Abstract
Myeloide celler er de mest tallrike immunceller i tumorer og har vist seg å fremme tumorprogresjon. Moderne intrabildeteknikker aktivere observasjon av levende cellular oppførsel inne i orgelet, men kan være utfordrende i enkelte typer kreft på grunn av orgel og tumor tilgjengelighet som tarmen. Direkte observasjon av tarmsvulster har ikke tidligere blitt rapportert. En kirurgisk prosedyre som er beskrevet her tillater direkte observasjon av myeloide celle dynamikk innenfor tarmsvulster i levende mus ved hjelp av transgene fluorescerende reporter mus og injiserbare tracere eller antistoffer. For dette formålet, har en fire-farge, multi-regionen, mikro-lensed spinnende disk konfokal mikroskop som gjør langvarig kontinuerlig bildebehandling med rask image oppkjøpet blitt brukt. APC min / + mus som utvikler flere adenomer i tynntarmen er krysset med c-FMS-EGFP mus for å visualisere myeloide celler og med ACTB-ECFP muså visualisere intestinale epitelceller krypter. Fremgangsmåter for merking av forskjellige tumorkomponenter, slik som blodkar og neutrofiler, og fremgangsmåten for posisjonering av tumoren for avbildning gjennom serøse overflaten er også beskrevet. Time-lapse filmer samlet fra flere timer med bildebehandling tillater analyse av myeloid celle atferd in situ i tarmmikromiljøet.
Introduction
Overveldende bevis viser nå at svulsten mikromiljøet, som består av heterogene cellepopulasjoner, inkludert fibroblaster, endotelceller, immunsystemet og betennelsesceller, ekstracellulære matrise, og løselige faktorer, spiller en avgjørende rolle i initiering og progresjon av solide svulster ved å bidra til nesten alle kjennetegnene ved kreft 1. Faktisk, i løpet av tumorprogresjon, er det stadig dynamisk interaksjon mellom transformerte kreftceller og stromale celler som utvikler seg til å generere en gunstig mikromiljøet til malignitet 2. Blant de immuncellene som infiltrere svulsten mikromiljøet, myeloide celler er de mest tallrike tre. Som består av tumorassosierte makrofager (TAM), myeloide-avledet suppressor celler (MDSCs), dendrittiske celler (DC) og nøytrofile (PMN), er myeloide celler rekruttert fra benmargen og gradvis infiltrere svulster, slippe cytokiner, vekstfaktorer og proteaser som kan fremmetumorvekst og spre fire. Crosstalk mellom kreftceller og myeloide celler er kompleks, men dynamisk. Dermed forståelse av naturen av deres samspill er avgjørende for å finne ut hvorfor disse cellene fremme kreft progresjon i stedet for å delta i en anti-tumor immunrespons, og kan bidra til å finne nye mål å kontrollere den.
Direkte observasjon av intramikroskopi gir informasjon om celle dynamikk innenfor vev av levende mus fem. En fire-farge, multi-regionen, mikro-lensed spinnende disk confocal system er designet for å studere stromale celler i mammary svulster seks. Denne tilnærmingen muliggjør langvarig kontinuerlig avbildning og omfatter flere fordeler, såsom (a) rask bilder anskaffelse for å minimalisere bevegelsesartifakter, (b) langvarig anestesi, (c) fire farger anskaffelse for å følge forskjellige celletyper, (d) fluorescerende merking av forskjellige tumorkomponenter, og (e) observasjon av forskjellige tumor microenvironments within samme mus å unngå mus til mus variabilitet 7-9. Med denne teknologien, har ulike celle atferd er rapportert i melke tumor virus (MMTV) promoter-drevet polyoma midten T onkogen (PyMT) modell som viser progressive stadier av tumorigenesis. Regulatoriske T-lymfocytter (tregs, visualisert av foxp3 EGFP transgenet) vandrer fortrinnsvis i nærhet til blodkar mens DCS (CD11c-DTR-EGFP), karsinom-assosiert fibroblaster (Fsp1 + / + -EGFP) og myeloide celler (C-FMS -EGFP) oppviser høyere motilitet på tumor periferien enn i tumormassen. I tilstanden av akutt systemisk hypoksi, celler migrert annerledes: Tregs slutte å migrere i motsetning til myeloide celler som fortsetter å bevege 6. I tillegg, på samme musemodell, har det blitt vist at doxorubicin følsomhet endres med tumorstadium, er legemiddelfordeling relatert til medikamentrespons, og doksorubicinbehandling fører til CCR2 avhengig rekruttering av myeloide celler til svulster. Dermed kan direkte avbildning også brukes til å få innsikt i narkotika reaksjoner i situ og biologi chemoresistance 10,11.
