Summary
在这里，我们描述了一种协议，它把两个蛋白质组学技术，即2维电泳（2DE）和质谱（MS）来识别差异表达/翻译后修饰的蛋白质中的两个或多个基团主样品。这种做法，再加上功能性实验，允许预后标志物/治疗靶点的鉴定和表征。
Abstract
参与肿瘤发生和发展的分子的鉴定是基本的理解疾病的生物学和，其结果是，对于患者的临床管理。在目前的工作中，我们将介绍对参与慢性淋巴细胞白血病（CLL）的进展分子识别的优化蛋白质组学的方法。具体而言，白血病细胞裂解液是由二维电泳（2DE）解决，如可视化的双向凝胶电泳凝胶“点”。蛋白质组图谱进行比较分析允许差异表达的蛋白质的鉴定（在数量和翻译后修饰而言），该被拾取，分离并鉴定的质谱（MS）。所识别的候选者的生物学功能可以通过不同的测定（ 即迁移，粘附和F-肌动蛋白聚合）进行测试，我们已经对原代白血病细胞中进行优化。
Introduction
慢性淋巴细胞白血病（CLL），在西方国家中最常见的成人白血病，来源于单克隆肿瘤CD5 + B淋巴细胞的积累和在临床上是非常不均匀的。它可以作为一个预白血病形式，定义为单克隆B细胞淋巴细胞增多（MBL）1,2,3。在其他情况下这种疾病可以出现任何与懒惰的临床过程，可以无需治疗前数年保持稳定，或作为一个渐进的chemorefractory疾病，预后极差，尽管治疗。最后，它可能会发展成一种经常致命的高恶性度淋巴瘤（里氏综合征-RS）2,3,4。患者通常被分为两个主要亚群：好的和坏的预后，根据一组预后因素，提供对疾病预后和生存预测因素的补充信息。临床异质性可能反映了生物异质性。许多基因，微环境和CEllular因素已被证明同意对疾病发病机理虽然没有统一的机制，已发现5。详细地说，一些研究已经表明，在疾病的临床过程的差别可以通过的具有预后价值6,7,8某些生物标记物的存在（或不存在）被部分地说明。这些数据表明，更好的了解该疾病的生物学可用于病理学的临床管理提供额外的提示，由两个预后标志物和治疗靶的鉴定。
本研究的目的是为了表明如何不同的蛋白质组技术的组合可用于参与CLL发作和进展的蛋白质的鉴定。我们的做法表明，它有可能联合起来基本蛋白质组学和临床资料5。
在本工作流程中，主从选择的患者的白血病细胞（良好与不良的预后）被分离和细胞裂解物，然后用于获得蛋白质的地图。 2DE允许的细胞群体，包括翻译后修饰的蛋白质分布图的特性，从而使每个蛋白的生物学活性的间接信息。全细胞裂解物通过基于等电点的第一维运行，随即通过上是基于其分子量解析蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶上运行的第二尺寸。蛋白质组图谱进行比较分析允许差异表达的蛋白质的识别（无论是在数量和翻译后修饰而言）作为凝胶上的斑点可被切割并通过质谱法进行分析。每名候选人的角色可以由不同的试验来再利用。
这种方法中，只限于CLL在当前的手稿，可以很容易地扩展到其他疾病/样品，从而提供关于proteomi信息C /两组之间的生物学差异（ 即病理性与正常，刺激比未受刺激，野生型与击倒）。
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Protocol
注：所有组织样品与圣拉斐尔医院（米兰，意大利）的机构审查委员会批准获得。
1，人体组织样本和细胞纯化（图1）
注：淋巴细胞白血病从CLL患者的外周血（PB）根据Mulligan 等人获得，确诊9。
1.1）从PB白血病细胞分离
- 与肝素钠真空采血管的血液收集管收集的PB。
- 传输血液入15ml离心管，以50微升/毫升的全血添加人B细胞富集鸡尾酒。搅拌均匀，保温20分钟，在室温下。
- 稀释样品用PBS +2％FBS等体积，轻轻混匀，小心叠加血在聚蔗糖，确保不突破的接口。使用至少1份聚蔗糖的2份稀释样品（ 即 4毫升聚蔗糖+10毫升血液在15ml吨UBE）。
- 离心机在400 XG，在室温（20℃）20分钟，用不加制动。单核细胞会在界面处。
