Abstract
Деградация белков в убикитина-протеасомного системы (UPS) является одним из основных нормативно механизм белкового гомеостаза во всех эукариот. Стандартный подход к определению деградации внутриклеточного белка зависит от биохимических анализов для следующих кинетику спада белка. Такие методы часто трудоемкий и занимает много времени, и, следовательно, не поддается экспериментов, направленных на оценку нескольких подложек и условий деградации. В качестве альтернативы, на основе роста клеток анализы были разработаны, которые являются, в их традиционном формате, конечных точек анализов, которые не могут количественно определяют относительные изменения уровня белка.
Здесь мы опишем метод, который верой и правдой определяет изменения в скоростях разложения белковых сочетанием их кинетики клеточного роста дрожжей. Метод основан на установленной системой отбора, где урацил ауксотрофию URA3 -deleted дрожжевые клетки спасает экзогенно выраженной репортера белка, Состоит из слияния между основного гена URA3 и деградации определителя (degron). Репортерный белок устроен так, что его скорость синтеза является постоянным, пока его скорость разложения определяется degron. Как рост клеток в урацил-дефицитных среде пропорциональна относительных уровней URA3, кинетика роста являются полностью зависит от деградации белка репортер.
Этот метод точно измеряет изменения в внутриклеточных кинетики деградации белка. Она была применена к: (а) оценка относительного вклада известных убиквитиновых сопрягающих факторов на протеолиз (б) E2 конъюгации фермент структура-функция анализирует (с) идентификация и характеристика новых degrons. Применение degron- URA3 -based системы превосходит поле деградации белка, как он также может быть выполнен с возможностью мониторинга изменений уровней белка, связанных с функциями других клеточных путей.
Introduction
Система деградации убиквитин-протеасомный является одним из основных нормативно-машина, которая участвует в поддержании гомеостаза белка во всех эукариот. ИБП изначально сопрягает несколько молекул убиквитин для белка-мишени, после чего поли-убикитина-меченый белок разлагается протеасомой 26S. В большинстве случаев, скорость шаг для убиквитин опосредованной деградации ограничение является субстратом убиквитилирование, опосредовано Е2 конъюгации ферменты и ферменты Е3 лигирования (E3 Лигазы) 1. Следовательно, внутриклеточная стабильность специфических белков отражает их восприимчивость к убиквитиновой-сопряжения и активность их родственными Ubiquitylation ферментов.
E3 лигазы являются основными компонентами распознавания субстрата из ИБП. Как таковые, эти ферменты признать degrons в пределах их субстратов, которые либо отсутствуют, либо не подвергались в их стабильных аналогов 2. Например, многие регуляторы клеточного цикла мУсть быть синтезированы и разложению, в результате временно определенным образом, чтобы поддерживать прогрессию клеточного цикла в порядке. Деградация этих белков часто контролируется путем фосфорилирования, опосредовано клеточных сигнальных регулируемых киназ 3,4. С другой стороны, аномально-сложенные белки распознаются через загадочные degrons. Это регионы, которые обычно скрыты в нативной структуры и подвергаются на структуры возмущения. Такие degrons включают гидрофобные домены 5-7 и внутренне неупорядоченные сегменты 8.
Так как семенной открытие убиквитин-системы для деградации белка и характеризации его основ в лизатах ретикулоцитов 9, дрожжевые генетика способствовал в раскрытии многие из компонентов системы убиквитин 10. Успех дрожжей в качестве модельного организма для систематического анализа деградации белков ИБП, в основном за счет того, что ИБП является высокимлы сохраняется во всех эукариот 4, в сочетании с их аменабельности как экспериментальной системы. Действительно, системы дрожжей на основе обычно используются, чтобы расшифровать механизмы действия Ubiquitylation машин.
Изучение деградации белка биохимических средств, как правило, требуется подготовка клеточных экстрактов. В то время как животное клеточные белки могут быть извлечены в относительно мягких условиях, которые сохраняют белковых взаимодействий и функцию, наличие надежной клеточной стенки в дрожжах 11 требует значительно более жестких условий срыва которые могут повлиять на восстановление белка. Действительно, различные процедуры, связанные с нарушением дрожжевой клетки значительно различаются по своей способности к восстановлению интактные белки в количествах, которые правильно представляют их относительную клеточную изобилие. Далее неточность присуща различных методов, используемых для определения деградации ставки специфических белков: Метаболические маркировке на основе "Импульс-погони" эксперименты с последующим имmunoprecipitation, чтобы изолировать специфические белки 12, часто не строго количественный. Таким образом, когда деградация белка по сравнению с этим методом, дополнительная осторожность следует проявлять при интерпретации результатов. Чтобы обойти этот недостаток, альтернатива циклогексимид (СНХ) погоня анализ может быть использован 12. В этом анализе, ингибитор перевод будет добавлен в клеточных культурах и временных изменений в уровнях белка стационарных впоследствии контролироваться. Тем не менее, использование хлоргексидином ограничивается белков с относительно коротким периодом полураспада (<90 мин), как долгосрочное подавление синтеза белка цитотоксичен. Следует отметить, что оба вышеуказанных анализов требуют использования белковых-специфических антител, которые не всегда доступны.
