Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

העברה יעילה ג'ין בצ'יק הרשתיות לסלולריים יסודי לימודי תרבות: Published: November 2, 2015 doi: 10.3791/52002
Automatic Translation
1, 1, 1
1Wilmer Eye Institute, The Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

תרביות תאים עובריים חומוס רשתית מהוות כלים חשובים למחקר של ביולוגיה קולטי האור. פיתחנו טכניקת העברה יעילה של גנים המבוססת על לשעבר אוב electroporation פלסמיד של הרשתית לפני התרבות. טכניקה זו במידה ניכרת מגבירה את יעילות transfection על פרוטוקולים זמינים כרגע, מה שהופך את המניפולציה גנטית אפשרית למערכת זו.

Abstract

התרבויות מועשרות קולטי האור קונוס נגזרות מרשתית חומוס עוברית הפכו לכלי הכרחי עבור חוקרים ברחבי העולם לומדים את הביולוגיה של תאי עצב ברשתית, במיוחד קולטני אור. היישומים של מערכת זו ללכת מעבר למחקר בסיסי, כפי שהם יכולים בקלות להיות מותאמים לטכנולוגיות תפוקה גבוהות לפיתוח תרופות. עם זאת, מניפולציה גנטית של קולטני האור ברשתית בתרבויות אלה הוכיחה להיות מאוד מאתגרים, שהתחזה הגבלה חשובה התועלת של המערכת. פיתחנו לאחרונה ומאומתים לשעבר אוב טכניקת electroporation פלסמיד שמגבירה את קצב transfection של תאי רשתית בתרבויות אלה על ידי פי חמש בהשוואה לפרוטוקולים זמינים כעת אחרים 1. בשיטה זו enucleated עיני חומוס עוברי בשלב 27, הרשתית מוסרת, וכוס הרשתית ממוקמת בפתרון המכיל פלסמיד וElectroporated באמצעות מנהג נבנה בקלותאלקטרודות עשויות. אז הרשתית הם ניתקו ותרבותיים באמצעות נהלים סטנדרטיים. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על מחקרי ביטוי יתר כמו גם לdownregulation של ביטוי גנים, למשל באמצעות השימוש בטכנולוגית RNAi מונע פלסמיד, בדרך כלל השגת ביטוי transgene ב -25% מאוכלוסיית קולטי האור. הווידאו בפורמט של הפרסום הנוכחי יהפוך את הטכנולוגיה הזו בקלות נגישה לחוקרים בתחום, המאפשר חקר תפקוד גן בתרבויות רשתית עיקריות. גם יש לנו כלל הסברים מפורטים של השלבים הקריטיים של הליך זה לתוצאה ושחזור מוצלח.

Introduction

תרביות תאים ניתקות מרשתית חומוס העוברית היו בשימוש נרחב ללמוד היבטים שונים של ביולוגיה של תא קולטי האור, כולל ההישרדות שלהם 2-9, בידול 10-12, תולדת neurite 13, ועוד. היתרונות של מערכת זו, שפותחו בשנת 1980 על ידי ראובן אדלר ומשתפי פעולה ושוכללו על ידי הקבוצות האחרות שלו ו14-20, מתגוררים במאפיינים הפנימיים של החומוס כמודל חיה 21. הגודל הגדול של העין החומוס, אפילו בשלבים עובריים, מספק כמויות גדולות של חומר לתרבויות. יתר על כן, כאשר תרבויות מבוצעות באמצעות יום עוברי (ED) 5 - 6 רשתית, 55 - 80% מהתאים שלהם להבחין בקולטני אור 14,15,18,22,23, ומאז כ 86% מהקולטניים האור בבעלי חיים זה הם קונוסים 24, תרבויות אלה מתאימים במיוחד למחקרים המתמקדים בסוג תא זה.

