Introduction
La mayoría de las nuevas infecciones por el VIH en todo el mundo surgen a través de la transmisión heterosexual, las mujeres representan el 47% de las nuevas infecciones en 2011 (ONUSIDA 1). Entender el tracto genital femenino (FGT), uno de los principales portales de entrada para el VIH y otros agentes patógenos de transmisión sexual, es de gran importancia en el camino hacia la búsqueda de estrategias eficaces para prevenir la infección. Las respuestas inmunes en la mucosa genital son claramente únicas y difieren de los medidos en la sangre periférica 2. Sin embargo, los conocimientos actuales de la dinámica del sistema inmune en el FGT se limita, en el mejor. Hasta la fecha, los estudios sobre el medio ambiente inmune de la mucosa se han centrado en gran medida en los tejidos linfoides asociados al intestino (GALT), donde se ha convertido en claro que los primeros eventos en los tejidos de las mucosas después de la infección tienen un fuerte impacto en la progresión de la enfermedad posterior 3,4. Recogida de muestras de la mucosa genital representa un gran desafío y es al menos parcialmente responsable de la lack de comprensión de la inmunología de la FGT. Resolviendo el rompecabezas de la dinámica inmunitaria entre el huésped y el patógeno en el contexto del entorno distinto que es el FGT requiere métodos eficaces para la recogida y análisis de muestras de esta localidad.
El FGT se divide en dos secciones: el tracto reproductivo superior que incluye las trompas de Falopio, endometrio y endocérvix, y el tracto inferior que contiene el exocérvix y la vagina (revisado por Kaushic et al 5). Aún no está claro lo que la contribución relativa de estos diferentes sitios es a la infección por el VIH, pero se cree que ambos sitios podrían contribuir a la entrada del VIH 6. Células T representan el 40-50% de los leucocitos en los tractos reproductivos superior e inferior, mientras que los macrófagos comprenden aproximadamente el 10% (revisado en Rodríguez-García et al 2). Las células T pueden ser detectados en la vagina, el cuello uterino, y endometrio. Los macrófagos son más fuertemente localizeta en el endometrio y el tejido conectivo del miometrio que el cuello del útero, a pesar de que se pueden detectar en ambos tejidos. Por último, las células dendríticas plasmacitoides (PDC) y células de Langerhans también pueden ser detectados en los tejidos de TGC. El fenotipo y proporciones de poblaciones inmunes y su susceptibilidad a la infección por el VIH pueden variar importante de acuerdo a los ciclos hormonales, el uso de anticonceptivos hormonales, la vaginosis bacteriana o actividades sexuales 5,7-9.
Diversos métodos se han desarrollado para estudiar las poblaciones inmunes y el medio ambiente de la FGT. Biopsia cervical, cepillados cervicales y lavados cervicovaginales (CVL) 10-12 son los más utilizados en toda la literatura. Colección CVL por PBS lavado es el método más simple y permite el estudio de proteínas inmunomoduladoras, pero los resultados en rendimiento extremadamente bajo de células, y por lo tanto no es adecuado para el estudio de las poblaciones de células inmunes del TGC 13. Muestras CVL son, por otra parte, VEry útil para evaluar el entorno inmunológico del TGC mediante la medición de la expresión de diversas citoquinas, quimioquinas o factores antimicrobianos utilizando métodos tales como ELISA, de bolas de serie de citoquinas 14 o espectrometría de masas 15,16. Caracterización de las frecuencias de células inmunes, fenotipos y funciones se puede lograr mediante la recopilación de las células mononucleares de cuello uterino (CMC) por citocepillo cervical o mediante la toma de muestras de biopsia cervical.
Toma de muestras de biopsia de cuello uterino es un método invasivo que aumenta el malestar y el riesgo de sangrado y tarda de 2 a 11 días en sanar después del procedimiento, dependiendo del estado inmunológico de la mujer 12. Por otro lado, cepillados cervicales, a pesar de la menor rendimiento de las células recogidas, es un método menos invasivo y más conveniente para recoger las células inmunes de la TGC. Ambos métodos pueden alcanzar el mismo rendimiento de leucocitos CD45 +, pero dos cepillados cervicales secuenciales son necesarias para obtener la misma cantidad de células contenidas in una biopsia 13. Sin embargo, el muestreo citocepillo todavía proporciona un número aceptable de células (células CD45 + sobre 5000 / citocepillo) para obtener más fenotipificación ex vivo mediante citometría de flujo 14. Además, la caracterización funcional puede llevarse a cabo en estas muestras, como se han realizado la estimulación y citometría de flujo intracelular o qPCR utilizando CMC cytobrush derivados para identificar respuestas inmunes específicas para el VIH 17 o polarización de las células Th. 18. La expansión de la población de células T también puede facilitar los estudios funcionales con CMC 19.