Чтобы преодолеть эти технические ограничения, исследователи разработали несколько подходов, которые не требуют извлечения клеток и прямой обработки белка. Один подход основан на создании ауксотрофного Yeaштаммы й, полученные путем делеции генов, кодирующих важные метаболические ферменты. Такие гены включают HIS3, LEU2, TRP1 и Lys2, кодирование для ферментов, необходимых для биосинтеза аминокислот, а также URA3, который кодирует OMP декарбоксилазы (URA3), существенную фермент биосинтеза пиримидина рибонуклеотидной. URA3 широко используется в деградации белков исследований. В этих анализах, конститутивной экспрессии URA3 спасает рост клеток URA3 в урацил-дефицитных среды 13. Следовательно, дестабилизации URA3 путем слияния с degron может уменьшить рост клеток на минимальной среде без урацила. Этот метод был использован в различных исследованиях деградации белка, в том числе определение деградации детерминанты 5, E3 лигаз 14 и вспомогательный убиквитилирование факторы 15 и открытие новых ИБП degrons 16. Все эти методы используются рост клеток на чашках с агаром, как для анализа считывания. Тем не менее, тон критерий роста (положительный / отрицательный рост), в то время как надежный и эффективный, в основном качественный и не обеспечивает количественную информацию, которая важна для оценки потенции degron или относительный вклад различных вспомогательных факторов деградации.
Поэтому мы разработали и использовали дрожжевые векторы и методы скрининга позволяет систематическое и количественный анализ деградации белков в URA3 -degron системы синтеза. Протокол основан на простой в обращении анализа, который измеряет кинетики роста в жидкой культуре в условиях селективной (GILS) и по генерации стандартных кривых роста. Кинетика роста дрожжей характеризуются три основных этапа - отставание, экспоненциальный (лог) и неподвижной фазы. Расчет кинетики дрожжи репликации на этапе журнала в селективных условиях, которая определяется уровнями экспрессии URA3-degron, обеспечивает объективную количественную измерения уродеградация белков е. Этот метод может быть применен к измерения и сравнения темпы деградации нескольких подложек ИБП одновременно в нескольких штаммов и при различных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Культура клеток
- Transform соответствующие ауксотрофные дрожжевые клетки, такие как Try467 (таблица 2), с плазмидой, содержащей: (а) URA3 -degron синтеза и (б) дополнительного метаболического маркера для отбора и поддержание плазмиды.
Примечание: Пример подходящего плазмиды является YDpK-MET25p-Deg1-FLAG-Vma12-URA3 (Lys2) (Deg1- УФ) Это дрожжи интегративный плазмида, содержащая слитый белок, содержащий от Deg1 - это degron, полученный из дрожжей транскрипции. Коэффициент MAT2 17, FLAG эпитоп - для обнаружения по иммуноблотинга, Vma12 - стабильный белка ЭР, и URA3 15,18 (рис 3А). (Таблица 3 для плазмид, используемых в данном исследовании, и в дополнительных примеров подходящих плазмид.) - Для выбора и поддержания плазмиды, держать клетки в чашках с агаром при подходящем Synthetic установленными (SD) среду, не аминокислотных маркеры отбора
- Рост клеток O / N при 30 ° С в подходящем селективной среде SD для поддержания плазмиды до стационарной фазы не будет достигнута. Выращивают клетки в пробирки или в 96-луночный планшет, в зависимости от количества образцов, которые будут рассмотрены (Раздел 2).
2. Сотовый Подготовка к анализу
- Когда небольшое количество образцов (N≤15) должны быть проанализированы, разбавленных клетки и заменить носитель следующим образом:
- Развести 50 мкл клеток из O / N культуры с 150 мкл SD среды на лунку в 96-луночный планшет (прозрачным дном). Примечание, первый образец обозначен как пустой, содержит только среду.
- Определить OD 600 значения образцов в 96-луночного планшета с использованием микропланшет-ридера.