יש לנו לאחרונה developed ומתאפיין בטכניקה פשוטה שמאפשרת לtransfection פלסמיד יעילות גבוהה של התאים בתרבויות אלה, ובכך להרחיב את השימושיות של מערכת זו על ידי הקלת מחקרים הגנטי missexpression 1. הפיתוח של טכניקה זו נבע מחלל בשיטות שיספקו רמה מקובלת של transfection כדי לאפשר לחקר תפקוד הגן באופן אוטונומי תא הספרות המדעית. זה בין שאר משום שתרבויות עצביות עיקריות הן ידוע לשמצה קשה transfect 25,26. כמה הטכניקות הנפוצות ביותר הזמינות בעבר למטרה זו כללו שיטות כימיות transfection כגון transfection תיווך פוספט lipofection או סידן, אשר תוצאת היעילות בצו של 3-5% ויכולים להפעיל רעילות ניכרת 27-32. למרות שהשימוש בפלסמידים עם מערכת כתב האנזימטית יכולים לעקוף את הבעיה של יעילות transfection עניה על ידי הגברת האות, הם לאלהפלות השפעות תא ספציפי, והתוצאות שלהם מבוססות על אוכלוסיית תאים קטנה שלא יכול להיות נציג של כל. שיטה נפוצה נוספת בחומוס, זיהום בנגיף RCAS, חל רק על תאים מתרבים ולכן לא מתאימה למערכת זו עיקרי רשתית התרבות 33.

בפרוטוקול הנוכחי enucleated עיני חומוס עוברי בשלב 27 (ED 5), האפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) הוסר, וכוס הרשתית ממוקמת בתא electroporation המלא עם פתרון המכיל פלסמיד וelectroporated באמצעות מחוייט אלקטרודות, ואחרי ניתוק רשתית ותרבות תוך שימוש בטכניקות סטנדרטית 21. לאחר אופטימיזציה הליך זה הצלחנו להשיג יעילות transfection באופן עקבי על מנת של 22% מהמספר הכולל של תאים בתרבית ו -25% בקרב אוכלוסיית קולטי האור לבד, מבלי להתפשר על מאפייני הישרדות ובידול שלתרבויות 1. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט המתאר את כל השלבים החשובים של הליך זה על מנת להבטיח את הצלחת ושחזור של טכניקה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הנהלים שתוארו בעבודה זו בוצעו על פי ההנחיות המומלצת על ידי הטיפול בבעלי החיים ושימוש הוועדה באוניברסיטת ג'ונס הופקינס.

1. לפני זמן: הכנת מכשירים, ריאגנטים ומנות

  1. הכנת הביצים: ביצי דגירה עוף הלבן ליבורנו מופרה ב37.5 מעלות צלזיוס ו -60% לחות יחסית במשך 5 ימים בחממת ביצה.
    הערה: חממה עם הנדנדה קיבולת עשויה להיות מועיל לתקנון וסנכרון התפתחות עוברית, אבל הנדנדה היא לא הכרחי לתוצאה של פרוטוקול זה.
  2. פלסמיד הכנה:
    1. פלסמיד העיצוב לבנות לביטוי יתר של גן או downregulation (למשל באמצעות השימוש בטכנולוגית RNAi 1,34) לפי צורך. כולל גן כתב (כגון EGFP, RFP או LacZ) במבנה בכל הזדמנות אפשרית.
      הערה: חלק יזמים נפוצים כגון CMV, יכולים להיות מושתקים לאחר הזמן. Promot CAGאה (בטא-אקטין עוף עם אמרגן משפר CMV) הוא אלטרנטיבה טובה מאוד, מתן ביטוי לטווח ארוך יעיל של הגן של העניין 35-37.
    2. הכן פתרון פלסמיד בריכוז של 1.5 מיקרוגרם / μl בPBS סטרילי. אופציונאלי: הכן פתרון פלסמיד מראש ולאחסן אותו קפוא עד מוכן לשימוש.
      הערה: ריכוזים גבוהות פלסמיד לא לגרום לעלייה משמעותית ביעילות, ואילו שימוש בריכוזים נמוכים פלסמיד להוריד את יעילות transfection 1.
  3. אלקטרודות:
    1. לשימוש האנודה זהב עבה הטה אלקטרודה (ראה טבלה של חומרים / ציוד ספציפי). נקה עם אתנול 70%.
      הערה: בידוד של הזהב הטה אלקטרודה, עוזב כ 0.5 מ"מ החשוף, מומלץ למזעור זליגה של הזרם החשמלי. ניתן למצוא מידע על חומר בידוד בטבלה של חומרים ספציפיים.
    2. הפוך קתודה מב מרובע 2.5 מ"מנימה שור, רחבה 4.5 מ"מ (משמשת בדרך כלל במושכי micropipette). בעזרת מלקחיים, לבטל את התיבה מרובעת וליישר נימה לתוך רצועה ארוכה. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ לנתיחה ובאמצעות סרגל כמדריך, לכופף את החוט לצורת ריבוע 'U' ארוכה 3 מ"מ בבסיס ו -2 מ"מ גבוה בצד אחד, עם צד האורך הנותר של חוט הלהט (איור 1 האחר , C - D). בעזרת מלקחיים, לטבול את האלקטרודה ב 96% אתנול ולהבה לעקר. לאחר מכן לצרף את יתרון חשמלי עם קליפ תנין קטן לזרוע הארוכה של האלקטרודה.
  4. התקנת Electroporation הלשכה:
    1. להכין את חדר electroporation על ידי חיתוך את המכסה של צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר סטרילי והדביק אותו בצד, שטוח למטה, לקלטת באמצעות 100 מ"מ צלחת פטרי (איור 1E).
      הערה: מיכל אחר בצורה של גם של גודל דומה יעבוד; עם זאת, מכסה צינור microcentrifuge נגיש בקלות וautoclavable. הבארחייב להיות גדול מספיק כדי לאכלס אלקטרודה העין חומוס והקתודה, אבל לא כל כך גדול כמו לגרום לבזבוז של פתרון פלסמיד.