Es importante tener en cuenta que las biopsias y cepillados muestrean porciones distintas de la TGC. Las biopsias se derivan de la parte superior del epitelio y el estroma del exocérvix 12,13, mientras cepillados cervicales muestrean del orificio cervical, la recolección de células derivadas del epitelio del endocérvix y, presumiblemente, la zona de transformación. Por lo tanto, las muestras citocepillo muestrean una reregión compone de una sola capa de epitelio cilíndrico, mientras que las biopsias, incluyen una región de la línea por un epitelio escamoso estratificado 5. Como resultado, la naturaleza de las poblaciones de leucocitos recogidos por biopsia cervical y citocepillo difiere. Las biopsias recogen una mayor proporción de células T CD3 +, mientras que cepillados resultan en la colección de una mayor proporción de monocitos CD14 + / macrófagos 13.
El estudio de la inmunología de la FGT ha habido un interés por muchos años 20-22 y hemos acumulado una gran experiencia con el estudio de los CMC cytobrush derivados. Nuestros estudios se centran principalmente en el estudio de la infección por el VIH, no infectados y expuestos al VIH seronegativos (HESN) trabajadoras sexuales de Nairobi, Kenia. El VIH se replica preferentemente en células T activadas 23 e inferior del número de células activadas que pueden ser dirigidos por el VIH en el TGC podrían contribuir a la protección contra la adquisición del VIH. De acuerdo con esta hipótesis, varios studies han descrito la activación inmune más baja entre los trabajadores del sexo HESN que están altamente expuestos al VIH aún permanecen infectados 24,25 y este fenotipo quiescente se observa también en el TGC 14. Aquí se describe la metodología para la elaboración y evaluación de la activación de células T en muestras de CMC derivados de cepillados cervicales por ex vivo citometría de flujo.
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Protocol
Declaración de Ética: La ética tableros de investigación, tanto de la Universidad de Manitoba y Kenyatta Nacional Hospital / Universidad de Nairobi aprobó este estudio y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los participantes en el estudio.
1. Preparación de Medios y CMC Collection Tubes
- Preparar tampón fosfato salino (PBS) (NaCl 137.93 mM, 2,67 mM KCl, 8,1 mM Na 2 HPO 4, 1,47 mM KH 2 PO 4). Autoclave en la esterilidad. Esto se puede almacenar a 4 º C durante varios meses.
- Pre-alícuota de 5 ml de PBS en 50 ml tubo Falcon (uno por cada muestra que se recogen) y se almacena a 4 º C hasta el momento de la recogida de muestras.
- Etiquetar 2-4 crioviales o 1,5 ml tubos de microcentrífuga por muestra para recoger el lavado para su almacenamiento.
- Preparar los medios de cultivo de células: RPMI 1640 + 1% de penicilina / estreptomicina / anfotericina B (concentración final 100 unidades / ml, 100 mg / 250 ng / ml ml y, respectively, sin FCS / FBS agregó.
2. Toma de muestras citocepillo
Recogida de muestras cytobrush es un procedimiento no invasivo que debe ser realizada por un médico o ginecólogo entrenado.
- Recoger las células mononucleares de cuello uterino (CMC) utilizando tanto un cytobrush y un raspador de madera o plástico. Recoger CMC del participante bajo examen con espéculo mediante la inserción del rascador y que gira alrededor del orificio cervical (Figura 1). Inserte el cytobrush en el sistema operativo endocervicales, girar 360 °, e inmediatamente colocar tanto el cytobrush y el raspador en el tubo Falcon de 50 ml que contiene 5 ml de PBS.
- Mantener las muestras en hielo / a 4 º C hasta su procesamiento. Para mantener la viabilidad celular, muestras de proceso dentro de las 2 horas de la recogida.
- Si es posible, recoger muestras de sangre coincidentes en la tapa verde de tubos vacutainer de heparina para células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de aislamiento para servir como un comparador / de control para el análisis de CMC.
3. Aislamiento de CMC
Lleve a cabo el procesamiento de muestras en un laboratorio de bioseguridad de nivel 2, en un gabinete de bioseguridad estéril con guantes dobles.
- Durante la recolección, las muestras de CMC pueden contaminarse con sangre. Excluir las muestras con contaminación de la sangre visible desde el estudio con el fin de evitar la inclusión de confusión de PBMC en la muestra final. Debido al bajo número de linfocitos aislados de muestras de CMC, contaminación de la sangre menor de edad puede fácilmente abrumar el componente de linfocitos CMC.
- Tubos Falcon Vortex que contienen tanto el cytobrush y rascador durante 45 segundos para disociar las células de los cepillos. Las muestras pueden ser espumosa durante este proceso; esto es normal.
- Utilice la cytobrush para raspar cualquier material restante de la rasqueta, y desechar el rascador en una solución de cloro. Para recoger las células permanezcan unidas al cepillo / raspador, use un guante fresco para exprimir el rascador entre el pulgar y el índice.Deslízate por el pincel, permitiendo que las células y PBS que se recojan en el mismo tubo de 50 ml. Deseche el cytobrush en una solución de cloro, y deseche el guante.
IMPORTANTE: Utilice un guante nuevo para cada muestra. - Montar un 100 m de células colador de nylon a un tubo Falcon de 50 ml fresco. Usando una pipeta de transferencia, recoger la suspensión de células de PBS desde el tubo de muestra y filtrado a través del filtro en el tubo fresco.
- Añadir 5 ml de medio RPMI 1640 al tubo de muestra original. Utilizando la pipeta de transferencia, lavar los lados del tubo de muestra con el medio RPMI, y transferir a través del filtro para el nuevo tubo de recogida. Lavar la parte inferior del filtro de nylon con el medio RPMI así.
- Centrifugar las muestras durante 10 min a 514 x g. Es crucial para salir de la freno de la centrífuga fuera durante este paso, con el fin de evitar el desplazamiento de la pastilla de CMC.
- Retire con cuidado el sobrenadante del tubo, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento. Tamaño de pellets será muy variable; en lome muestras, la pastilla es bastante grande debido a la presencia de grandes números de células epiteliales, mientras que en otros casos, el sedimento es apenas visible y altamente transparente.
- Resuspender el precipitado por una ligera agitación del tubo Falcon. Añadir 5 ml de PBS para lavar la muestra.
- Se centrifuga de nuevo durante 10 min a 514 xg sin freno de la centrífuga.
- Elimine con cuidado el sobrenadante y volver a suspender el sedimento como anteriormente. Las células están listas, ya sea para la crioconservación (usando un protocolo de criopreservación de PBMC), la estimulación o la citometría de flujo fenotipificación.
4. CMC tinción de la superficie y Citometría de Flujo
- Resuspender el sedimento de la etapa 3.10 en 100 l de solución de bloqueo y transferir ya sea en una placa de 96 pocillos o un tubo de FACS. La solución de bloqueo (para bloquear los receptores Fc gamma) receta es la siguiente: IgG de ratón 1,8 l (concentración final 0,2 g / l), 5 l de FBS y 93,2 l de FACS de lavado (PBS 2% de FBS).La tinción se puede realizar en una placa de 96 pocillos si los tamaños de pellets son lo suficientemente pequeños, pero puede necesitar ser realizado en tubos de FACS si gránulos son rutinariamente grande. Es importante para titular anticuerpos en consecuencia.
- Bloquee las muestras durante 10 minutos en hielo / a 4 ° C.
- Lavar las células con 100 l de FACS de lavado (PBS 2% de FBS) en placas de 96 pocillos, o 500 l en tubos de FACS. Se centrifuga a 600 × g durante 10 min a 4 ° C con el freno de baja (o desactivar, si un nivel bajo de freno no está disponible).
- Eliminar el sobrenadante y volver a suspender el sedimento celular por agitación. Añadir Stain viabilidad (Live colorante de viabilidad fixable Dead). Preparar colorante de viabilidad de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Es posible que haya que valora para su uso en cada configuración de laboratorio / citómetro. Incubar durante 30 min en la oscuridad a 4 ° C.
- Lavar las células 100 μl/500 l de PBS (para tubos de placa / FACS de 96 pocillos). Se centrifuga a 600 × g durante 10 min con baja / no freno. Retire supernatant y se resuspenden las células.
- Se incuban las células con el cóctel de anticuerpos de marcadores de superficie, en un volumen total de 100 l. IMPORTANTE: Optimizar y valorar cada una de citometría de flujo de la comisión antes de probar las manchas. Se incuban las células durante 30 minutos en la oscuridad a 4 ° C.
- Repita el paso 4.5. si la tinción en una placa de 96 pocillos, las células de transferencia a un tubo de FACS y se diluye hasta un volumen final de 750 l de FACS de lavado que contiene 1% de paraformaldehído (PFA) (o CytoFix, se diluyó 1 en 4). Proceder a la adquisición de datos en un citómetro de flujo.
5. Recogida y preparación de Cervical Vaginal Lavado (CVL)
- Antes de citocepillo de muestreo, utilizar una jeringa para lavar la endocérvix con 2 ml de PBS estéril y aspirar el lavado del fórnix posterior.
- Recoger la muestra de lavado aspirado en un tubo Falcon de 15 ml y mantener en hielo / a 4 º C hasta su procesamiento.
- Centrifugar la muestra a 400 xg durante 7 minutos para eliminar los desechos celulares.