- Рассчитать фактическую OD 600 в каждую лунку путем умножения OD 600 чтение на коэффициент разбавления (х4), от WhIch значение пустой чтения вычитается. Нормализация результирующие значения путем деления на 0,55, чтобы получить вычисленную путь-длину 1 см, в соответствии с законом Ламберта-Бера. Обратите внимание, это значение является постоянной при измерении оптическую плотность 600 200 мкл клеток в стандартном 96-луночного планшета.
- Рассчитайте точный объем, необходимый для получения дрожжевых клеток в количестве, эквивалентном OD 600 0,25 и передать его в пробирку Эппендорф.
- Спин вниз клетки с высокой скоростью (12000 XG) в течение 1 мин.
- Удалить супернатант и клетки вновь суспендируют в 1 мл соответствующей селективной среде (смотри раздел 3.1), чтобы получить OD 600 0,25.
- Передача 200 мкл разбавленных штаммов к новой скважины в 96-луночный планшет.
- Когда большое количество образцов (N> 15) должны быть проверены, разбавленных клетки и заменить носителе без предварительного OD 600 измерения, следующим образом:
- Трансфер 10 мкл стационарных клетоквзрослый O / N в 96-луночный планшет в новый 96-луночный планшет, содержащий 190 мкл (разведение 1:20) соответствующей селективной среде (смотри раздел 3.1).
3. Кинетика роста в жидкой культуры в условиях селективной (GILS)
- Используйте следующую СМИ для измерения роста, используя URA3-degron репортеру:
- Для положительного контроля роста дрожжей под не-ограничительных условий, использование плазмиды селективный SD СМИ (см раздел 1.2). Если выбор плазмида не требуется, например, при использовании интегративной плазмиды, такие как Deg1 -УФ, SD среде, содержащей все необходимые аминокислоты (SD в комплекте) могут быть использованы.
- Для экспериментальных образцов измерительных рост под ограничительные условия, использовать SD-URA среду.
- Установите многомодового планшетного к:. Температуру инкубации 30 ° С, OD 600 интервалов измерения от 15 мин и орбитальной и линейные пожимая циклы 1 мин каждые семь минут <ш /> Примечание: Это двухрежимный тряска была оптимизирована для получения равномерного распределения клеток; Однако, другие пожимая режимы или даже не встряхивание может работать также.
- Инкубируйте клетки при 30 ° С в микропланшет-ридера O / N или пока клетки не достигли стационарной фазе (12-24 ч).
- Экспорт необработанных данных в файл электронной таблицы.
- Определить кинетики роста дрожжей, используя MDTcalc, настроенную программу, которая вычисляет минимальное время (в час) для клеток, чтобы удвоить их численность населения (минимальная время удвоения (MDT); подробнее см раздел 4).
4. Расчет минимальной время удвоения (MDT): Принципы MDTcalc алгоритма
ПРИМЕЧАНИЕ: Принципы алгоритма MDTcalc, используя репрезентативную выборку Try467 дрожжевых клеток (таблица 2), выращенных в SD полной среде, приведены в таблице 1 и на рисунке 1, показывая таблиц данных и роста участки, соотственно.
- Вычитание OD 600 пустых значений, полученных в соответствующих скважины, из каждого из показаний, полученных в образце хорошо. Разделите итоговые различия по 0,55 (для 96-луночных планшетах) для коррекции длины пути света. Участок Окончательные значения (таблица 1, Транс.) На время, чтобы произвести фактическую кривую роста дрожжей (OD 600 / час) (рис 1а).
- Рассчитать журнал 2 (OD 600) для каждой из преобразованных значений для преобразования в логарифмической фазе роста в линейной кривой (Фиг.1В).
- Рассчитать наклон интервалом 10 временных точек (N = 10), начиная с момента времени 0 и не скользящей один момент времени, в то время, пока N <10 (таблица 1, склона; Рисунок 1в).
- Вычислить обратную величину каждого склона, чтобы получить время, необходимое для клеточной популяции вдвое (таблица 1, 1 / Slope; Фиг.1С). Рассчитать минимальный1 / значение наклона для определения MDT (таблица 1, черный прямоугольник, рисунок 1С). Выписка рассчитанное MDT для клеток в образце (Таблица 1, 1 / склон, черный прямоугольник) от выбранного временного интервала (таблица 1, очерченного красным прямоугольником, цифры 1В, 1D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость роста клеток на SD-УРА среды обратно пропорциональна MDT.
5. Использование MDTcalc
- Скопируйте дополненные программные файлы в указанную папку на компьютере.
- Убедитесь, что файл электронной таблицы, содержащий данные роста сохраняется и закрывается. Откройте прикладную программу MDTcalc увидеть начало появляется экран.
- Вставьте необходимую информацию, как показано на рисунке 2:
- В разделе "путь к файлу", нажмите на прямоугольнике справа, чтобы найти файл электронной таблицы.
- В разделе "Имя листа", напишите имя таблицы, где тНеобработанные данные он расположен.
- Под «Исходное положение», вставить таблицы координата времени 0 из первой выборки.
- В разделе "колонке Time", вставить букву, определяющую местоположение колонки момент времени (время должно быть предусмотрено в секундах).
- В разделе "пустой столбец", вставить букву, определяющую местоположение пустой колонке (обычно, но не обязательно в хорошо A1 от 96-луночного планшета).
- В разделе "OD значение ', выбрать минимальное преобразованное OD 600 значение, необходимое для начала расчета MDT (обычно 0,15-0,25). Установка этого значения позволяет расчеты MDT для культур в лаг фазы из-за чрезмерного разбавления настолько, что MDT рассчитывается только для образцов, которые достигают определенного OD 600 значение или выше.
- После того, как последнее значение было введено, нажмите кнопку 'Calculate' в нижней части экрана. Убедитесь, что индикатор справа постепенно меняется к гReen. Не открывайте файл электронной таблицы в процессе расчета.
- Экспорт два набора данных, которые появляются на экране автоматически по завершении расчета MDT в таблице. Убедитесь, что данные включают в себя: (а) значение MDT для каждой лунки, который проходит испытания на минимальное значение ОП (как набор в разделе 5.2.1.6) и (б) начальный момент времени в интервале от которого была рассчитана MDT (Пуск время).
- Вставьте необходимую информацию, как показано на рисунке 2:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Исследование роли ферментов пути Doa10 в деградации репортерной подложки
Чтобы проверить обоснованность метода GILS было по сравнению с традиционными деградации анализа. Этот эксперимент оценивает относительный вклад компонентов ER-мембраны локализованы Doa10 E3-лигазы комплекс 20,21 к деградации контроля качества белка-репортера подложки Deg1- VU (3А). Deg1- VU плазмиды была интегрирована в клеток дикого типа или в клетках, лишенных гена для сопрягающего фермента Е2, UBC7 (ubc7) и стабильность белков впоследствии определяется СНХ погони анализа 6. Anti-Flag иммуноблотинг показал стабильную полосу белка Deg1 -VU в ubc7 клеток, что отсутствовал в клеток дикого типа (рис 3б). Отсутствие Deg1 -VU в клеток дикого типа является attribuТед его непрерывной деградации, которая была упразднена в ubc7 клеток, что свидетельствует о стабильности Deg1 -VU сильно зависит от Ubc7.
Очевидно, что деградация Deg1- VU является быстрое. Однако относительная скорость деградации не может быть определена с помощью анализа, так как CHX белок не обнаруживается в клеток дикого типа с самого начала. Следовательно, была использована вновь разработанный метод анализа GILS, чтобы сравнить относительные различия в кинетике деградации белков между дикого типа и различных мутантных штаммов (фиг.3С). Первоначально дикие типа, ubc6, ubc7 или doa10 клетки, экспрессирующие Deg1 -VU выращивали на SD полной среде. Для измерения GILS, клетки промывали и инкубировали в SD-УПА. Расчет MDT была выполнена на примере в протоколе. Цифры 3С, 3D показывают, что аналогичные кривые роста и рассчитанный MDT (~ 2,5 часа) для всех штаммов, выращенных в SD полной, excludiнг возможность того, что удаление любого из рассмотренных генов влияет на рост клеток. В отличие от этого, инкубирование в SD-URA привело к снижению роста клеток дикого типа (MDT = 6,34), в то время как лишь незначительные дефекты рост наблюдался в мутантных штаммов (MDT ~ 3 ч).
Изучение влияния различных мутантов E2 конъюгации фермента Ubc7 на деградацию Deg1- VU
Тот факт, что Ubc7 абсолютно необходим для деградации Deg1- VU позволяет точную оценку даже частичных эффектов различных E2 мутантов, так как экспериментальный диапазон системы очень широк. Соответственно, плазмиды, содержащие дикого типа или мутантного UBC7 были интегрированы в Ubc7 клеток, экспрессирующих Deg1 -VU и их вклад в ухудшение определялось GILS. Как и следовало ожидать, быстро кинетики роста наблюдались в клетках, экспрессирующих Ubc7 с активно-сайте муTants C89S и N81A 22 (Рисунок 4). Кроме того, два мутанта по прогнозам, косвенно препятствуют деградации Deg1 -VU (V25G и H94K) были испытаны. Эти мутации также усиленный рост клеток, по сравнению с диким типом Ubc7, хотя и в меньшей степени, чем мутантов активно-сайта (в среднем МДГ из 3,4 ч для V25G и H94K сравнению со средними МДГ из 2,7 ч для C89S и N81K) (Рисунок 4 ). Таким образом, способ GILS может быть использован для точного измерения относительного вклада различных факторов деградации к стабильности репортерной подложки.