2. אקס אוב Electroporation נוהל

  1. הכנה של מכשירים:
    1. לעקר כלים מיקרו לנתיחה (2 זוגות מלקחיים מעוקלים מולוני הגדולים לפתיחת קליפות ביצים וגורפים את עוברים, 2 זוגות עדין קצה המעוקל פינצטה דומון להסרת הרשתית, זוג אחד של בון שיניים מלקחיים לעדשת הסרת וזגוגית) על ידי הטבילה טיפים ב 96% אתנול ולוהט. היקף נתיחה נקי באמצעות מגבונים טבולים באתנול 70%. לחמם בקבוק של תמיסת מלח מאוזנת של האנק סידן-מגנזיום ללא סטרילי (CMF-HBSS) באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. מלא 100 מ"מ צלחות פטרי סטרילית ל3/4 מלא עם CMF-HBSS החם.
    2. הנח תא electroporation תחת מיקרוסקופ לנתיחה אחר נקי ומלא עם 120 μl של פתרון פלסמיד. חבר אלקטרודות למנגנון electroporation, מה שהופך אתאלקטרודה מחוייט בטוחה מחוברת לקוטב השלילי וזהב הטה אלקטרודה לקוטב החיובי.
  2. אוסף עובר:
    1. נקה את הביצים על ידי מנגב פגזים עם מגבונים הרטוב באתנול 70%. לשמור על הליך סטרילי בכל שאר הפרוטוקול להתחמק מביצוע זיהום לתרבויות. בעזרת מלקחיים מעוקלים מולוני גדולים לפתוח בזהירות חור בקליפת הביצה בעדינות על ידי הקשה על הקצה המעוגל של ביצה (מעל תא האוויר) ולאחר מכן מרתק ומושכים את חתיכות קליפה.
    2. עם עוד זוג מלקחיים להסיר קרומים ולאסוף עובר על ידי גורף מתוך הביצה זה (נזהר שלא לפגוע בעובר). מניחים אותו בצלחת עם CMF-HBSS.
      הערה: איסוף עובר לפי צורך כדי לקבל את המספר הרצוי של כוסות רשתית לelectroporation כמפורט ב2.4.4
    3. שלב קריטי: שלב העוברים על פי המבורגר והמילטון 38.
      הערה: לקבלת עוברי יעילות אופטימליותחייב להיות בשלב 27 (איור 2 א).
    4. להרדים את העוברים על ידי עריפת ראש באמצעות מלקחיים מולוני.
  3. קבלת כוסות רשתית:
    1. באמצעות פינצטה דומון בסדר, enucleate בזהירות את העיניים ולהעביר לצלחת CMF-HBSS חדש.
    2. החל מהחלק האחורי של כל עין, קרובה לראש עצב הראייה, ובאמצעות שתי פינצטה דומון בסדר, להציג קצה אחד של כל פינצטה בין הרשתית העצבית ורשתית ובזהירות לנתח את הרשתית להיות זהירה כדי לא לגרום נזק לעצבים רשתית (איור 2).
      הערה: חוסר Ca 2 + וMg 2 + בפתרון יעזור לי הרשתית להתנתק מהרשתית העצבית בקלות רבה יותר.
  4. Electroporation:
    1. הגדרת הפרמטרים של electroporator לספק 5 פולסים מרובעים של 15 וולט, 50 משך msec, ומרווח 950 אלפיות שני. מקום 'U' בצורת האלקטרודה שלילית בתוך תא electroporation (מילוי המכסה microcentrifugeאד עם 120 μl של פתרון המכיל פלסמיד).
