановление системы без ущерба для рецепторов.
e_content "> Чтобы продемонстрировать, что разработанная ех не является эффективным только для изучения сахара связывающих белков, как сообщалось ранее 9, но и для обычных белков, один лектин АХЛ вместе с двумя несахарные-связывающие белки миоглобина и лизоцима были использованы. Они были выбраны, чтобы иметь множество зарядов в HEPES (рН 7,4):. AHL (изоэлектрической точки (PI) 6,0), миоглобина (PI 7,2) и лизоцима (PI) 11 В частности, как показано на рисунке 6, каждый белок обладает уникальной ответ шаблон. АХЛ слегка отрицательно заряженные в HEPES. Его CEP показывает, что оно имеет высокий уровень взаимодействия с отрицательно заряженными ВВ2 богатых CoCRRs. Скорее всего, это связано с взаимодействием между положительно заряженной домена белка и ВВ2 богатых CoCRRs . Для миоглобина, который глобально нейтральный HEPES, нет большой разницы между сигналами, полученными со всеми CoCRRs. При сравнении миоглобина в КЭП к белым грибам АХЛ и лизоцима, даже при более высокой концентрации сигнала значительно вотWER. Что касается лизоцима, который положительно заряженного в HEPES, максимальный сигнал был получен с CoCRR, содержащие чистый BB2.Благодаря преимуществ SPRI способных мониторинга в режиме реального времени адсорбции и десорбции кинетики, для каждого белка 3D постоянная эволюция пейзаж был сгенерирован. Этот вид нестационарного распознавания образов приносит дополнительные параметры дифференциации для анализа белков. В частности, это может быть чрезвычайно полезным для анализа двух анализируемых представляющие аналогичную сродство для набора CoCRRs но отличающиеся в их кинетики взаимодействия. Как показано на рисунке 7, CEĻŠ легко различимы. Эти результаты показывают, что взаимодействие трех белков с CoCRRs зависит от их поверхностных характеристик, таких как распределение гидрофобных, нейтральных и заряженных аминокислотных остатков. Оба СЕР и CEL можно использовать в качестве "отпечатков пальцев" для дискриминации белка и PROSPECный идентификационный. Таким образом, ех эффективен для анализа общих белков.
Протокол, описанный здесь использует комбинаторный подход о строительстве ET для анализа белков. В отличие от других подходов, которые используют количество молекул, которые структурно сложным и трудоемким, чтобы синтезировать, только два небольшие молекулы были использованы для получения массива перекрестно-реактивный рецепторов способны дифференцироваться белки с хорошим разрешением в настоящем исследовании. Кроме того, в соответствии с предыдущим расследования, ех стабильна, воспроизводимым и многоразовые 9. Кроме того, SPRI позволяет контролировать обязательные события в режиме реального времени и получения новых непрерывных узоров признании с беспрецедентной надежности. В ближайшее время, дополнительные ББ с дополнительными физико-химических свойств будут введены для увеличения разнообразия CoCRR в массивах для анализа сложных смесей в жидкой или в газе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SPRi apparatus | Horiba Scientific-GenOptics | SPRi apparatus is placed in a temperature regulated incubator at 25 °C. | |
| Incubator | Memmert | ||
| Syringe pump | Cavro scientific instruments | Cavro XLP 6000 | |
| Micro Elite Degasser | Alltech | AT590507 | |
| 6-port medium pressure injection valve | Upchurch Scientific | The volume of injection loop used is 500 µl. | |
| Femto plasma cleaner (version 7) | Diener Electronic | On-line degassing system with 2 channel. | |
| Spotter | Siliflow | It is a non-contact piezoelectric spotter. | |
| SPRi-Biochip | Horiba Scientific-GenOptics | 36000067 | The prism is made of a high refractive index glass prism coated with a thin gold film (45 nm) and specially developed for imaging purposes. |
| Erythrina cristagalli lectin | Sigma-Aldrich | L5390 | |
| Arachis hypogaea lectin | Sigma-Aldrich | L0881 | |
| Myoglobin | Sigma-Aldrich | M1882 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| CXCL12α | Provided by Dr. Hugues Lortat-Jacob; for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| CXCL12γ | Provided by Dr. Hugues Lortat-Jacob; for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| Lactose | Provided by Prof. David Bonnaffé; for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| Sulfated lactose | Provided by Prof. David Bonnaffé; for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 |
References
- Margulies, D., Hamilton, A. D. Combinatorial protein recognition as an alternative approach to antibody-mimetics. Current Opinion in Chemical Biology. 14, 705-712 (2010).
- Umali, A. P., Anslyn, E. V. A general approach to differential sensing using synthetic molecular receptors. Current Opinion in Chemical Biology. 14, 685-692 (2010).
- Baldini, L., Wilson, A. J., Hong, J., Hamilton, A. D. Pattern-based detection of different proteins using an array of fluorescent protein surface receptors. J. Am. Chem. Soc. 126, 5656-5657 (2004).
- Zhou, H. C., Baldini, L., Hong, J., Wilson, A. J., Hamilton, A. D. Pattern recognition of proteins based on an array of functionalized porphyrins. J. Am. Chem. Soc. 128, 2421-2425 (2006).
- Wright, A. T., Griffin, M. J., Zhong, Z., McCleskey, S. C., Anslyn, E. V., McDevitt, J. T. Differential receptors create patterns that distinguish various proteins. Angew. Chem. Int. Ed. 44, 6375-6378 (2005).
- Wright, A. T., Anslyn, E. V. Differential receptor arrays and assays for solution-based molecular recognition. Chem. Soc. Rev. 35, 14-28 (2006).
- You, C. C., et al. Detection and identification of proteins using nanoparticle–fluorescent polymer ‘chemical nose’ sensors. Nature Nanotechnology. 2, 318-323 (2007).
- De, M., et al. Sensing of proteins in human serum using conjugates of nanoparticles and green fluorescent protein. Nature Chemistry. 1, 461-465 (2009).
- Hou, Y., et al. Continuous evolution profiles for electronic-tongue-based analysis. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 10394-10398 (2012).
- Campbell, C. T., Kim, G. SPR microscopy and its applications to high-throughput analyses of biomolecular binding events and their kinetics. Biomaterials. 28, 2380-2392 (2007).
- Stranick, S. J., et al. Nanometer-scale phase separation in mixed composition self-assembled monolayers. Nanotechnology. 7, 438-442 (1996).