Выделение и оценка новых degrons
Система GILS также занятых в высоком формате экрана пропускной выявления новых degrons и количественно их относительной эффективности, то есть степень, с помощью которого они вызывают деградацию (рисунок 5). Для оптимизации идентификацию добросовестных degrons, дополнительныйэтап выбора, которая является рост в присутствии Fluoroorotic кислоты (5-FOA), был добавлен. URA3 эффективно преобразует 5-FOA в токсического соединения (5-фторурацил), которые могут служить в качестве позитивной селекции для выделения штаммов дрожжей, где URA3 дестабилизируется 16,23. Для идентификации новых degrons, библиотека репортер плазмид был создан путем слияния случайные фрагменты, полученные из библиотеки дрожжи кДНК к URA3-GFP плазмиды 24 (рис 5А). GFP фрагмент был добавлен для того, чтобы дать возможность вторичного экрана и передать информацию о локализации термоядерной degron (см обсуждение). Библиотека была преобразована в дрожжах, то выбирается в присутствии 5-FOA (фиг.5В) и положительных клонов были выделены и повторно высевали на чашки с агаром в формате 96-луночного планшета. Каждый колонии переносили в 96-луночный планшет, инкубируют O / N, и разводили в новом 96-луночного планшета, как описано в разделе 2.2. Ожидается, что рост клеток в SD-URA средыбудет коррелировать со степенью выражения URA3, что исход потенции degron, чтобы побудить деградации. Впоследствии это было подтверждено путем применения GILS (5С). Мы подтвердили, что все случайно определена колонии, которые были предварительно выбраны с помощью 5-FOA показали близкие значения MDT, на СД-НОУ среды (рис 5C, пустые бары). В отличие от этого, все клоны показали различные скорости роста на SD-УПА, которые были значительно медленнее, чем клетки, экспрессирующие управления URA3-GFP (данные не показаны). Как указано, существует обратная зависимость между темпами роста на SD-УПА и MDT. Таким образом, чем выше МДТ, более мощным является degron. В самом деле, все МДГ, полученные из положительно выбранных клонов были выше, чем у контрольной группы (выше красной линии) (рис 5C, закрашенные столбцы).
<сильный> Таблица 1. Иллюстрация расчета дрожжи MDT. единицы времени часов (ч). Бланк и образец взяты из OD 600 просмотров. Трансформация (Trans.) это значение после пустой вычитания и коррекции путь длиной OD 600 Вход. 2 вычисляется из преобразованных данных. Склон является входа 2 (OD 600) значения в пределах последовательных интервалов времени точек 10, деленное на время. 1 / Наклон это время, необходимое для клеточной популяции, чтобы дублировать себя. Черный прямоугольник обозначает MDT Значение. Красный прямоугольник отмечает временной интервал, из которого был рассчитан MDT.
| Дрожжи | Генотип | Источник |
| TRy467 | α, his3Δ1, lys2Δ0, ura3Δ0, leu2Δ; 0 | Euroscarf |
| TRy508 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7-3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: МЕТ25-Deg1-Flag-Vma12-URA3 :: Lys, trp1-1, ubc7 Δ :: LEU2 | Это исследование |
| TRy528 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [N81A] -3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: МЕТ25-Deg1-Flag-Vma12-URA3 :: Lys, trp1- 1, ubc7Δ :: LEU2 | Это исследование |
| TRy530 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [C89S] -3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: МЕТ25-Deg1-Flag-Vma12-URA3 :: Lys, trp1- 1, ubc7Δ :: LEU2 | Это исследование |
| TRy532 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [H94K] -3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: МЕТ25-Deg1-Flag-Vma12-URA3 :: Lys, trp1- 1, ubc7Δ :: LEU2 | Это исследование |
| TRy556 | α, his3-Δ200 :: pRS303 :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: МЕТ25-Deg1-Flag-Vma12-URA3 :: Lys, trp1-1, ubc7Δ :: LEU2 | Это исследование |
| TRy563 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7-3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: МЕТ25-Deg1-Flag-Vma12-URA3 :: Lys, trp1-1, ubc7 Δ :: LEU2, ubc6Δ :: KanMX | Это исследование |
| TRy633 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [V25A] -3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: МЕТ25-Deg1-Flag-Vma12-URA3 :: Lys, trp1- 1, ubc7Δ :: LEU2 | Это исследование |
| TRy786 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7-3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: МЕТ25-Deg1-Flag-Vma12-URA3 :: Lys, trp1-1, ubc7 :: НОУ, doa10Δ :: HIS3 | Это исследование |
Таблица 2. Список штаммов дрожжей, используемых в этом исследовании.