    2. פינצטה דומון המעוקל באמצעות העברת כוס רשתית אחד לתא electroporation (על ידי גורף, לא לחיצה), ולמקם אותו בתוך האלקטרודה בצורה 'U', עם החלק האחורי של הרשתית לכיוון החלק התחתון של האלקטרודה ואת העדשה כלפי מעלה ( איור 2).
    3. מניחים את האנודה, כך שהוא נוגע בחלק הקדמי של העין, בסמוך לעדשה, ובאמצעות דוושת הרגל של electroporator לספק פולסים חשמליים.
    4. העבר את כוס רשתית electroporated לצלחת פטרי חדשה עם CMF-HBSS וחזור על הליך electroporation עם כל אחד מכוסות הרשתית שנותרו.
      הערה: עד 6 כוסות רשתית ניתן electroporated עם אותו פתרון פלסמיד ללא ירידה משמעותית ביעילות transfection.
    5. הסר את העדשה וגוף הזגוגי של כל כוס רשתית electroporated על ידי אחיזתם עם מלקחיים שיני בון ומשייכתו בעדינות באמצעות tהוא תלמיד פתיחה תוך החזקת עין במקום בגב פינצטה דומון המעוקל.
    6. המשך לניתוק והתרבות של התאים ברשתית electroporated הבאים נהלים סטנדרטיים.
      הערה: לפרוטוקול מפורט על הניתוק והתרבות של תאים ברשתית חומוס מתייחס לVergara וקנטו-סולר, 2012, קובץ נוסף 4 21 בפרוטוקול זה התאים הם זורעים בצפיפות נמוכה על 6 צלחות היטב מצופה polyornithine או 35. מנות -mm (6 x 10 5 תאים / 35 מ"מ בקוטר טוב או צלחת). הבינוני משמש הוא בינוני 199 עם פניצילין / גלוטמין, 10% בסרום עגל עוברי (FCS), והחומצה לינולאית-BSA ב 100 מיקרוגרם / מיליליטר. התרבויות נשמרות בחממה 37 ° C humidified עם 5% CO 2. באמצעות הליך זה, 5 - יכול בדרך כלל לקבל 6 x 10 6 תאים לכל עין electroporated שלב 27.
      הערה: באופן אידיאלי, לא יותר מ 3 שעות צריכה לעבור בין אוסף עובר וציפוי תא, כדי להבטיח את הישרדות תא טובהולמזער את המתח. תזמון אופייני להתבוננות וניתוח נוסף הוא אחרי 4 ימים בתרבות, מאחר שבשלב זה התאים השיגו בידול מורפולוגיים ומולקולרי טוב וההישרדות היא עדיין גבוהה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כאן אנו מציגים פרוטוקול פשוט לtransfection פלסמיד לכוסות רשתית חומוס enucleated לתרבית תאים ניתק שלאחר מכן. Transfection מושגת על ידי שימוש בelectroporation קל לעשות אלקטרודות מותאמות אישית (איורים 1 - 2). הפרמטרים שתוארו בפרוטוקול זה כבר מותאם להשגת יעילות transfection שנע בין 20 ל 27% (עם ממוצע של 22%) (איור 3D). שימו לב כי, לטעמים האמורים לעיל, תוצאות אלה לכמת אחרי 4 ימים בתרבות. בהקשר זה, יעילות transfection מתייחסת לאחוז התאים המבטאים את הגן בתוך כלל אוכלוסיית התא. אם רק אוכלוסיית קולטי האור נחשבת, יעיל transfection להגדיל לממוצע של 25% (איור 3D). זוהי תכונה חשובה מאז סוגים אלה של תרבויות משמשים בעיקר ללמוד קולטני אור.