- 小心吸出以回收细胞并将其放置到一个新的管的接口。一旦用PBS离心300 XG在黑暗中5分钟，洗涤细胞，4℃。沉淀会在底部。
- 弃上清。通过轻弹管来回用手指悬浮在剩余的上清液中沉淀。稀释，用10ml的完全RPMI培养基中的小球（RPMI 1640补充有10％胎牛血清和15毫克/毫升庆大霉素）和计数用台盼蓝排除法的细胞。
1.2）纯度评价
注：所有制剂纯度必须始终在99％以上。
- 孵育100微升纯化的细胞悬浮液与下列抗体（市售;见表材料）：CD3 FITC（5微升/ TES吨），CD14 PE（5微升/试验），CD19 ECD（6微升/试验），CD16-CD56 PC5（2微升/试验），CD5 PC7在（4微升/试验），进行20分钟，在4℃下流式细胞仪管。
- 洗用4ml的PBS（离心5分钟，在300 XG）的样品，并检查其纯度通过流式细胞cytometry.Check在剧情CLL细胞（> 99％），其共表达CD19和CD5在其表面上作为％在图1中示出（6）。确保准备工作几乎毫无NK细胞，T淋巴细胞和单核细胞在情节，这应该是接近零检测CD3 +，CD14和CD16-56的％。
1.3）样品储存
- 用于蛋白组学研究中，收集25×10 6个细胞在1.5ml管中，离心分离细胞，在300×g离心10分钟，弃去上清液并冷冻干燥的颗粒4小时。保持在-80℃直到使用。
- 进行验证试验，重悬细胞完全RPMI（数量取决于进一步的分析是选择），并继续进行步骤4。
2，双向电泳（2-DE）（图2）
2.1）等电聚焦电泳（IEF）
- 溶解CLL细胞颗粒用380微升2-DE缓冲液（344微升的RBthio解决方案的最终体积（9M尿素，10毫米的Tris，4％CHAPS），30微升65毫米的DTT，6微升2％IPG缓冲两性电解质pH为4-7）。
- 适用于蛋白质样品（1毫克），以18 IPG胶条（pH为4-7），并进行IEF以下标准协议如由帝等人 10
- 补充有新鲜的DTT 2％，在RT15分钟：（50含有6M尿素，30％甘油，2％SDS毫pH为8.8的Tris-HCl缓冲液EB）在2毫升平衡缓冲液中平衡的条。放弃EB + DTT和加入2ml的EB辅以2.5％碘乙酰胺。孵育在室温下15分钟的摇动平台上。
2.2），SDS-PAGE
- 干在纸条而不触及凝胶去除多余的EB。加载每个条上的9-16％梯度SDS-PAGE凝胶的顶部。加入小体积的SDS-电泳缓冲液（Tris 25mM的，甘氨酸192毫米，SDS 0.1％重量/体积）上的凝胶的顶部，以促进负载的钢带的。
- 加入〜加入5ml琼脂溶液（0.8％），以防止浮带的密封胶，然后组装的电泳单元和填充用SDS-电泳缓冲液中。在4℃下进行运行在60毫安/凝胶4小时。
- 从电泳装置中取出凝胶，并将其放置在适当的染色中。
2.3）银染色制备凝胶
| 定影液 | 50％甲醇12％乙酸 0,05％的福尔马林 | 2小时（或过夜）* |
| 洗涤缓冲液 | 35％Ehanol | 20分钟（重复步骤三次） |
| 增敏 | 0,02％硫代硫酸钠 | 2分钟 |
| 洗 | H 2 O的 | 5分钟（重复步骤三次） |
| 硝酸银 | 0,2％硝酸银0076％福尔马林 | 20分钟 |
| 洗 | H 2 O的 | 1分钟（重复此步骤二次） |
| 开发者 | 6％的碳酸钠0.0004％硫代硫酸钠 0,05％的福尔马林 | 直到染色充足 |
| 停止 | 50％甲醇 | 30分钟 |
| *需要2小时的最小时间为蛋白质固定 |
表1。
注：蛋白质斑点可以通过凝胶染色与MS兼容的银染11可视化。所有的解决方案所需为银染色列于表1。
- 制备约200毫升每一溶液/凝胶中，并按照表1中所示，小心地添加各溶液到含有凝胶的染色盒。完成摇摆的平台上所有的孵化。
- 染色后，取出一站式解决方案，并使凝胶1％醋酸溶液，直到采集。
2.4）凝胶采集与分析
- 使用内染色3天密度仪获得高分辨率的图像。
- 通过使用软件进行2-DE图谱分析2-D蛋白质模式。