Adenomatøs polypose coli (APC) genmutasjoner forekommer vanligvis i menneskelige kolorektale adenomer og karsinomer 12 og mutasjon av en enkelt kopi av APC-genet resulterer i familiær adenomatøs polypose (FAP), som gir en ekstremt høy risiko for tykktarmskreft 13. Musen belastningen Apc Min / + bærer en avkutting mutasjon ved kodon 850 av APC genet og spontant utvikler flere tarm adenomer hele tynntarmen 14- 16. Long-term intravital avbildning av tarmen er utfordrende på grunn av invasivitet av prosedyren, siden åpning av bukhulen er nødvendig for å få tilgang til tarmen. Kortsiktig direkte avbildning studies har tidligere blitt publisert på sunn tarm 17,18, men langsiktig direkte observasjon av tarmsvulster har ikke blitt rapportert. En kirurgisk prosedyre har blitt designet og raffinert for å visualisere svulster gjennom serøse overflaten av tarmen, ved hjelp av intra spinnende disk mikros system som tidligere ble brukt til bildebrystsvulster 6,10. I denne artikkelen er en protokoll som er beskrevet som tillater en å følge adferden av myeloide celler i tumorer i tynntarmen ved hjelp av APC min / + mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med prosedyrer godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité (IACUC), UCSF. Alle bildebehandling eksperimenter var ikke-overlevelse prosedyrer og dyrene ble avlivet umiddelbart etter slutten av bildet oppkjøpet.
1. Generering av Mus
MERK: Apc Min / + mus, bærer en mutasjon på Apc genet, spontant utvikle 50-100 adenomer i tynntarmen.
- Cross Apc Min / + mus med ACTB-ECFP linje, som uttrykker ECFP under aktin promoter, og videre med C-FMS-EGFP linje, som uttrykker EGFP under c-fins arrangøren til å gjenkjenne de myeloide celler. Heterozygote dyr for ACTB-ECFP og c-FMS-EGFP brukes til å oppdage fluorescens.
- Bruk mus ved 3-4 måneders alder til bilde klart påvisbare adenomer.
2. Utarbeidelse av Materials før operasjon
MERK: Detaljene i mikroskop set-up har vært beskrevet tidligere 6,7.
- Mikroskop
- Slå på varmeteppet. Slå på argon laser for 488 nm eksitasjon og solid-state 405 nm, 561 nm, og 640 nm lasere. Slå på mikroskopet, spinning disk styreenhet, den AOTF, laserstyreenheten, og kameraet kontrolleren.
- Åpne mikroskop lukkeren, som slår LED rødt. Slå på datamaskinen og kameraprogramvaren.
- Imaging Platform
- Sørg for at scenen innsatsen er ren. Ellers rent med såpe og vann og tørk.
- Ta to Dekk og bruke lab tape til å feste dem på innsatsen. Plasser innsatsen på scenen og rengjør den med alkohol våtservietter.
- Ved hjelp av lab tape, feste varmeteppet til høyre side av scenen.
- Verifisere integriteten av gummimembran på nesepartiet og endre det hvis imidlertid nødvendigy. Posisjon og fikse nesen membran for isoflurananestesi levering til dyret ved hjelp av gasbind og lab tape.
- Isoflurananestesi System
- Fyll opp isofluran tank.
- Slå på vakuum og juster til 1,2 l / min.
- Tilsett destillert vann til forstøveren og koble forstøveren til isofluran systemet.
- Slå på oksygen analysator og koble den til isofluran system. Slå på oksygentanken og sikre at oksygen analysator viser 100%. Juster O 2 strømmen til 0,2 l / min.
- Slå på nitrogentanken og justere strømningen ved 0,8 L / min. Sørg for at oksygen analysator viser 21%.
- Utarbeidelse av kirurgi verktøy og plattform
- Clean 2 par disseksjon tenger og sakser med såpe og vann.
- Slå på varmt perle sterilisator og la den oppnå 250 ° C. Sterilisere kirurgi verktøy for 30 sek. La dem avkjøles.
- Plasser en lab soaker på kirurgi benk.