תרביות תאים שכבר electroporat אד שימוש בטכניקה זו הוא שאין להבחין בין העמיתים-electroporated שאינם שלהם במורפולוגיה שלהם תחת תאורת DIC, מאפייני הישרדות תא, וביטוי של סמנים מולקולריים כגון visinin (סמן בשימוש נרחב של קולטני אור) וPax6 1.

איור 1
איור 1. ביצוע של אלקטרודות. (- D) הקתודה עשויה מחוט להט תיבה מרובעת (), שיישר ראשון (ב ') ולאחר מכן עם מלקחיים כפופים לצורה' U 'רבועה (C - D). האנודה היא זהב עבה הטה אלקטרודה (ד); שים לב לבידוד סביב האלקטרודה האנודה, ומשאיר רק 0.5 מ"מ של הקצה חשוף. ההתקנה (E) Electroporation. הבלעה מראה הגדלה גבוהה יותר של אזור בארגזים.PG "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. הכנת כוסות רשתית לElectroporation. כוס הרשתית בצד הימין עובר אפרוח () בהמבורגר והמילטון שלב עוברי 27. (ב) הרשתית היא הסיר בזהירות מעיני enucleated באמצעות פינצטה דומון החדה. (ג) היא נטול הרשתית ומוכנה לelectroporation. (D ) אלקטרודה הקתודה ממוקמת בתוך תא electroporation עשוי ממכסת צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר מלא פתרון פלסמיד. כוס הרשתית מועברת בזהירות לקתודה תפנה כלפי מעלה, ואת האלקטרודה האנודה ממוקמת על גבי, בסמוך לעדשה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותרשל נתון זה.

איור 3
יעיל איור 3. ביטוי transgene בתאים בתרבית לאחר electroporation (- C). כוסות רשתית היו electroporated עם פלסמיד הביטוי של GFP, ניתקו ותרבותי במשך 4 ימים. micrographs הקרינה להראות גרעיני DAPI מוכתמים () ותאי GFP להביע רשתית (ב '). מכתים נוגדן Anti-Visinin בוצע לזהות תאי קולטי האור (C). (ד) גרף הממחיש את יעילות transfection מושגת על ידי לשעבר אוב electroporation, מיוצגת כאחוז של ה- GFP לבטא בתאים בקרב אוכלוסיית התא הכוללת (DAPI החיובי), או בין קולטי האור אוכלוסייה בפרט (Visinin חיובית). תוצאות מייצגות את הממוצע ± SEM של 5 ניסויים בלתי תלויים. בר סולם ב (- C). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השלב הקריטי ביותר להצלחה של פרוטוקול זה הוא בחירת השלב המתאים של העוברים. בפרסומים קודמים, מגוון של שלבים עובריים ניתן לתרבויות אלה, מוגדרים בדרך כלל על ידי הימים של ימי דגירה או עוברי (ED); כך זה בדרך כלל להניח כי השימוש בED 5 לED 6 עוברים יניבו תוצאות שווה ערך. עם זאת מצאנו כי בשלב 27 (ED 5), יעילות transfection תהיה סביב 22% מכלל אוכלוסיית התא, כאמור לעיל; עדיין יעילות תקטן ל -16% אם באמצעות שלב 28 עוברים (ED 5.5), ועד 12% בשלב 29 (ED 6) 1. שלבים קריטיים אחרים כוללים שמירה על תנאים סטריליים לאורך כל התהליך; רכישת המיומנות הידנית הנחוצה כדי למנוע נזק לרשתית במהלך הנתיחה וelectroporation; והימנעות פערים ארוכים מהזמן של אוסף עובר לזמן של ציפוי תא.

שיקול חשוב נוסף כדי להבטיח efficien transfection טובCies הוא הריכוז של הפתרון המכיל פלסמיד: 1.5 מיקרוגרם / μl המומלץ הוא הריכוז הנמוך ביותר שבדקנו שלא לגרום לירידה ביעילות. ריכוז זה מתורגם לכמות גבוהה של חומר פלסמיד כאשר בהתחשב בכך שכוסות הרשתית שטופים בפתרון זה. שימוש גם בגודל הקטן ביותר שיהיה להתאים את העין (כגון מכסה צינור microcentrifuge) יכול למזער את הבעיה הזו. בנוסף, ניתן electroporated כמה עיניים באמצעות אותו הפתרון; שלא ראה ירידה ביעילות כאשר electroporating עד 6 כוסות רשתית ברציפות באותו הפתרון פלסמיד, ויותר אולי יכול להתבצע אך אנו לא יכולים להעיד על ההבדל ביעילות לאחר מכן.