注：该软件允许快速和可靠的图像比较。- 通过选择“创建新项目”从上下文菜单中创建一个项目。创建一个文件夹并选择“导入凝胶图像”与.TIF，巴纽导入凝胶。或.gel扩展。
- 一旦凝胶导入并添加到worksp王牌，通过在菜单中选择凝胶进行当场检测，并选择“编辑>现场>检测”执行自动当场检测。
- 其次，从菜单中选择“减法背景”选择执行背景减除。注意：在此之后就可以比较多个凝胶并检测通过定量和/或定性分析的差异或相似性。
3，蛋白质鉴定通过MALDI-TOF MS分析（图3）
3.1），蛋白质的消化
- 无论是手动（用干净的手术刀切割）或自动切除术用清水冲洗和消费点兴趣凝胶的凝胶。
- 与水（100-150微升）洗凝胶粒子，自旋向下（30秒400 XG）除去液体。
- 加入的CH 3 CN等体积（根据凝胶体积）的凝胶片，并等待10-15分钟，直至凝胶碎片收缩。干凝胶颗粒í呐真空离心机。
- 添加75-100微升10毫米二硫赤藓醇稀释在50毫米的NH 4 HCO 3孵育30分钟，56℃（还原步骤）。再次收缩的凝胶片，用CH 3 CN，如步骤3.1.3中描述。
- 通过加入溶液55 mM的碘乙酰胺稀释于50mM NH 4 HCO 3，孵育20分钟，在室温下在黑暗中的75-100微升进行烷基化。
- 使用足够量如步骤3.1.3中所述，以覆盖凝胶块，用CH 3 CN收缩一次的凝胶片。干式真空离心机。
- 在含25mM NH 4 HCO 3，5mM的氯化钙 ， 和12.5毫微克胰蛋白酶/微升，在4℃下进行20分钟的缓冲液再水合粒子。使用足够量的缓冲来覆盖凝胶块。从凝胶块中取出的未吸收的上清液，加入25 mM的NH 4 HCO 3，5毫米氯化钙2没有胰蛋白酶COV尔的凝胶。
- 离开样品在37℃下至少3小时（所需的肽消化的最短时间）至过夜。
3.2）质谱分析（干滴法）
- 每个样品到不锈钢MALDI板上的斑点1微升等份和混合用1μl的α-氰基-4 -羟基肉桂酸作为基质，在50％CH 3 CN，0.1％TFA的制备。
- 得到的质谱上的MALDI-TOF质谱仪。累积每点约200光谱，调节激光强度，以防止信号饱和或增加信号。通过数据浏览器软件过程的光谱如下所述：
- 导入dat档，并通过选择“程序>基线校正”进行基线校正。通过选择“程序>质量校正>手动校准校准用胰蛋白酶自溶的产品和基质峰群众;选择峰值接近M / Z 855.1和2163.1 bŸ左拖动并选择相应的参考群众，然后单击“绘图”，并在手动校准窗口“应用校准”。
- 调整阈值的峰值检测（“峰>峰值检测”），重复的活动轨迹（“显示器>复制活跃的踪迹”），选择新的跟踪和执行deisotoping（“峰> deisotoping”）。使用宏“getpeaklist”，产生群众用于识别列表。如果需要，手动删除采摘的高峰清洗名单，并获得更好的识别噪声信号。
- 通过搜索用深刻而吉祥物的搜索引擎12进行全面的非冗余蛋白质数据库鉴定蛋白质。
- 使用以下参数在所有的搜索：一遗漏每肽裂解，氧化蛋氨酸作为修饰的变量，半胱氨酸carbamidomethylation固定的修改和initi50ppm的人的质量偏差。
4，细胞骨架的活性测定（图4）
注：将细胞再悬浮于步骤1中的完全RPMI（10 6个细胞/ 200微升）进行纯化。
4.1）迁移实验。该测试可分析的细胞（淋巴细胞）的迁移能力的定量。使用6.5mm的直径和5.0微米的孔径的transwell小室并以一式三份进行测定。在不同类型的细胞的情况下优化孔径和迁移时间（步骤4.1.3）。
- 通过加入600微升的完全RPMI中具有或不具有特异性刺激（ 即 ，SDF-1）分别测量诱导的自发迁移准备下部腔室。
- 将上部腔室就可以了，并让系统平衡30分钟，在37℃培养箱中。
- 种子10 6细胞/200μl的在上部腔室（总细胞数），并培育在孵化器中的板4小时，在37℃。
- 除去上部腔室，收集在下部腔室中的介质，并用1ml的PBS洗涤下部腔室一次。收集的PBS中的管。
- 离心5分钟300 XG，丢弃在500μl的PBS上清，重悬。