| Плазмиды, используемые в данном исследовании, | ||
| Плазмида | Соответствующие маркеры | Источник |
| pTR717 | YDpK-MET25p-Deg1-Flag-Vma12-URA3 (интегративная плазмиды, содержащей LYS1) | Это исследование |
| pTR1412 | pRS315-CUP1p-URA3-HA-GFP (НОУ) | Это исследование |
| Дополнительные подходящие репортер плазмиды | ||
| Плазмида | Соответствующие маркеры | Источник |
| pOC9-CL1 | pOC9-CUP1p-HA-URA3 (TRP1) | (17) |
| URA3-2 (GFP) | pPS414-TRP1p-MYC-ura3-2-GFP | Льюис и Pelham |
Таблица 3. Список плазмид, используемых в данном исследовании Справка:.. Льюис, MJ & Pelham, контроль качества HR Неэффективное термочувствительных белков на мембране PLoS One 4, e5038, DOI: 10.1371 / journal.pone.0005038 (2009).
Рисунок 1. Принципы расчета MDT. Try467 дрожжевые клетки в OD 600 0,22, инкубировали в SD полной среде в течение указанного периода времени. OD 600 Измерения проводились каждый ~ 15 мин, и данные были собраны в таблицу. (А) Трансформированные OD 600 значения из таблицы 1 в зависимости от времени. (В)Войти 2 ОД 600 в зависимости от времени Красная линия:. Отмечает временной интервал, из которого был рассчитан MDT (D). Темпы роста (C) Дрожжи (наклон) рассчитывали путем измерения изменений в OD 600 последовательных 10 временных точек (при условии линейности) с течением времени Время начала:. Время, с которого был начат расчет. (D) Время, необходимое для дрожжей удвоить является обратным наклоном от (C) (1 / Slope) MDT:. Расчетная минимальная время удвоения (в час).
Рисунок 2. MDTcalc стартовый экран: Протокол раздел 5.1. Типичные значения входных вводится показаны.
Рисунок 4. Измерение относительные скорости деградации Deg1 -VU в Ubc7 мутантных штаммов Слева:. Участок трансформированных OD 600 значений, полученное в ходе репликации ш МН-типа, ubc7 Δ и указанных Ubc7 мутантов, в зависимости от времени. Клетки, экспрессирующие Deg1 -VU выращивали на SD-УРА среды и OD 600 измеряли каждый ~ 15 мин. Справа: MDT для каждого штамма была рассчитана с использованием MDTcalc.
1 / 52021fig5highres.jpg "ширина =" 500px "/>
Рисунок 5. высокая пропускная тест для определения и выделения новых degrons. (А) Схематическое представление особенностей репортера URA3-GFP-кДНК. (В) блок-схема, описывающая экспериментальные шаги для выделения дрожжевых штаммов, несущих degron. Плазмидную библиотеку описано в A был преобразован в Try467 клеток с последующим отбором на SD-Leu пластин. Колонии были воспроизведены в SD-НОУ пластин, содержащих 5-FOA и быстрорастущих колоний были собраны и организованы по тарелкам в упорядоченном массиве. (C) Колонии выражения URA3-GFP-кДНК, которые росли на пластинах, содержащих 5-FOA инкубировали в любом SD-Leu или SD-URA медиа в течение 20 часов. OD 600 не измерялась каждый ~ 15 мин и минимальное время удвоения дрожжи (MDT) рассчитывали с помощью программного обеспечения MDTcalc Нет degron:. Плазмиды, экспрессирующей URA3-GFP без degron, служит в качестве положительного контроля для грowth Красная линия:. Порог определяется значением MDT контроля.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы опишем анализа, основанного на рост клеток для определения относительных скоростей деградации белка, называемого «Кинетика роста в жидкой культуре в условиях селективной» (GILS). GILS анализ имеет ряд преимуществ: это простой в настройке, сбора и анализа данных проста и крайне модульный. Следовательно, GILS могут применяться одновременно несколько образцов в удобной для пользователя формате мульти-луночного планшета, которые могут быть адаптированы к автоматизации для применения при высоких пропускной. Самое главное, GILS обеспечивает высокую воспроизводимость, количественные и надежные данные и является более гибким, чем агар-пластинчатых анализов на основе растущих, которые выбирают для положительного / отрицательного роста. Кроме того, GILS очень чувствительна в том, что он может обнаружить небольшие различия в уровнях белков деградации или стационарных уровней, отражающих деятельность соответствующих компонентов ИБП или degrons. Наконец, GILS анализы требуют значительно более короткие периоды роста (<12 ч) по сравнению с growtч анализы на чашках с агаром (обычно 2-4 дней).