פרוטוקולים שפורסמו בעבר בדרך כלל סיפקו יעילות נמוכה של העברת גנים לסוג זה של תרבות, ולכן הם לעתים קרובות נאלצו להסתמך על טכניקות המודדות את המוצר של תגובות אנזימטיות בl תאysate כדי להגביר את הרגישות. יש גישה כזו החסרון של לא מאפשר לאפליית תאים מהסוג ולהסתמך על מספר נמוך של תאים להיות אחראי לתוצאות שנצפו, שלא תמיד משקפים את ההתנהגות של אוכלוסיית תאים הגדולה יותר. דרך נוספת לעקוף את הבעיה של יעילות נמוכה היא לבצע transfection גנים in vivo, לפני enucleation עין והתרבות. זוהי גישה בת-קיימא, אבל זה בדרך כלל יכול להיות מיושם רק לפרדיגמות ניסוי ספציפיות, שכן הן electroporation פלסמיד וזיהום RCAS וירוס (וקטור התמרה גן נפוץ בחומוס) בדרך כלל צריכה להתבצע בשלבי התפתחות מוקדמים, יצירת פער זמן בין transfection ותרבות. זהו שיקול חשוב, כי במהלך שחולף זמן התאים נחשפים להשפעות של שני מייקרו-הסביבה תאית, כמו גם גורמים תאיים, יש השלכות משמעותיות בפרשנות של Expתוצאות erimental. לעומת זאת, העלייה המשמעותית ביעילות העברת גנים הושגה עם לשעבר אובו גישת electroporation מאפשרת לחקר תפקוד הגן באופן תא פנימי. יתר על כן, היתרון של שיעור transfection גבוה זה יכול להיות מוגבר נוסף הפועל בשיתוף עם ניתוח תא תפוקה גבוהה אוטומטית 1.

בשלבים הראשונים של הפיתוח של טכניקה זו, שמרנו electroporated כוסות עין הרשתית-נטולת בתרבות למשך 24 שעות כדי להעריך את היעילות של electroporation הושג עם תנאים שונים 1. למרות שאנו לא ניסינו תרבותם לתקופה ארוכה יותר של פעמים, הניסיון שלנו מצביע על כך שהפרוטוקול המתואר במסמך זה יכול להיות מיושם גם ללימודי הסתמכות על explants organotypic רשתית, סיפק תנאי תרבות explant לטווח ארוך מתאימים משמשים.

לבסוף, ניתן יהיה להרחיב את תחולתו של ההוא לשעבר אובו גישת electroporation למודלים של בעלי חיים אחרים. לדוגמא בtransfection הניסיון שלנו של עיני עכבר ביום הלידה 1 או 4 באמצעות פרוטוקול זה הניב תוצאות טובות איכותי בתרבויות explant, אך כאשר תרביות תאים ניתקו היו ניסיון יעילות transfection הייתה בסדר הגודל של 6%, דומים לזו של טכניקות אחרות. כך, זה יכול להיות חלופה פשוטה לפרוטוקולים אחרים למודל חיה זו, אבל זה היה צריך להיות מותאם למערכת המסוימת אם יעילות גבוהה נדרשת. ראוי לציין, כאמור לעיל, בשלב עוברי בזמן electroporation היה מפתח לתוצאת היעילות הגבוהה שהושגה בחומוס, ולכן פרמטר זה יש לשקול בזהירות בעת החלת הטכניקה לדגמים אחרים.