- 通过流式细胞术，计数采集的1分钟后的迁移细胞的数目。在壳体的分离的细胞群，没有必要添加任何表面抗体。查中的双维散点图考虑到细胞的侧散射和可视化在1分钟内，这是用于计算的数目的事件数的细胞数。
- 计算迁移指数（MI）为：
4.2）附着力试验。此测定法允许测量所述细胞的粘附能力。一式三份进行检测。
- 预涂96 WELLS板（平底）用50μl/孔的任2％BSA-PBS（作为背景）或1微克ICAM-1的稀释于PBS中，过夜，在4℃。
- 用PBS洗涤平板两次，并通过添加2％BSA-PBS（100μl/孔）1小时，在37℃下阻断非特异性位点。
- 在完全RPMI同时悬浮细胞以5×10 6 / ml时，标记他们用1毫米CMFDA绿色电池跟踪器和孵化30分钟，在37℃。
- 加入1×10 6个细胞/孔的预包被的孔中弃去封闭液（步骤4.2.2）后，孵育1小时，在37℃下。
- 用酶标仪定量附着力（激发滤光片：485 nm，发射滤波器：535牛米）。在总输入（INPUT）进行第一次测量。
- 用2％BSA-PBS轻轻洗涤该板（200μl/孔），4倍（倍）。每个清洗步骤（粘附倍）后进行板的读数。
- 经过背景扣除每次测量，计算具体adhes离子（附着力）：
4.3）聚合试验。这是一个比色测定，量化的F-肌动蛋白聚合。一式三份进行检测。
- 重悬1×10 ^ 6个细胞于100μl预热的完全RPMI中，并添加特定的刺激（ 即 α-IgM的20微克/毫升）10分钟。
- 停止用400μl的4％多聚甲醛的反应和固定的细胞在室温下10分钟。
- 用PBS（离心机在300×g离心5分钟，4℃）洗涤3次。
- 弃去上清液并通透细胞，在冰上的PBS-甙0.2％（200微升），持续2分钟。
- 洗3次，用PBS-甙0.1％（离心机在100×g离心5分钟，4℃），弃于100μl的PBS-甙0.1％的上清，重悬。
- 为30分钟，在室温吨染色用鬼笔环肽-Alexafluor 488（3微克/毫升）emperature在黑暗中。
- 用PBS-0.1％皂苷洗3次。丢弃在300μL的PBS上清，重悬。
- 量化的F-肌动蛋白的流动量术，计算所述鬼笔环肽的平均荧光的强度（MFI）。为了产生基于荧光强度的直方图中的单个维度的情节所产生的数据进行分析时，MFI值显示在图形报告。
- 测量的F-肌动蛋白聚合（ΔF-肌动蛋白）为：
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Representative Results
我们分离的原代白血病B细胞形成CLL患者的PB和我们分析蛋白质组学地图。样品（n = 104），根据每个患者的（坏的预后与预后良好），并进行双向凝胶电泳凝胶的对比分析，临床特征主要在两个子集进行分组。
允许的分析鉴定斑两个子集之间的差异表达的（在存在/不存在或移凝胶上的术语，意味着改变翻译后修饰; N≈16）。我们切下选定斑点从2DE凝胶和被还原和烷基化，将蛋白用胰蛋白酶消化和肽中得到的上清液后点样到MALDI板上。光谱的MALDI-TOF旅行者德收购。由此产生的峰值名单提交给吉祥物深刻。在一定质量公差群众被分配到的肽序列在数据库中，然后再组装成一个蛋白，其被认为确定它是否能通过一定的概率评分（ 图3）。通过这个分析，我们鉴定出的蛋白质主要参与细胞骨架的活性和代谢过程（未发表数据）。
其中，我们专注于造血谱系细胞特异性蛋白1（HS1），其差是磷酸化与疾病的临床过程密切相关（ 图4）。特别是，我们发现，病人携带单点（N = 44，超磷酸化HS1）经历一个糟糕的临床疗效，同时患者2点（N = 60，低磷酸化HS1）有良好的预后13（ 图4 ）。该HS1蛋白的斑点的存在下，然后通过免疫印迹的2DE凝胶与针对HS1 13的单克隆抗体的验证。
因为已知的是HS1是参与细胞骨架重构14，我们在体外测定法来测试I进行F表示HS1磷酸化状态的差异可能会影响在这两个亚群白血病（好的与坏的预后）细胞骨架的活性。我们发现携带HS1的CLL细胞的一个点具有的迁移，粘附和肌动蛋白聚合方面受损细胞骨架的活性，相比于低磷酸化-HS1的样品，从而解释了不同的临床行为15（ 图5）。