- Bruk en isoporlokket som et kirurgisk plattform. Dekk med et stykke lab soaker. Forbered en andre stykke lab soaker å endre etter barbering musen.
- Plasser nesepartiet med linjen av anestesi på dekket styrofoam lokket, og fest den til isoporlokket (ikke på lab soaker) med litt tape og bruke to nåler på begge sider av nesen membran for å holde den på plass.
- Monter betadine, alkohol våtservietter, steril kompress, superlim, objektglass, elektrisk barbermaskin, og 4 stykker av lab tape.
3. Utarbeidelse av injeksjoner
- Under hetten, forberede en insulinsprøyte (28 G x ½ i) med 7 pl av lager AF647-konjugert Ly-6G (Gr1) antistoff (1 mg / ml) i 100 ul av 2,000 kDa rhodamin-dekstran (4 mg / ml ) for retro-orbital injeksjon. Retro-orbital injeksjon anbefales i APC Min / + mus siden anemi som utvikler i disse dyrene gjør halevenen difficult for å detektere gjennom huden.
- Tilbered en andre insulinsprøyte med 1 mg / kg atropin fortynnet i 150 ul PBS for subkutan (SC) injeksjon før avbildning for å dempe peristaltiske bevegelser av tarmen.
4. Forberedelse av tarmen for Imaging
- Kontroller at anestesi linje til induksjonskammeret er åpent, og linjene på operasjonsbordet og mikroskop er lukket.
- Overfør dyret til anestesikammer. Lukk anestesi kammeret og slå på isofluran til 4% (med 21% O 2).
- Når musen puster dypt og langsomt (etter 5-6 min), overføre den til det kirurgiske scenen på sin flanke og injisere Gr1 antistoff løsning og / eller dekstran løsning retro transorbitalt.
- Åpne anestesi linje knyttet til det kirurgiske plattformen. Lukk linje til anestesi kammeret og sette musen på ryggen med snuten i anestesi kjegle.
- Reduser isoflurankonsentrasjon fra 4% til 2,5%.
- Kontroller at musen er godt bedøvet ved å knipe sin footpad og testing av hornhinnerefleksen.
- Legg oftalmisk smøre salve på øynene for å hindre tørrhet mens under anestesi.
- Sikre lemmer musen til det kirurgiske scenen ved å legge lab tape.
- Fjerne hår fra baksiden ved hjelp av en elektrisk barbermaskin. Ta også bort hår fra venstre hind lemmer for å posisjonere oksymeteret før oppkjøpet. Fjern lab soaker fra operasjons scenen og erstatte med en ren for å unngå hår forurensning.
- Desinfiser ventral overflaten med desinfeksjonsservietter og betadine.
- Injiser atropin løsning (fra 3,2) fm i den ene siden av musen.
- Lag en 1 cm ventral midtlinjen snitt gjennom huden og bukhinnen Ved å bruke saks og en pinsett. Løft forsiktig 3-4 cm av tarmen og å identifisere en eller flere tumorer i bildet.
- Ta et glass microscope lysbilde og posisjon en løkke av tarmen på den med en svulst på toppen.
- Legg litt superlim til noen få steder langs tarmen å feste den til lysbildet. Vent ett min for limet tørke. Bruk en markør for å tegne en linje på lysbildet peker til svulsten for å lette sin lokalisering med confocal.
5. plassere musen på scenen og forberedelse til Image Acquisition
- Fjern lab tape fra lemmer.
- Åpne anestesi linje til objektbordet og lukke den ene til den kirurgiske plattformen.
- Overfør musen nøye for å mikroskopet scenen med sin ventral side ned og nesen sin i nesepartiet. Fest anestesi tråd med noen lab tape.
- Re-plasser mus og / eller lysbildet for å få tarmen i sentrum av en av cover-gled vinduer. Forsiktig tape ned lysbildet med lab tape.
- Fest oksymeteret sonde til venstre lem av musen tilfølge sitt hjerte og respirasjonsfrekvens og arteriell oksygenmetning nivåer.
- Dekk til mus med varmeteppet for å unngå nedkjøling.
- Reduser isofluran konsentrasjon fra 2,5% til 1 til 1,5% for avbildning.
6. Kjøp av bilder ved hjelp μManager programvare
- Øk CSUX hastigheten til 2500 rpm for å forbedre bildekvaliteten i konfigurasjonsinnstillingene.
- Bruk Objective dropdown menyen for å velge 10X 0,5 NA eller 20X 0,75 NA Fluar linse objektiv.