לסיכום, לשעבר אוב טכניקת electroporation יכול להרחיב את תחולתו של במבחנה מערכות רשתית ככלים רבי עוצמה כדי להשלים במחקרי vivo, מציע nאפשרויות EW למחקר ברשתית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ECM 830 Electro Square Porator BTX/ Harvard Apparatus 45-0052
Genetrode, L-Shaped, 5 mm Gold Tip BTX/ Harvard Apparatus 45-0115 model 512 Gold tipped electrode used as anode
Polyimide Tubing Vention Medical custom made Internal Diameter: 0.5 mm/wall thickness: 0.15 - 0.2 mm. Used for insulating gold tiped electrode
2.5 mm square box filament, 4.5 mm wide Sutter Instrument Company FB245B Used to make cathode electrode
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Gibco - Life Technologies 14175-095
Moloney forceps Roboz RS-8254 Serrated; Slight Curve; 4.5" Length
Dumont tweezers 5/45 Roboz RS-5058 Pattern #5, 45 Degree Angle; .10 X .06mm Tip Size; 109mm Length
Bonn micro forceps, 1x2 teeth Roboz RS-5172 Tying Platform; 1x2 Teeth, 0.12 mm Teeth; 3.75" Length; 0.3 mm Tip Width

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vergara, M. N., Gutierrez, C., O'Brien, D. R., Canto-Soler, M. V. Ex vivo electroporation of retinal cells: a novel, high efficiency method for functional studies in primary retinal cultures. Exp Eye Res. 109, 40-50 (2013).
  2. Chalmel, F., et al. Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential. BMC Mol Biol. 8, 74 (2007).
  3. Goureau, O., Regnier-Ricard, F., Desire, L., Courtois, Y. Role of nitric oxide in photoreceptor survival in embryonic chick retinal cell culture. J Neurosci Res. 55 (4), 423-431 (1999).
  4. Hewitt, A. T., Lindsey, J. D., Carbott, D., Adler, R. Photoreceptor survival-promoting activity in interphotoreceptor matrix preparations: characterization and partial purification. Exp Eye Res. 50 (1), 79-88 (1990).
  5. Leveillard, T., et al. Identification and characterization of rod-derived cone viability factor. Nat Genet. 36, 755-759 (2004).
  6. Lorentz, O., Sahel, J., Mohand-Said, S., Leveillard, T. Cone survival: identification of RdCVF. Adv Exp Med Biol. 572, 315-319 (2006).
  7. Nakamura, M., Singh, D. P., Kubo, E., Chylack Jr, L. T., Shinohara, T. LEDGF: survival of embryonic chick retinal photoreceptor cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (5), 1168-1175 (2000).
  8. Paes-de-Carvalho, R., Maia, G. A., Ferreira, J. M. Adenosine regulates the survival of avian retinal neurons and photoreceptors in culture. Neurochem Res. 28 (10), 1583-1590 (2003).
  9. Stenkamp, D. L., Gregory, J. K., Adler, R. Retinoid effects in purified cultures of chick embryo retina neurons and photoreceptors. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (8), 2425-2436 (1993).
  10. Fuhrmann, S., Kirsch, M., Hofmann, H. D. Ciliary neurotrophic factor promotes chick photoreceptor development in vitro. Development. 121 (8), 2695-2706 (1995).
  11. Toy, J., Norton, J. S., Jibodh, S. R., Adler, R. Effects of homeobox genes on the differentiation of photoreceptor and nonphotoreceptor neurons. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (11), 3522-3529 (2002).
  12. Yan, R. T., He, L., Wang, S. Z. Pro-photoreceptor activity of chick neurogenin1. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (12), 5567-5576 (2009).
  13. Adler, R. Regulation of neurite growth in purified retina neuronal cultures: Effects of PNPF, a substratum-bound, neurite-promoting factor. J Neurosci Res. 8 (2-3), 165-177 (1982).
  14. Adler, R. A model of retinal cell differentiation in the chick embryo. Prog Retin Eye Res. 19 (5), 529-557 (2000).
  15. Adler, R., Hatlee, M. Plasticity and differentiation of embryonic retinal cells after terminal mitosis. Science. 243 (4889), 391-393 (1989).
  16. Adler, R., Lindsey, J. D., Elsner, C. L. Expression of cone-like properties by chick embryo neural retina cells in glial-free monolayer cultures. J Cell Biol. 99 (3), 1173-1178 (1984).