- Collect el sobrenadante, alícuota de la muestra en 1 ml o 500 ml de alícuotas y se almacena a -70 ° C. Las alícuotas se pueden descongelar para ELISA o análisis de bolas de serie de proteínas CVL, pero evitar los ciclos de congelación / descongelación.
- Si se desea, resuspender el sedimento de restos celulares en el ARN Más tarde para medir la expresión de ARN siguiendo el protocolo del fabricante.
6. Adquisición de Datos
- Prepare un conjunto de tubos de compensación que coincide con el panel de anticuerpos. Ejecutar los tubos de compensación para ajustar la superposición espectral. Ejecute las muestras de ningún flujo multicolor citómetro de que está configurado para los anticuerpos conjugados con fluorocromos utilizados en el panel.
- Adquirir una muestra PBMC primero para ajustar la dispersión hacia adelante (FSC) y la dispersión lateral (SSC) de tensión a fin de detectar la población de linfocitos. Trate de mantenerlos a 100 en cada eje en una escala lineal. Ejecución de un control de PBMC hará que sea mucho más fácil para encontrar la población de linfocitos CMC.
- El umbral de FSC para las muestras de CMC puede ser necesario un aumento con respecto a las muestras de PBMC debido a manchar el eje SSC a bajos valores de FSC.
- Agite cada tubo antes de adquirir. Adquirir la totalidad del tubo para maximizar el número de eventos puerta de linfocitos recogidos. Vigilar la máquina con cuidado para evitar obstrucciones.
- Exportar los datos a un programa de análisis de citometría de flujo tal como FlowJo.
7. Estrategia Gating
- Seleccione dispersión lateral delantero alto (FSC-H) / área de dispersión lateral frontal (FSC-A) para determinar la población singlete.
- Seleccione Hora frente marcador fluorescente (como ejemplo FITC) para controlar por la calidad de la adquisición. Cambio en la tasa de flujo puede introducir artefactos en los datos. Excluir cualquier área que muestra la discrepancia en el caudal.
- Identificar la población de linfocitos en SSC-A/FSC-A parcela. Utilice un control PBMC para facilitar la identificación. Tenga en cuenta que la población de linfocitos CMC podría no ser tan claro como el control de PBMC. </ Li>
- Puerta en SSC-A/viability tinte para excluir las células muertas de células vivas. Las células muertas pueden incorporar de forma no específica de los anticuerpos, que introducirá los artefactos.
- Puerta en la SSC-A/CD3 para identificar la población de células T. Desde esta puerta, identificar las poblaciones CD4 + y CD8 +.
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Representative Results
Citometría de flujo multiparamétrica es una herramienta poderosa para diseccionar los fenotipos y las funciones de los subconjuntos de células en los tejidos previamente sin caracterizar. Análisis de muestras de CMC puede dar información tanto de linfocitos y monocitos poblaciones con estrategias apropiadas de compuerta.
Una estrategia de activación periódica CMC representante, en comparación con un perfil de PBMC emparejado, se muestra en la Figura 2. El FSC-A frente a FSC-H parcela permite la exclusión de dobletes de células, que son altamente prevalentes en las muestras de CMC en comparación con las PBMC, incluso después de la filtración (Figura 2A). El control de calidad incluye la eliminación de problemas de flujo, colocando puertas en el tiempo, donde los cambios en el caudal o artefactos debido a acumulaciones de muestras pueden ser fácilmente identificados (Figura 2B). Identificación de las poblaciones de linfocitos / monocitos es relativamente similar tanto en PBMC y muestras de CMC (Figura 2B). Exclusión de las células muertas de colorante de viabilidad impide la inclusiónlas células de la apoptosis que han tenido de forma no específica a los conjugados de anticuerpos fluorescentes. Viabilidad es menor en comparación con las muestras de CMC PBMC, y puede ser muy variable de una muestra a otra (Figura 2B).
Este análisis se centrará en el fenotipo de la población de linfocitos T, pero las muestras de CMC también contienen monocitos. Después de gating en la población de monocitos, las células se gated basado en un colorante de viabilidad y un canal de volcado (Figura 3A). El canal de volcado contiene anticuerpos contra CD56, CD3 y CD19, y la compuerta en las células del canal negativo volcado eliminará cualquier tipo de contaminación de linfocitos en la población de monocitos. Las células pueden entonces ser identificados basado en la expresión de marcadores tales como CD16 y CD11c. La población de linfocitos CD3 + se reduce típicamente en proporción entre la CMC en comparación con las PBMC (Figura 3B, Tabla 1). La alta proporción de células epiteliales, granulocitos y CD3 + CD45 + leucocitos no contenidas en muestras de CMC dominates más de la población de células T. Las células T CD4 + (mediana: 55,30%, IQR: 50,53% -68,18%) y las células T CD8 + (mediana: 25,60%, IQR: 21,50% -33,80%) se encuentran en una proporción menor (más cercano a 02:01 entre CMC) en comparación con la relación 05:01 observada entre las muestras de PBMC sanos de sexo cohorte comercial trabajador en Kenia (Figura 3C, Tabla 1). Al igual que en la sangre, la infección por VIH afecta a las proporciones de células CD4 + y células T CD8 + entre CMC, la disminución de los CD4 +: CD8 + a 0,7 (mediana: 0,7, IQR: 0,31-2,45) (Figura 3C, Tabla 1). Sin embargo, no es raro observar una mayor proporción de células T CD8 + en las poblaciones de CMC de individuos sanos (Figura 3C). Curiosamente, una amplia-CD4-CD8 (doble negación, DN) T población celular en relación con la frecuencia de células PBMC DN T se puede observar entre muchas muestras de CMC de las personas VIH-negativas (Tabla 1). Estos resultados son similares a los obtenidos para las muestras de prepucio 26, Although estas células están pobremente caracterizados.
Marcadores típicos fenotípicas de las células T son fácilmente cuantificables entre los CMC pero pueden ser diferentes a partir de PBMCs; Figura 4 demuestra la identificación de un + CD161 + + (MAIT) de la población de CD8 que es distinta en PBMCs pero casi ausente en los CMC (Figura 4A). La expresión de marcadores de activación CD69 y HLA DR, CCR5 marcador de migración o marcadores agotamiento PD-1 se puede identificar claramente en CD4 + o CD8 + poblaciones (Figura 4 B).
La cuantificación de la concentración de citocinas / quimiocinas en CVL se puede analizar en paralelo con tinción de CMC. Esto permite la correlación entre el entorno de citoquinas CVL (pro-inflamatoria frente immunoregulatory) y el fenotipo de los CMC. Estos datos también pueden ser utilizados para determinar si la frecuencia de la expresión del receptor de quimioquinas de las CMC se relaciona con la expresión relativa de plasma o quimiocinas CVL 14. Tabla 2 </ Fuerte> indica la concentración media de citoquinas y quimioquinas analitos en CVL recogidos de mujeres sanas y ensayadas por los kits de MILLIPLEX de bolas de serie de citoquinas.
Figura 1. Anatomía del aparato reproductor femenino. A) Corte transversal del tracto reproductivo femenino, que muestra la relación de la vagina hacia el orificio externo del cuello uterino, canal cervical y de la cavidad uterina. B) ángulo de visión delantera del cuello uterino, mostrando el orificio externo, y el anterior y fondo de saco posterior las regiones a las 12:00 y 06:00, respectivamente. Reproducido con permiso de Reusch et al 27. El rascador de cuello uterino se hace girar alrededor del orificio cervical para recoger CMC, mientras que el citocepillo se inserta en el canal cervical y se hace girar para recoger CMC adicional. Lavados vaginales cervicales (CVL)son recogidos por el lavado del endocérvix con PBS y se percibe desde el fondo de saco posterior.
Figura 2. Supresión y control de calidad de las muestras de CMC. A) Identificación de los interiores por FSC-A frente a FSC-H parcela demuestra el bajo porcentaje de interiores en muestras de CMC en comparación con muestras de CMSP, incluso después de que se muestran en función de filtro-CMC aislamiento. B) Los ejemplos de muestras de alta y de baja calidad para la calidad de varios pasos de control. Supresión del tiempo frente a la fluorescencia (o SSC / FSC) puede identificar problemas de caudal y ser usado para excluir eventos que pueden resultar en artefactos de tinción. Una población de linfocitos basada en FSC frente a SSC puede o no puede ser fácilmente identificado dependiendo de la muestra. La inclusión de un colorante de viabilidad es crucial, ya que algunas muestras pueden contener menos de 50% de células viables. ViabiliTy (-amina reactiva) colorantes tiñen las células muertas con más intensidad que las células vivas, como la pérdida de integridad de la membrana después de la muerte de células permite el tinte para acceder a grupos amina sobre proteínas dentro de la célula. Por lo tanto, las células viables se identifican colocando puertas en la población de tinte negativo viabilidad.
Figura 3. Identificación de subconjuntos de células T. A) El CD3 + de la población entre las muestras de CMC es generalmente una proporción menor de la puerta de linfocitos en comparación con muestras de PBMC. Muestras de CMC también son más variables en el tamaño de la población de células T, como se muestra. B) CD4 +, CD8 + y las poblaciones de células CD4-CD8-T se identifican fácilmente tanto en CMC y muestras de PBMC. CD4: proporción de células CD8 T puede variar de una muestra a otra entre los CMC, como se muestra. Los datos mostrados se recogió de las mujeres no infectadas por el VIH.
Figura 4. Fenotipos de células T en muestras de CMC. A) La mucosa asociada células T invariante (MAIT) CD8 + CD161 + + población que se identifica con facilidad en muestras de PBMC es casi totalmente ausente en los CMC. Las células CD161 + T + CD8 pueden ser identificados en las dos muestras. B) CMC exhibición de marionetas expresión de marcadores fenotípicos incluyendo CD69, HLA DR, CCR5 y PD-1. Gates, se elaboraron sobre la base de la fluorescencia menos uno (FMO) controles. Los datos mostrados se recogió de las mujeres no infectadas por el VIH.
| CMC | PBMCs | |||||
| Población | VIH + (n = 34) | VIH-(n = 44) | Valor P a | VIH + (n = 28) | VIH-(n = 35) | Valor P a |
| mediana (IQR) | mediana (IQR) | mediana (IQR) | mediana (IQR) | |||
| % de linfocitos en vivo | 85,65 (60,25-92,63) | 88,70 (74,85-95,38) | 0.1193 | - | - | |
| % CD3 + en puerta de linfocitos en vivo | 5,94 (0,90-16,80) | 1,44 (0,39-8,46) | 0.0303 | 41,15 (17,08-62,10) | 41,90 (20,40-51,30) | 0.4231 |
| valor p b | <0,0001 | <0,0001 | ||||
| % CD8 + CD3 + en puerta | 43,20 (25,75-66,00) | 25,60 (21,50-33,80) | 0.001 | 30,05 (22,75-38,78) | 14,60 (8,01-24,80) | <0,0001 |
| valor p b | 0.0291 | <0.0001 | ||||
| % De CD4 + CD3 + en la puerta | 31,10 (20,45-63,10) | 55,30 (50,53-68,18) | 0.0003 | 56,10 (50,10-61,28) | 77,20 (65,90-92,80) | <0,0001 |
| valor p b | 0.002 | <0,0001 | ||||
| CD4 victorias: CD8 | 0,71 (0,31-2,45) | 2,09 (1,55-3,01) | 0.0003 | 1,92 (1,44-2,39) | 5,34 (2,66-10,77) | <0,0001 |
| valor p b | 0.004 | <0,0001 | ||||
| % DN en CD3 + puerta | 10,40 (6,36-14,30) | 10,70 (6,76-19,10) | 0.4793 | 9,58 (6,65-15,98) | 7.01 (05.26 a 08.07) | 0.0032 |
valor p | 0.8338 | 0.0006 | | ||||
Tabla 1. Proporciones relativas de los subconjuntos de células T en los CMC y PBMCs. CMCsamples de 44 VIH-negativos y 34 trabajadoras sexuales VIH-positivos y muestras de CMSP de 35 seronegativos y 28 seropositivos fueron comparados por su proporción relativa de células vivas, las células T CD3 + y CD4 +, CD8 + y CD8-CD4-DN subconjuntos de células T. Los datos se presentan como mediana (25 º -75 º intercuartil, IQR). Las diferencias entre grupos se calcularon mediante la prueba de Mann-Whitney. valores p indican el resultado de una comparación entre un VIH + y VIH-o b CMC y de PBMC de datos.
| El analito | La media de un (Std. dev.) | |
| pg / ml | pg / ml | |
| MIP-3a | 35,5 (90,6) | 2.9 |
| MIG | 1447 (3026) | 19.4 |
| ITAC | 2,7 (6,3) | 0.8 |
| Fractalkine | 51,6 (69,5) | 10.6 |
| IFN-a2 | 24,0 (12,0) | 40.6 |
| IFN-g | 3,9 (14,2) | 0.3 | IL-1a | 268.4 (721.3) | 6.4 |
| IL-1b | 46.8 (126.2) | 0.7 |
| IL-1ra | 4967.0 (3597) | 5.5 |
| IL-2 | 0,9 (2,6) | 0.6 |
| IL-6 | 14,8 (30,5) | 0.7 |
| IL-7 | 6,3 (10,1) | 0.1 |
| IL-8 | 1491 (2126) | 0.3 |
| 4.5 (8.6) | 0.5 | |
| IL-15 | 1.4 (2.7) | 0.7 |
| IL-17 | 1,1 (2,2) | 0.3 |
| IP-10 | 381.4 (1100) | 2.2 |
| MCP-1 | 129,4 (340,4) | 1.6 |
| MCP-3 | 5,9 (7,1) | 3.7 |
| MDC | 84,2 (94,6) | 6.9 |
| MIP-1a 20,9 (28,9) | 6.4 | |
| MIP-1b | 28,5 (42,6) | 8.9 |
| sCD40L | 10,8 (19,3) | 9 |
| RIL-2Ra | 8.4 (9.8) | 7.7 |
| TNF-a | 1,9 (4,1) | 0.1 |
Tabla 2. Expresión de citocinas y quimiocinas en CVL. Las muestras de 51 no infectados por el VIH (no-HESN) participantes de la cohorte trabajador de sexo femenino en mitad del ciclo menstrual se ensayaron para la concentración de citoquinas / quimioquinas usando el cordón de citoquinas humano / Quimiocina MILLIPLEX MAPA kit de matriz de acuerdo con el fabricante'S de protocolo durante la noche, está probado en duplicado. IFN: interferón; MCP: proteína quimiotáctica de monocitos; MDC: quimiocinas macrófagos derivados, s: soluble; TNF: factor de necrosis tumoral; MIP: proteína inflamatoria de macrófagos; ITAC: interferón alfa inducible T quimiotáctica celular; MIG: monoquina inducida por el interferón gamma; -10 IP; proteína inducible de interferón. a Los valores por debajo del límite de detección se les asignó un valor de la mitad del límite de detección.
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Discussion
Dadas las grandes lagunas de conocimiento con respecto a la inmunidad en el tracto genital femenino (FGT), el análisis fenotípico de los CMC puede proporcionar una amplia gama de puntos de vista en varias poblaciones de linfocitos en el cuello uterino. Junto con el análisis proteómico y mediciones de carga viral en el lavado de cuello de útero, la inmunidad a las infecciones de transmisión sexual (ITS) s y otros patógenos puede ser diseccionado en varias poblaciones.
Consideraciones técnicas - CMC: El aislamiento y la tinción con éxito muestras de CMC puede ser un reto. Optimización del protocolo de recogida de CMC ha puesto de relieve la eficacia de la recogida de la CVL primero, seguido por el raspador de cuello uterino y, finalmente, la citocepillo. Es importante aumentar el tamaño de la muestra planificado en comparación con los calculados para los estudios de sangre periférica debido a la mayor probabilidad de exclusión de la muestra para una variedad de razones, que se analizan a continuación.
Pruebas del deseopanel de flujo d en muestras de CMC es fundamental antes de iniciar el estudio. Es importante controlar la autofluorescencia celular en muestras de CMC, en particular en la puerta de monocitos. CMC autofluorescencia en algunos canales puede ser elevado en comparación con las PBMC, lo que puede afectar gating y las relaciones de señal a ruido. Por otra parte, los voltajes óptimos deben ser confirmados por muestras de CMC si previamente determinada en muestras de CMSP.
Para preservar la integridad de los datos, es importante excluir muestras con contaminación de la sangre o de confusión ITS. La inclusión de un colorante de viabilidad de células en el panel de citometría de flujo es vital para excluir las células muertas que se llevan de forma no específica a anticuerpos fluorescentes. Aunque la mayoría de las muestras son altamente viables, no es raro para excluir el 10-20% de las células por el colorante de viabilidad. Si se planea subconjunto de análisis basado en la expresión de CD4 y CD8, es importante para obtener al menos 100 CD3 + eventos para continuar con el análisis. Las muestras recogidas de diferentes mujeres, e incluso de la misma mujer a t diferentes puntos de tiempo, puede producir muy diferentes números de células 13.
Análisis de citometría de flujo de linfocitos de la mucosa suele ser más fácil y más exitoso si una muestra de control PBMC se puede ejecutar de forma simultánea con las muestras de CMC. En algunas muestras de CMC, la población de linfocitos es difícil de identificar por FSC / SSC gating, pero la inclusión de la muestra PBMC dará una mejor idea de dónde puerta. Incluso en muestras sin un linfocito claro FSC / SSC población, distinta poblaciones CD3 + se pueden identificar. Si la adquisición de datos es interrumpido por problemas técnicos (citómetro de obstrucción de admisión, burbujas, etc) de activación periódica en la fluorescencia con el tiempo puede eliminar artefactos de recopilación de datos al tiempo que permite el análisis de muestras. Controles apropiados, tales como la fluorescencia menos uno (FMO) para la colocación de tubos de puerta pueden necesitar ser efectuado en las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) cuando el número de células requeridas es demasiado sustancial de utilizar muestras cytobrush.
ONTENIDO "> Múltiples estudios han demostrado la detección de respuestas de células T específicas de antígeno entre muestras de CMC. la producción de citoquinas CMC también puede ser inducida por PMA / Ionomycine, PHA, IFN y anti-CD3 estimulación. Una de las principales limitaciones de estimulaciones CMC está número de células, lo que reduce el número de condiciones y controles que se pueden realizar por muestra. También es crucial controlar cuidadosamente y tomar medidas adicionales para evitar la contaminación del cultivo celular. El tracto genital no es un sitio estéril, y en algunos casos los antibióticos adicionales debe añadirse a medios de cultivo para prevenir el sobrecrecimiento bacteriano. Aunque CMC pueden ser criopreservados con poca pérdida de viabilidad, la recuperación es de aproximadamente 50%, haciendo muestras criopreservadas pobres candidatos para estudios de estimulación a menos que se planea la expansión de células 10.Consideraciones técnicas - CVL: Colección de CVL lo general resulta en la muestra limitada volUME, evitando que el análisis de un gran número de concentraciones de proteínas mediante la repetida ELISA. Un ensayo alternativo es la serie de bolas de citoquinas, basado en la plataforma Luminex o plataforma de citometría de flujo. Kits de multiplexados están disponibles de varias fuentes comerciales, lo que permite la cuantificación de hasta 30 analitos en un volumen de muestra muy pequeño (a menudo ~ 25 l). La optimización de estos ensayos ha revelado la detección óptima de los analitos utilizando el protocolo de incubación durante la noche. Algunos analitos que son detectables en las muestras de plasma / suero no son detectables en la CVL. En particular, la concentración de las muestras de CVL utilizando columnas de centrifugación no mejoró la detección de cualquier analitos, lo que sugiere que no hay ningún beneficio a la concentración de la muestra antes de ejecutar el ensayo de bolas de serie.
Factores de confusión específicos de la mucosa genital: Estudios de inmunología FGT deben tener cuidado de reconocer y tener en cuenta el mayor número de variables de confusión como sea posible. El ciclo menstrual hahora como se ha demostrado para afectar la inmunidad de sangre periférica 28, y es probable que ejerce un mayor impacto sobre fenotipo CMC y composición de células, así como las proteínas recogidas de muestras de CVL 29. Sincronización de la recogida de muestras de la fase del ciclo menstrual es la mejor forma de reducir la variabilidad de los datos, tanto si se mide por los niveles de estrógeno / progesterona o días desde el primer día de la última menstruación. El uso de la anticoncepción hormonal también influye en gran medida el medio ambiente de la mucosa y su efecto debe tenerse en cuenta al diseñar o analizar un estudio. La alteración de la flora vaginal resultantes en la vaginosis bacteriana (BV) también modifica el entorno inmunológico y fenotipos celulares. BV se puede diagnosticar mediante la tinción de Gram y una puntuación de Nugent se puede establecer para controlar el efecto de confusión de la BV.
La actividad sexual también tiene un profundo impacto en la inmunología genital, ya que alo-respuestas al semen pueden inducir cambios rápidos y dramáticos en cell fenotipo y el tráfico. De hecho, Lajoie et al. han descrito diferencias en la composición de proteínas CVL entre trabajadoras sexuales y poblaciones de trabajadores no sexuales, con cambios que se producen en los primeros años después de la iniciación del trabajo sexual.
Por último, las prácticas culturales, como las duchas vaginales introducirán más variación en el muestreo de la mucosa. Dependiendo del reactivo utilizado (lejía, detergente, jugo de limón, etc), las duchas vaginales puede reducir la frecuencia / fenotipo de las poblaciones de células, o alterar la autofluorescencia en comparación con otras muestras. Lo ideal sería que la ducha vaginal antes de citocepillo muestreo debe ser desalentado entre los donantes.
Las futuras aplicaciones: Además de producir datos importantes en la regulación de la inmunidad de la mucosa durante la variabilidad menstrual / hormonal, infección viral / bacteriana y antes / después de la menopausia, el análisis de las muestras de la mucosa es particularmente relevante para los estudios de vacunas contra ITS / patógenos de las mucosas. En el caso del VIH,donde el objetivo principal de los estudios de vacunas es obtener un anticuerpo de la mucosa o de la respuesta de las células T, el desarrollo de ensayos basados en CMC jugará un papel crucial en la determinación de correlaciones de protección.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 μm cell strainer for 50 ml Falcon tube | BD | 352360 | CMC processing |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30027.01 | CMC processing |
| Fetal bovine serum | Life technology | 16000044 | CMC processing |
| Fungizone | Life technology | 15290-018 | CMC processing |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333-20ml | CMC processing |
| 50 ml Falcon tube | Fisher | 14-959-49A | CMC processing |
| Blood Bank disposable transfer pipette | Fisher | 13-711-6M | CMC processing |
| Cytobrush plus | Cooper surgical | C0121 | CMC sampling |
| Disposable cervical scraper | Quick medical | 2183 | CMC sampling |
| 15 ml Falcon tube | Fisher | 14-959-70c | CVL processsing |
| 1.5 ml tube Eppendorf | Fisher | 05-402-18 | CVL storage |
| LIVE/DEAD Fixable Cell Stain Kit | Invitrogen | Various | Flow cytometry reagent |
| Fixation buffer (4% PFA) | BD | 554655 | Flow cytometry regeant |
| IgG mouse | Sigma | I8765 | Flow cytometry regeant |
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