- Velg laser 405 nm fra Color nedtrekksmenyen.
- Klikk på Live og justere fokus med mikroskopet.
- Klikk på Auto for å automatisk justere maksimum og minimum piksel intensiteter av visningen av bildet basert på de ekstreme pikselverdiene i bildet. Et histogram av skjermen bildets piksel intensiteter er presentert i grafen i den nedre delen av hovedvinduet.
- Justere kameraets eksponering i vinduet Piper kontrollpanelet vedendring av antall klokker (En klokke er 33.333 msek).
- Hvis signalet er for lyse med den laveste eksponeringen, redusere laserintensiteten ved hjelp av mikroskop styreenheten.
- Sjekk signalintensitet for 488 nm, 561 nm og 640 nm laserlinjer. Juster laserintensitet med laseren egen styreenhet (488 nm og 561 nm) eller mikroskopet styreenheten.
- I Multi D Acquisition vinduet, sjekke tidspunkter boksen og skriv inn antall tidspunkter og ønsket tidsintervall.
- Sjekk z-stabler boks, velg "relative Z" og definere Z-start og Z-end i forhold til den aktuelle posisjonen.
MERK: For 10X eller 20X objektiv, start med 3 Z fly, 8 mikrometer eller 4 mikrometer henholdsvis fra hverandre. - Sjekk flere posisjoner (XY) boksen for å avbilde flere steder, og klikk på Rediger posisjon listen, merk 4 til 6 forskjellige posisjoner.
- Sjekk Kanaler boksen og legge til kanaler fra New og velg lasere linjer fra nedtrekksmenyen og type i eksponering for hver kanal (i multipler av 33.333 msek).
- Sjekk Lagre bilder i "Multi D oppkjøpet" vinduet.
- Velg en mappe og alle bildene ervervet vil automatisk bli lagret i denne mappen med navnet prefiks gitt.
MERK: Hver kontinuerlig oppkjøp vil bli lagret i en egen undermappe som individuelle tiff-filer for hver Z skive i hver farge på hvert tidspunkt. - Lagre alle innstillingene ved å klikke på Lagre innstillinger i Multi D Acquisition vinduet.
- Klikk Acquire i Multi-dimensjonale Acquisition vinduet for å starte oppkjøpet.
- Hvis oksymeteret sonde ikke brukes eller slutter å fungere godt (når pulsen er ikke stabil eller vanskelig å oppdage), sjekk effektiviteten av anestesi hvert 15 min i løpet av bildebehandling prosedyren ved å klemme footpad og kontrollere hornhinnerefleksen. Juster anestesi hvis musen er lydhør overfor disse stimuli.
- Etter oppkjøpet avlive mus ved å øke isofluran concentrasjon til 5%. Når ingen pustebevegelser er synlig, fjerner musen fra scenen og utføre en halshugging.
7. Analyse av bilder ved hjelp Imaris programvare
- Konvertering til .ims Files (Tilleggs figur 1A)
- Åpne kameraprogramvaren, klikk på Fil og deretter Batch Converter.
- Klikk på Legg til filer og velg den første filen i første posisjon. Gjenta for hver posisjon.
- For hver fil lastet opp, klikk på Innstillinger og kontroller at innstillingene "T" for tiden, "c" for kanaler og "z" for Z-stabler vises i den rekkefølgen.
- Lagre i ønsket mappe. Bla gjennom og lage en ny fil som konverteres.
- Klikk på knappen Set for alle og Start.
- Justeringer (Supplementary Figur 1B)
- Gå inn i den spesifikke Omregnet mappen og åpne den første filen.
- I Visningsjusteringsvinduet, justere bakgrunnssignal cutoff ved å endre Minimum antall for hver kanal om nødvendig.
- Hvis det er nødvendig, justere signalintensiteten ved å endre Max nummer (jo lavere Max tall, desto høyere intensiteten av signalet).
MERK: Justering av signalintensitet / kontrast aktivere høydepunktet av en celle atferd eller en kupé for å få en bedre visualisering. Det endrer ikke resultatet i seg selv. - Klikk på Rediger og Bildeegenskaper.
- Endre x, y og z-verdier (for et 10X objektiv, x og y = 0,712, z = 8 mikrometer, for en 20X objektiv: x og y = 0,36, Z = 4 mikrometer).