图1：来自PB血液白血病细胞纯化来自CLL患者的工作流被转移到15毫升管（1），人类B细胞富集鸡尾酒被添加到样品（2），并温育20分钟。血液，然后用PBS稀释以1:1的比例：1和铺设在密度梯度（3）的顶部。随后的样品离心分离（4）允许多个升的形成艾尔斯：1）血浆，B）B淋巴细胞，C）聚蔗糖，D），红细胞和不需要的细胞。纯化的B淋巴细胞（B层）然后收集（5），洗净，细胞制备的纯度通过流式细胞仪（6）分析。 请点击这里查看该图的放大版本。
图2：二维超声心动图的工作流将沉淀物溶解在缓冲二维超声心动图（1）和IPG胶条进行第一维润（2 -等电聚焦电泳）加载。平衡后，条带被装在用于第二维运行（3-SDS-PAGE）的梯度聚丙烯酰胺凝胶的顶部。然后将凝胶染色以显现斑点/蛋白质（4）。高分辨率图像采集后，蛋白质组的地图进行了分析（5）。 LES / ftp_upload / 51942 / 51942fig2highres.jpg“目标=”_ blank将“>请点击这里查看该图的放大版本。
图3：MS分析的工作流程 （1）的兴趣斑点从2D-凝胶用解剖刀切下并转移到干净的管中。 （2）被还原和烷基化后，蛋白质用胰蛋白酶消化，肽中得到的上清液点样到MALDI板（3）。光谱的MALDI-TOF旅行者德收购。 （4）产生的峰值名单提交给吉祥物深厚的搜索引擎和搜索对一个全面的非冗余蛋白质数据库。 （5）在一定质量公差群众被分配给数据库中的肽序列，然后组装成一个蛋白。目标=“_ blank将”>请点击这里查看该图的放大版本。
图4：HS1磷酸化状态的关联与CLL患者的预后 （1）的圆圈标识分别为4.83和4.86的相同分子的79 kDa的质量（Mr）和不同的等电点（pI）两个亲密的斑点，其通过鉴定。 MS为HS1蛋白（2）。 （2）中的一个预后不良（红方）和一个不错的预后CLL患者（绿色方块）两个有代表性的凝胶。 （3）Kaplan-Meier曲线显示CLL患者根据HS1磷酸化的模式组合的累积生存率（1点，N = 44， 与 2点，N = 60）。例2点（绿点）有显著生存期较长（中位生存期没有达到），比那些只有一个（红点）。/files/ftp_upload/51942/51942fig4highres.jpg“目标=”_ blank将“>请点击这里查看该图的放大版本。
图5：CLL原样品中的HS1磷酸化状态的影响细胞骨架的功能 （1）迁移上的transwell中SDF-1的存在或不存在主样品。在图中显示的装置，在流式细胞仪（7 1每组点HS1 12 2点的安慰剂组n = HS1）流量在1分钟内获取的细胞的数目的扫描电镜。 （2）自发粘附细胞标记和在96孔板中孵育1小时后测得的。 （12的2点HS1 7 1 N =现货HS1 比 N =）显示的是扫描电镜方法对原始样品。 （3）F-肌动蛋白的聚合主样本的能力。显示的是相对的F-肌动蛋白续的方式扫描电镜（2点HS1 5 5 1的每组点HS1 安慰剂组n =）刺激与SDF-1和染色用FITC标记的鬼笔环肽后耳鼻喉科CLL细胞的。 MFI：平均荧光强度。柱状图代表为例样品采集。 请点击这里查看该图的放大版本。
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Discussion
该原稿的目的在于描述一个优化的协议中涉及白血病的发病机制中的分子的识别，即使这种方法可以扩展到其它的疾病和/或其他类型的样品16-18。通过比较2亚CLL患者，良好与不良预后19的蛋白质组曲线，我们表明，它们在HS1的磷酸化状态的不同，它的激活影响白血病细胞的迁移和粘附能力。
相对于其他方法，在手稿，2DE凝胶和MS给出的蛋白质组技术的主要优点是，它们所提供的细胞的蛋白质组的一个完整的指纹和最重要的是他们提供关于蛋白质的翻译后修饰的信息。蛋白质的磷酸化的差异或糖基化改变自己的位置，在凝胶，并有可能改变其活性细胞。