В то время как анализ GILS очень полезны для изучения деградации белка, несколько важных соображения должны быть приняты во внимание. Например, важно, чтобы использовать изогенных фон штамм дрожжей из-за деформации конкретных характеристик роста. Кроме того, для выяснения анализа обоснованности, каждый тест следует повторить не менее трех раз в одинаковых условиях, самое главное, начальная плотность клеток (OD 600), температура роста и клеточной культуры пожимая интенсивность не должна быть изменена. Поэтому рекомендуется, что специфический протокол анализа хранятся в программном обеспечении Микропланшет читателя для многократного использования. Дополнительная переменная, что следует считать то, где degron расположен внутри URA3. Как положение degron может определить свою функцию, позиционируя либо на C 'или N' регионах должны быть эмпирически проверены.
Калибровка репортера протУровень экспрессии Эйн также имеет важное значение для успешного применения GILS. Оптимальный репортер является тот, который эффективно разрушается исследуемой системы и, таким образом, дает урацил ауксотрофию. Тем не менее, изменения в ауксотрофии также должны добросовестно отражают стабильность репортер. Это может быть определено эмпирически путем предварительного испытания корреляции между темпами деградации белка репортер, определенных дополнительных биохимических методов и значений MDT, определяемых GILS (фиг.3В). Одна общая проблема возникает тогда, когда базальные стационарное выражение репортера не достигает порогового уровня, и, таким образом, является слишком низкой для того, чтобы рост на SD-УПА, даже когда он полностью стабилизированы. Такая проблема может быть преодолена путем размещения выражение репортер под контролем индуцируемого промотора, который увеличивает экспрессию белка базальной без влияния деградации. Промоутер деятельность в таких системах должны быть мелко откалиброван, чтобы избежать постоянного роста на SD-УПА в связи с HIGч уровни белка и репортер активность фермента, даже если это частично разлагаться. Промоторы и условия экспрессии, описываемые в данном исследовании, были выбраны потому, что они позволяют чувствительную регуляцию экспрессии белка: MET25p и CUP1 р являются метаболит-индуцированной активности промоторов из которых может быть точно настроена путем контроля метионина и меди, соответственно (таблица 3).
Контроль качества репортер субстраты (как те, которые описаны в данном исследовании) могут образовывать внутриклеточные агрегаты, которые могут секвестрацию URA3 и предотвращения его функцию. В таком случае урацил ауксотрофность может быть ошибочно интерпретирован как результат деградации белка. Чтобы проверить тенденцию различных degrons агрегировать, должны быть использованы дополнительные репортер. Например, репортер URA3-GFP предназначены для экрана degron (фиг.5А), позволяет визуализировать внутриклеточных агрегатов методом флуоресцентной микроскопии клеток, растущих в Пресесть 5-FOA. Эти агрегаты появляются как плотный GFP очаги, которые четко отличим от диффузного появления растворимого белка (данные не показаны). URA3-GFP-репортер degron могут быть аналогичным образом использованы для определения влияния на degron на белковой совместной локализации и субклеточном распределения. Он также может быть использован для после деградации отдельных подложках методом проточной цитометрии, в качестве вторичного экрана 25.