- Klikk på All Equidistant å justere tidspunkter. Legg startdato og starttid av oppkjøpet. Legg sluttdato og sluttidspunkt for oppkjøpet (Supplerende figur 1C).
- Klikk på Play-knappen for å se filmen.
- Klikk på Rediger og Slett tidspunkter å slette uskarpe bilder.
- For å bli med to separate oppkjøp together inn én film, gå til forrige gang poenget med den første filmen, og klikk på Rediger> Legg til tidspunkter for å legge den andre filen.
- Lagring som en film (Supplementary figur 1D)
- Klikk på Record, velger MOV forlengelse og en komprimeringsfaktor på 0.
- Klikk på Lagre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved å bruke spinne disk konfokal mikroskopi, ikke-tumoral og tumorvevet i tynntarmen av APC Min / +; ACTB-ECFP, C-fms-ECFP mus kan bli visualisert fra serøse overflate. Etter bildebehandling, er kamera programvare som brukes til å analysere og justere oppkjøpet (Supplerende figur 1). Etter intravenøs (IV) injeksjon av fluorescerende 2000 kD dekstran-rhodamin og Ly-6G 647 konjugert antistoff, blodkar og PMNs kan detekteres henholdsvis (figur 1). Peyer patcher som er samlinger av lymfevev og full av myeloide celler kan sees lett (Figur 1A). De krypter i tynntarmen er omgitt av blodkar og myeloide celler (Figur 1A og 1B). Tumoral vev er ofte mer vaskularisert og mer infiltrert av myeloide celler, og strukturen av de krypter er mindre well organisert (figur 1A og 1B), avhengig av størrelsen av tumoren. Oppkjøp kan gjøres ved hjelp av en 10X 0,5 NA (figur 1A) og 20x 0,75 NA Fluar linser (figur 1B), men vi har fått den beste ytelsen med 10X 0,5 NA Fluar linse som var lyse, tillate oppkjøpet av en stor region (676 x 676 mm), og kan gi bilder fra opptil 70 mikrometer inn i vevet. Glatt muskulatur lag uttrykker aktin-ECFP kan noen ganger gjengi fokus på tarm epitel vanskelig (figur 1B, høyre panel). Myeloide celler dynamikk i svulster kan følges i sanntid for et par timer som vist i den animerte / Video Figur 2. Mens nøytrofile (GR1 + celler) sirkulerer i blodårene og patruljerer vev, andre myeloide celler, for det meste makrofager, surround krypter og er mindre bevegelige (Animated / Video figur 2).
Figur 1. Representative bilder oppnådd med spinnende disk confocal av ikke-tumor og tumorvevet fra APC min / + mus. (A) Fire-fargebilder (10X Fluar, 0,5 NA linse) av tynntarmen epithelium fra det serøse overflaten av APC Min / +; ACTB-ECFP; cfms-EGFP mus som mottok iv fluorescerende 2000 kD dekstran-rhodamin (rød) og en Ly-6G 647 konjugert antistoff (hvit). Det venstre panelet viser non-tumoral epitel og til høyre vises en svulst fra samme Apc Min / +; ACTB-ECFP; cfms-EGFP mus. Myeloide celler er grønne og epitelceller er blå. En klynge av c-FMS + celler er sett i den ikke-tumortarmvevet i en Peyer patch (hvit pil), skala bar = 100 mikrometer. (B) Fire-fargebilder (20X Fluar, 0.5 NAlinse) av tynntarmen epitel fra serøse overflaten av en APC Min / +; ACTB-ECFP; cfms-EGFP tumor. I venstre panel, flere dobbelt positive Gr1 + c-FMS + celler oppdages i tumorvevet. Panelet til høyre viser et bilde av den glatte muskulaturen lag uttrykker aktin-ECFP som kan gjengi fokus på tarm epitel vanskelig, skala bar = 50 mikrometer.
Animert / Video Figur 2 . myeloide celle dynamikk i en 3 mm adenom fra en APC Min / + mus fire farge time-lapse av tynntarmen epitel (10X Fluar, 0,5 NA objektiv) fra serøse overflaten. en Apc Min / + ; ACTB-ECFP; cfms-EGFP mus co-injisert med fluorescerende 2000 kDa dekstran-rodamin (rød) og en Ly-6G 647 konjugert antistoff (hvit). Myeloide celler er grønne ogepitelceller er blå. Myeloide celler rundt krypter er ikke i bevegelse. Noen nøytrofile (Gr1 + celler i hvitt) patruljerer i vev. Dette er en 2 timers oppkjøp og filmen har blitt sped opp 295 ganger.
Supplerende Figur 1 . Skjermbildene av kameraprogramvaren for oppkjøpsanalyse. (A) Først filene må konverteres til .ims forlengelse. (B) Deretter kan vise bilder justeres, for eksempel bestemte signaler kan økes og bakgrunn redusert . (C) Dato og klokkeslett må justeres for å få en real-time film. (D) Kjøpet kan lagres som en film.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikkelen er en detaljert protokoll beskrevet til spinning disk confocal avbildning av myeloide celle dynamikk i tarmsvulster i flere timer i et levende dyr, fotograferte på serøse side av tarmen.
For å unngå inflammasjon og å ha optimale fysiologiske betingelser, har avbildning av tarmen som skal gjøres på det intakte organ. Det er imidlertid tenkelig fra serøse siden av tarmen krevende, siden lyset må gå gjennom forskjellige vev lag slik som glattmuskel før de når epitel. Med fokus på Epitel kan være vanskelig i enkelte områder, spesielt i aktin-ECFP reporter mus siden aktin er sterkt uttrykt av glatte muskelceller. Selv om to-foton mikroskopi har fordelen av dypere vev penetrasjon i forhold til konfokale mikroskoper, fant vi at den roterende disk confocal mikroskop er kraftig nok til å få en god visualisering av tarmepitel struktur. Fordelene of roterende disk mikros omfatter kapasiteten for meget rask anskaffelse og unikt følsomhet uten å ofre konfokal oppløsning. Disse kvalitetene tillate observasjon av dynamiske prosesser selv om enkelte tidspunkter må slettes på grunn av bevegelse gjenstander, minimere photodamage, og aktiverer avbildning av relativt svakt fluorescerende molekyler.
Imaging tarmen fra serøse side kan også være utfordrende på grunn av de endogene peristaltiske bevegelser av dette organ. I denne protokollen, er en subkutan injeksjon av atropin gitt før avbildning, og det effektivt reduserer bevegelse. Det er imidlertid viktig å merke seg at peristaltiske bevegelse er mer omfattende i tykktarmen, men er ikke godt inhibert av atropin behandling, slik at avbildnings ganske vanskelig i denne del av tarmen. Den glatte muskel lag i tykktarmen er noe mer fremtredende c ompared til tynntarmen, og ser ut til å være mer kontraktile. Derfor er deter nesten umulig å fokusere på epitel i aktin-ECFP reporter mus. Videre, i tillegg til disse endogene bevegelser, kan drivende organ skje, men i dette tilfellet bakre driv korreksjon kan utføres ved hjelp av kamera-programvaren.
En annen stor utfordring i invasive bildebehandling eksperimenter er å holde musen i live og frisk så lenge som mulig under narkose. Tarmen er nådd ved å åpne bukhulen. Således er fremgangsmåten er mer omfattende enn det som brukes til mammary tumor avbildning, noe som kan gjøres i opp til 40 timer på grunn av integriteten av peritoneum. Den maksimale Kjøpet gjøres med bukhulen åpnet var 6 timer, men musa var fortsatt i live med ingen åpenbare tegn på stress, så enda lenger oppkjøpet kan være gjennomførbart.
I denne studien myeloid celle atferd kan følges og analysert i tarm svulsten ved hjelp av fluorescerende reporter mus og også fluorokromkonjugerte tsyklistene eller antistoffer. Denne tilnærmingen kan også brukes til å observere andre celletyper som tregs, dendrittiske celler eller fibroblaster ved hjelp foxp3-EGFP eller CD11c-DTR-EGFP, eller Fsp1-EGFP reporter mus henholdsvis, som det har blitt brukt i melke svulst studie 6 . Dessuten kan fluorescerende antistoffer mot andre celle-populasjoner enn neutrofiler bli injisert iv I tillegg kan celle oppførsel også bli analysert i forskjellige forhold, slik som hypoksi. Slike eksperimenter kan gi ny innsikt i virkemåten av disse Stroma-celler etter behandling med kjemoterapi eller målrettet terapi. Endelig kan denne protokollen brukes i andre musemodeller av tarmkreft og i forskjellige stadier av tumorprogresjon. APC min / + mus utvikler tarm adenomatøse polypper bare, som ikke utvikle seg til kreft, fordi musene har en forkortet levetid. Det vil være interessant å studere dynamikken i myeloide celler i andre tarmkreft modeller med mer aggressive og invasive svulster som mus bærer mutasjoner i K-ras 19-21 eller Smad4 22 gener i tillegg til APC mutasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Ying Yu for Apc Min / + mus genotyping. Denne studien ble støttet av midler fra INSERM og tilskudd (CA057621 og AI053194) fra National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ApcMin/+ mice | Jackson Laboratory | 2020 | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 3773 | |
| cfms-EGFP mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| 2,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated | Invitrogen | D7139 | |
| Isoflurane | Butler Animal Health Supply | 29450 | |
| Nitrogen | UCSF | ||
| Oxygen | UCSF | ||
| 1x PBS | UCSF cell culture facility | ||
| Saline Buffer | UCSF cell culture facility | ||
| Anti-mouse Ly-6G (GR1) antibody AF647 | UCSF Monoclonal antibody core | Stock 1 mg/ml. Use at 7 μg/mouse | |
| Atropine | LARC UCSF | Use at 1 mg/kg mouse | |
| Alcohol wipes | Becton Dickinson | 326895 | |
| 28 G x 1/2 in. insulin syringe | Becton Dickinson | 329465 | |
| Remium cover glass | Fisher Scientific | 12-548-5M | 24x50-1 |
| Betadine | LARC UCSF | ||
| Heat blanket | Gaymar Industries | ||
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn ON 30 min before use |
| Cotton tipped apllicators 6-inch | Electron Microscopy Sciences | 72310-10 | |
| Anesthesia system | Summit Anesthesia Support | ||
| Inverted microscope | Carl Zeiss Inc | Zeiss Axiovert 200M | |
| Stage insert | Applied Sientific Instrumentation | ||
| Mouse Ox oximeter, software and sensors | Starr Life Sciences | MouseOx | |
| Nebulizer | Summit Anesthesia Support | ||
| Imaris | Bitplane | ||
| μManager | Vale lab, UCSF | Open-source software | |
| ICCD camera | Stanford Photonics | XR-Mega-10EX S-30 | |
| Spinning disk confocal sacan-head | Yokogawa Corporation | CSU-10b |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Schouppe, E., De Baetselier, P., Van Ginderachter, J. A., Sarukhan, A. Instruction of myeloid cells by the tumor microenvironment: Open questions on the dynamics and plasticity of different tumor-associated myeloid cell populations. Oncoimmunology. 1 (7), 1135-1145 (2012).
- Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism. Dev Cell. 18 (6), 884-901 (2010).
- Lohela, M., Werb, Z. Intravital imaging of stromal cell dynamics in tumors. Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 72-78 (2010).
- Egeblad, M., et al. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis Model Mech. 1 (2-3), discussion 165 155-167 (2008).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Dynamic long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), pdb top97 (2011).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), pdb prot5563 (2011).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), pdb prot5562 (2011).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (73), e50088 (2013).
- Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
- Walther, A., et al. Genetic prognostic and predictive markers in colorectal cancer. Nat Rev Cancer. 9 (7), 489-499 (2009).
- Fearon, E. R.
- Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse. Science. 247 (4940), 322-324 (1990).
- Su, L. K., et al. Multiple intestinal neoplasia caused by a mutation in the murine homolog of the APC gene. Science. 256 (5057), 668-670 (1992).
- Watson, A. J., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).
- McDole, J. R., et al. Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine. Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).
- Xu, C., Shen, Y., Littman, D. R., Dustin, M. L., Velazquez, P. Visualization of mucosal homeostasis via single- and multiphoton intravital fluorescence microscopy. J Leukoc Biol. 92 (3), 413-419 (2012).
- Haigis, K. M., et al. Differential effects of oncogenic K-Ras and N-Ras on proliferation, differentiation and tumor progression in the colon. Nat Genet. 40 (5), 600-608 (2008).
- Sansom, O. J., et al. Loss of Apc allows phenotypic manifestation of the transforming properties of an endogenous K-ras oncogene in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (38), 14122-14127 (2006).
- Janssen, K. P., et al. APC and oncogenic KRAS are synergistic in enhancing Wnt signaling in intestinal tumor formation and progression. Gastroenterology. 131 (4), 1096-1109 (2006).
- Takaku, K., et al. Intestinal tumorigenesis in compound mutant mice of both Dpc4 (Smad4) and Apc genes. Cell. 92 (5), 645-656 (1998).