ove_content“>此外，我们所描述的协议为细胞的迁移和粘附的用于测试的细胞骨架功能的评价;这些协议还用于细胞悬浮生长说明不佳，因为它们通常被施加到贴壁细胞（ 如伤口愈合）。的2DE和MS技术的主要局限是细胞/蛋白质（每凝胶≈25×10 6细胞）的量，而对功能测定是在细胞的生存力。真正的挑战是工作在原代细胞的，但对于许多疾病是不可能达到的细胞或活细胞进行的实验的足够数量的，在这种情况下，如果有的话，也能够使用的细胞系。用于MS的协议中最关键的步骤是在干净的（角蛋白的分类）的条件下工作，以避免污染，并获得清晰的蛋白质鉴定。细胞骨架试验通常难以再现（特别是表面上的Ry的细胞），从而，建议进行试验，一式三份。
正如我们已经表明，该方法在这个手稿提出的组合有助于在参与不同疾病的新途径的鉴定，从而为新的治疗靶点的发现，因为我们已经证明了HS1蛋白19。
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Acknowledgments
我们感谢淋巴组织的恶性肿瘤单位，Elisa的10克勤，肥姐Scarfò，马西莫·阿莱西奥，安东尼奥·孔蒂，安吉拉八尺，和Angela郭居静。
该项目支持：ASSOCIAZIONE ITALIANA每拉Ricerca SUL巨蟹座AIRC（调查员补助金和特别节目分子肿瘤学 - 5千分数＃9965）
CS和BA设计的研究，进行了实验，分析数据和撰写文章。 MTSB，UR，FBPR协助撰写稿件。 PG和FCC的设计提供了研究患者的标本和临床资料。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitril | MERCK | 61830025001730 | |
| Ammonium Bicarbonate | SIGMA | A6141-500G | |
| 1,4-Dithioerythritol | SIGMA | D9680-5G | |
| Iodoacetamide | SIGMA | I6125-25G | |
| Calcium chloride dihydrate | SIGMA | 223506-25G | |
| Trypsin, Sequencing Grade | ROCHE | 11418475001 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | SIGMA | C2020-10G | |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA | T6580 | |
| ZipTipµ-C18 | MILLIPORE | ZTC18M096 | |
| RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL | 15064 | |
| PBS | EUROCLONE | ECB4004L | |
| FBS | DOMINIQUE DUTSCHER | S1810 | |
| Lymphoprep | SENTINEL DIAGNOSTICS | 1114547 | |
| Trypan Blue | SIGMA | T8154 | |
| CD19 | BECKMAN COULTER | 082A07770 | ECD |
| CD5 | BECKMAN COULTER | 082A07754 | PC5 |
| CD3 | BECKMAN COULTER | 082A07746 | FITC |
| CD14 | BD | 345785 | PE |
| CD16 | BECKMAN COULTER | 082A07767 | PC5 |
| CD56 | BECKMAN COULTER | 082A07789 | PC5 |
| Ettan IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit | GE-Healthcare | 11-0033-64 | |
| Urea | SIGMA | U6504 | |
| Tris-Hcl Buffer | BIO-RAD | 161-0799 | |
| CHAPS | SIGMA | C2020-10G | |
| DTT | SIGMA | D9163-5G | |
| IPGstrips | GE-Healthcare | 17-1233-01 | Linear pH 4-7 18cm |
| IPGbuffer | GE-Healthcare | 17-6000-86 | pH 4-7 |
| Glycerol | SIGMA | G6279 | |
| PROTEAN II XL Cell | BIO-RAD | 165-3188 | |
| SDS | INVITROGEN | NP0001 | |
| Acrilamide | BIO-RAD | 161-0156 | |
| Agarosio | INVITROGEN | 16500 | |
| Methanol | SIGMA | 32213 | |
| Acetic Acid | VWR | 631000 | |
| Formalin | BIO-OPTICAL | 05-K01009 | |
| Ethanol | VWR | 9832500 | |
| Sodium Thiosulfate | FLUKA | 72049 | |
| Silver Nitrate | FLUKA | 85228 | |
| Molecular Dynamics Personal SI Laser Densitometer | Amersham Biosciences | ||
| ImageMaster 2D Platinum 5.0 | Amersham Biosciences | ||
| Sodium Carbonate | MERCK | A0250292 | |
| MALDI-TOF Voyager-DE STR | Applied Biosystems | ||
| Data Explorer software (version 3.2) | Applied Biosystems | ||
| transwell chambre 6.6 mm diameter | CORNING | 3421 | |
| RPMI | EUROCLONE | ECB2000L | WITH L-GLUTAMINE |
| Gentamicin | SIGMA | G1397 | |
| SDF-1 | PREPROTECH | 300-28A | |
| Flat-bottom 96-well plate | BECTON DICKINSON | 353072 | |
| BSA | SANTA CRUZ | 9048-46-8 | |
| ICAM-1 | R&D Systems | 720-IC | |
| CMFDA | Life Thechnology | C7025 | Green |
| IgM | SOUTHERNBIOTECH | 2020-02 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA | P6148 | |
| Saponine | SIGMA | S-7900 | |
| Phalloidin | Life Thechnology | A12379 | Alexa fluor 488 |
References
- Caligaris-Cappio, F., Ghia, P. Novel insights in chronic lymphocytic leukemia: are we getting closer to understanding the pathogenesis of the disease. J Clin Oncol. 26, 4497-4503 (2008).
- Rawstron, A. C., et al. Monoclonal B-cell lymphocytosis and chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med. 359, 575-583 (2008).
- Dagklis, A., Fazi, C., Scarfo, L., Apollonio, B., Ghia, P. Monoclonal B lymphocytosis in the general population. Leuk Lymphoma. 50, 490-492 (2009).
- Fazi, C., et al. General population low-count CLL-like MBL persists over time without clinical progression, although carrying the same cytogenetic abnormalities of CLL. Blood. 118, 6618-6625 (2011).
- Caligaris-Cappio, F., Bertilaccio, M. T., Scielzo, C. How the microenvironment wires the natural history of chronic lymphocytic leukemia. Seminars in cancer biology. , (2013).
- Damle, R. N., et al. Ig V gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 94, 1840-1847 (1999).
- Lanham, S., et al. Differential signaling via surface IgM is associated with VH gene mutational status and CD38 expression in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 101, 1087-1093 (2003).
- Wiestner, A., et al. ZAP-70 expression identifies a chronic lymphocytic leukemia subtype with unmutated immunoglobulin genes, inferior clinical outcome, and distinct gene expression profile. Blood. 101, 4944-4951 (2003).
- Mulligan, C. S., Thomas, M. E., Mulligan, S. P. Lymphocytes, B lymphocytes, and clonal CLL cells: observations on the impact of the new diagnostic criteria in the 2008 Guidelines for Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL). Blood. 113, 6496-6497 (2009).
- Conti, A., et al. Proteome study of human cerebrospinal fluid following traumatic brain injury indicates fibrin(ogen) degradation products as trauma-associated markers. J Neurotrauma. 21, 854-863 (2004).
- Mortz, E., Krogh, T. N., Vorum, H., Gorg, A. Improved silver staining protocols for high sensitivity protein identification using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight analysis. Proteomics. 1, 1359-1363 (2001).
- Zhang, W., Chait, B. T. ProFound: an expert system for protein identification using mass spectrometric peptide mapping information. Anal Chem. 72, 2482-2489 (2000).
- Scielzo, C., et al. HS1 protein is differentially expressed in chronic lymphocytic leukemia patient subsets with good or poor prognoses. J Clin Invest. 115, 1644-1650 (2005).
- Muzio, M., et al. HS1 complexes with cytoskeleton adapters in normal and malignant chronic lymphocytic leukemia B cells. Leukemia. 21 (9), 2067-2070 (2007).
- Scielzo, C., et al. HS1 has a central role in the trafficking and homing of leukemic B cells. Blood. 116, 3537-3546 (2010).
- Kashuba, E., et al. Proteomic analysis of B-cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukaemia reveals a possible role for kininogen. J Proteomics. 91, 478-485 (2013).
- Dhamoon, A. S., Kohn, E. C., Azad, N. S. The ongoing evolution of proteomics in malignancy. Drug Discov Today. 12, 700-708 (2007).
- Ummanni, R., et al. Identification of clinically relevant protein targets in prostate cancer with 2D-DIGE coupled mass spectrometry and systems biology network platform. PLoS One. 6, (2011).