Наиболее значительным преимуществом способа является то, что GILS она является достаточно гибкой и, таким образом, может быть легко адаптирована к различным приложениям, в дополнение к тем, которые описаны в данном документе. Например, способ может быть также использован для изучения пригодности протеасомы в различных условиях. В этом случае, не-убиквитилируются протеасом субстрат, такой как декарбоксилазы орнитина (ОДС), слит с URA3. Способ также может проверить деградацию белков в различных внутриклеточных компартментах, когда используется определенный сигнал локализации.В этом исследовании Vma12 якорь репортеру к ER-мембраны (Фигуры 3, 4). Аналогичным образом, могут быть использованы сигнал ядерной локализации (NLS), ER удержания сигнала (KDEL) или цитозоль (отсутствие конкретного сигнала). Система позволяет одновременный анализ деградации белков в различных внутриклеточных отсеков может иметь огромное влияние на наше понимание того, как деградация белков сети работают. Наконец, принципы метода отбора может быть применен к исследованию деградации белков в других модельных систем на основе клеток, от бактерий до клеток человека, все из которых требуют геном URA3 продукт для выживания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Difco yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate | BD Biosciences | 233520 | For yeast growth on SD minimal media. Amino acids to be supplied are: Arginine, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, Methionine, Phenylalanine, Threonine, Tryptophan |
| Ammonium sulfate | Sigma - Aldrich | A4418 | |
| Glucose | Sigma - Aldrich | 16325 | |
| Adenine | Sigma - Aldrich | A8626 | |
| Uracil | Sigma - Aldrich | U0750 | |
| Amino acids | Highest purity available | ||
| 96-well plates | Nunc | 167008 | Any other compatible brand can be used |
| Cyclohexamide | Sigma - Aldrich | C7698 | Working conc. 0.5 mg/ml |
| Infinite 200 PRO series | Tecan | For yeast incubation and OD600 measurements. Any other compatible temp-controled reader can be used. | |
| MDTcalc | Experimental software |
References
- Hershko, A., Ciechanover, A.
- Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 679-689 (2008).
- Willems, A. R., et al. SCF ubiquitin protein ligases and phosphorylation-dependent proteolysis. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 354, 1533-1550 (1999).
- Tyers, M., Jorgensen, P. Proteolysis and the cell cycle: with this RING I do thee destroy. Curr Opin Genet Dev. 10, 54-64 (2000).
- Johnson, P. R., Swanson, R., Rakhilina, L., Hochstrasser, M. Degradation signal masking by heterodimerization of MATα2 and MAT a1 blocks their mutual destruction by the ubiquitin-proteasome pathway. Cell. 94, 217-227 (1998).
- Furth, N., et al. Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope. Molecular Biology of the Cell. 22, 4726-4739 (2011).
- Fredrickson, E. K., Gallagher, P. S., Clowes Candadai, S. V., Gardner, R. G. Substrate recognition in nuclear protein quality control degradation is governed by exposed hydrophobicity that correlates with aggregation and insolubility. J Biol Chem. 10, (2013).
- Rosenbaum, J. C., et al. Disorder Targets Misorder in Nuclear Quality Control A Disordered Ubiquitin Ligase Directly Recognizes Its Misfolded Substrates. Molecular cell. 41, 93-106 (2011).
- Ciechanover, A., Hod, Y., Hershko, A. A heat-stable polypeptide component of an ATP-dependent proteolytic system from reticulocytes. Biochemica., & Biophysical Research Communications. 81, 1100-1105 (1978).
- Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
- Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. Cell wall construction in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 23, 185-202 (2006).
- Zhou, W., Ryan, J. J., Zhou, H. Global analyses of sumoylated proteins in Saccharomyces cerevisiae. Induction of protein sumoylation by cellular stresses. J Biol Chem. 279, 32262-32268 (2004).
- Alani, E., Kleckner, N. A new type of fusion analysis applicable to many organisms: protein fusions to the URA3 gene of yeast. Genetics. 117, 5-12 (1987).
- Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation. Genes Dev. 15, 2660-2674 (2001).
- Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. EMBO J. 25, 533-543 (2006).
- Gilon, T., Chomsky, O., Kulka, R. G. Degradation signals for ubiquitin system proteolysis in Saccharomyces cerevisiae. Embo J. 17, 2759-2766 (1998).
- Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast 2 repressor. Cell. 61, 697-708 (1990).
- Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. J Biol Chem. 283, 32302-32316 (2008).
- Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. 194, Academic Press. (1991).
- Carvalho, P., Goder, V., Rapoport, T. A. Distinct ubiquitin-ligase complexes define convergent pathways for the degradation of ER proteins. Cell. 126, 361-373 (2006).
- Denic, V., Quan, E. M., Weissman, J. S. A luminal surveillance complex that selects misfolded glycoproteins for ER-associated degradation. Cell. 126, 349-359 (2006).
- Wu, P. Y., et al. A conserved catalytic residue in the ubiquitin-conjugating enzyme family. Embo J. 22, 5241-5250 (2003).
- Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. 5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics. Methods Enzymol. 154, 164-175 (1987).
- Alfassy, O. S., Cohen, I., Reiss, Y., Tirosh, B., Ravid, T. Placing a disrupted degradation motif at the C terminus of proteasome substrates attenuates degradation without impairing ubiquitylation. J Biol Chem. 288, 12645-12653 (2013).
- Cronin, S. R., Hampton, R. Y. Measuring protein degradation with green fluorescent protein. Methods in Enzymology. 302, 58-73 (1999).