  17. Adler, R., Magistretti, P. J., Hyndman, A. G., Shoemaker, W. J. Purification and cytochemical identification of neuronal and non-neuronal cells in chick embryo retina cultures. Dev Neurosci. 5 (1), 27-39 (1982).
  18. Belecky-Adams, T., Cook, B., Adler, R. Correlations between terminal mitosis and differentiated fate of retinal precursor cells in vivo and in vitro: analysis with the 'window-labeling' technique. Dev Biol. 178 (2), 304-315 (1996).
  19. Hyndman, A. G., Adler, R. Neural retina development in vitro. Effects of tissue extracts on cell survival and neuritic development in purified neuronal cultures. Dev Neurosci. 5 (1), 40-53 (1982).
  20. Politi, L. E., Adler, R. Generation of enriched populations of cultured photoreceptor cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 27 (5), 656-665 (1986).
  21. Vergara, M. N., Canto-Soler, M. V. Rediscovering the chick embryo as a model to study retinal development. Neural Dev. 7, 22 (2012).
  22. Adler, R. Determination of cellular types in the retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (5), 1677-1682 (1993).
  23. Repka, A., Adler, R. Differentiation of retinal precursor cells born in vitro. Dev Biol. 153 (2), 242-249 (1992).
  24. Morris, V. B. Symmetry in a receptor mosaic demonstrated in the chick from the frequencies, spacing and arrangement of the types of retinal receptor. J Comp Neurol. 140 (3), 359-398 (1970).
  25. Li, H., Chan, S. T. H., Tang, F. Transfection of rat brain cells by electroporation. J Neurosci Methods. 75 (1), 29-32 (1997).
  26. Martinez, C. Y., Hollenbeck, P. J. Transfection of primary central and peripheral nervous system neurons by electroporation. Methods Cell Biol. 71, 339-351 (2003).
  27. Boatright, J. H., et al. The 5' flanking regions of IRBP and arrestin have promoter activity in primary embryonic chicken retina cell cultures. Exp Eye Res. 64 (2), 269-277 (1997).
  28. Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture. Curr Protoc Neurosci. Chapter 3, Unit 3.11 (2001).
  29. Kumar, R., et al. The bZIP transcription factor Nrl stimulates rhodopsin promoter activity in primary retinal cell cultures. J Biol Chem. 271 (47), 29612-29618 (1996).
  30. Toy, J., Bradford, R. L., Adler, R. Lipid-mediated gene transfection into chick embryo retinal cells in ovo and in vitro. J Neurosci Methods. 104 (1), 1-8 (2000).
  31. Werner, M., Madreperla, S., Lieberman, P., Adler, R. Expression of transfected genes by differentiated, postmitotic neurons and photoreceptors in primary cell cultures. J Neurosci Res. 25 (1), 50-57 (1990).
  32. Yuan, L., Kawada, M., Havlioglu, N., Tang, H., Wu, J. Y. Mutations in PRPF31 inhibit pre-mRNA splicing of rhodopsin gene and cause apoptosis of retinal cells. J Neurosci. 25 (3), 748-757 (2005).
  33. Hughes, S. H. The RCAS vector system. Folia Biol (Praha). 50 (3-4), 107-119 (2004).
  34. Das, R. M., et al. A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon. Dev Biol. 294 (2), 554-563 (2006).
  35. Nguyen, A. T., Dow, A. C., Kupiec-Weglinski, J., Busuttil, R. W., Lipshutz, G. S. Evaluation of gene promoters for liver expression by hydrodynamic gene transfer. J Surg Res. 148 (1), 60-66 (2008).
  36. Xu, L., et al. CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice. Hum Gene Ther. 12 (5), 563-573 (2001).
  37. You, L. M., et al. A hybrid promoter-containing vector for direct cloning and enhanced expression of PCR-amplified ORFs in mammalian cells. Mol Biol Rep. 37 (6), 2757-2765 (2009).
  38. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Dev Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 105 רשתית קולטי האור תרבית תאים ראשונית electroporation transfection פלסמיד חומוס
העברה יעילה ג&#39;ין בצ&#39;יק הרשתיות לסלולריים יסודי לימודי תרבות:<em&gt; אקס-אוב</em&gt; גישת Electroporation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vergara, M. N., Gutierrez, C.,… More

Vergara, M. N., Gutierrez, C., Canto-Soler, M. V. Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach. J. Vis. Exp. (105), e52002, doi:10.3791/52002 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter