Abstract
Protein nedbrydning af ubiquitin-proteasom systemet (UPS) er en vigtig reguleringsmekanisme for protein homeostase i alle eukaryoter. Den standard metode til opgørelse af intracellulær proteinnedbrydning afhængig biokemiske analyser for at følge kinetikken af protein tilbagegang. Sådanne fremgangsmåder er ofte besværlige og tidskrævende og derfor ikke egnet til nogle eksperimenter med henblik på at vurdere multiple substrater og nedbrydningsprodukter betingelser. Som et alternativ er der udviklet cellevækst assays, som er i deres konventionelle format, slutpunktsmulighederne assays, som ikke kvantitativt at bestemme de relative ændringer i proteinniveauer.
Her beskriver vi en fremgangsmåde, der nøjagtigt bestemmer ændringer i protein nedbrydningshastigheder ved at koble dem til gær celle-vækstkinetik. Fremgangsmåden er baseret på en etableret selektionssystem, hvor uracil auxotrofi af URA3 -deleted gærceller reddes af en eksogent udtrykte reporter proteinBestående af en fusion mellem den væsentlige URA3-genet og en nedbrydning determinant (degron). Reporterproteinet er udformet således, at dets syntese er konstant, mens dens nedbrydningshastigheden bestemmes af degron. Som cellevækst i uracil-deficient medium er proportional med de relative niveauer af Ura3, vækstkinetik er helt afhængig af reporter proteinnedbrydning.
Denne metode måler nøjagtigt ændringer i intracellulære protein nedbrydningskinetik. Den blev anvendt til: (a) at vurdere den relative bidrag af kendte ubiquitinlignende konjugering faktorer for proteolyse (b) E2 konjugerende enzym struktur-funktion-analyser (c) Identifikation og karakterisering af nye degrons. Anvendelse af degron- URA3 -baseret system, overskrider protein felt nedbrydning, som det også kan tilpasses til at overvåge ændringer af protein, der er forbundet med funktioner i andre cellulære veje.
Introduction
Ubiquitin-proteasom nedbrydning system er en vigtig regulerende maskine, som har været impliceret i opretholdelsen af protein homeostase i alle eukaryoter. UPS oprindeligt konjugater flere ubiquitin-molekyler til et målprotein hvorefter poly-ubiquitin-mærkede protein nedbrydes af 26S-proteasomet. I de fleste tilfælde, det hastighedsbegrænsende trin for ubiquitin medieret nedbrydning er substrat ubiquitylering, medieret af E2 konjugering enzymer og E3 ligering enzymer (E3 Ligaser) 1. Følgelig intracellulære stabilitet af specifikke proteiner afspejler deres følsomhed over for ubiquitin-konjugation og aktiviteten af deres beslægtede ubiquitylering enzymer.
E3 ligaser er de vigtigste komponenter i UPS substrat anerkendelse. Som sådan disse enzymer genkender degrons inden for deres substrater, der enten fraværende eller ikke eksponeret i deres stabile kolleger 2. For eksempel har mange regulatorer af cellecyklus must syntetiseres og nedbrydes i en tidsmæssigt specifik måde for at holde cellecyklusprogression i orden. Nedbrydningen af disse proteiner styres ofte ved phosphorylering, medieret af cellesignalerende regulerede kinaser 3,4. På den anden side er aberrant foldede proteiner anerkendt gennem kryptiske degrons. Disse regioner, der normalt skjult i native struktur og er udsat på struktur forstyrrelse. Sådanne degrons omfatter hydrofobe domæner 5-7 og uløseligt uordnede segmenter 8.
Siden den skelsættende opdagelse af ubiquitin-system for proteinnedbrydning og karakterisering af dens fundamentale i reticulocytlysater 9, gærgenetik var medvirkende til at opdage mange af komponenterne i ubiquitin 10. Succesen af gær som en model organisme for systematisk analyse af proteinnedbrydning af UPS skyldes primært det faktum, at UPS er højly bevaret i alle eukaryoter 4, kombineret med deres modtagelighed som et eksperimentelt system. Faktisk er gær-baserede systemer, der almindeligvis anvendes til at dechifrere de virkningsmekanismer af ubiquitylering maskiner.
Studere proteinnedbrydning ved biokemiske teknikker kræver normalt fremstilling af celleekstrakter. Mens animalske celle proteiner kan udvindes under relativt milde betingelser, der bevarer protein interaktioner og funktion, og tilstedeværelsen af en robust cellevæg i gær 11 kræver betydeligt hårdere afbrydelse betingelser, som kan påvirke oprensning af proteiner. Faktisk forskellige procedurer for gær cellesprængning varierer betydeligt i deres kapacitet til at inddrive intakte proteiner i mængder, som korrekt svarer til deres relative cellulære overflod. Yderligere unøjagtighed er iboende i de forskellige metoder, der anvendes til bestemmelse af nedbrydningsprodukter satser specifikke proteiner: metabolisk mærkning-baserede "puls-chase eksperimenter efterfulgt af immunoprecipitation at isolere specifikke proteiner 12, er ofte ikke strengt kvantitative. Således, når proteinnedbrydning sammenlignes ved denne metode, ekstra forsigtighed bør udvises i fortolkningen af resultaterne. For at omgå denne ulempe, kan en alternativ cycloheximid (CHX) chase assay anvendes 12. I dette assay er oversættelsen inhibitor tilsat til cellekulturer og tidsmæssige ændringer i protein steady state-niveauerne efterfølgende overvåges. Ikke desto mindre er brugen af CHX begrænset til proteiner med relativt korte halveringstider (<90 min), som på lang sigt hæmning af proteinsyntese er cytotoksisk. Især begge de ovennævnte assays kræver anvendelse af protein-specifikke antistoffer, som ikke altid er tilgængelige.
For at overvinde disse tekniske begrænsninger, har forskere udviklet flere metoder, der ikke kræver celleekstraktion og direkte håndtering protein. Én fremgangsmåde er baseret på etablering af auxotrofe jast-stammer, fremstillet ved sletning af gener, der koder væsentlige metaboliske enzymer. Sådanne gener indbefatter HIS3, LEU2, LYS2 og TRP1, der koder for enzymer, der er nødvendige for aminosyrebiosyntese samt URA3, som koder for OMP-decarboxylase (Ura3), et essentielt enzym pyrimidin ribonukleotid biosyntese. Ura3 har været meget anvendt i proteinnedbrydningsprodukter studier. I disse assays, konstitutiv ekspression af Ura3 redder væksten af URA3-celler i uracil-deficient medium 13. Derfor kan destabilisere Ura3 ved fusion af en degron formindske cellevækst på minimalt medium, der manglede uracil. Denne metode er blevet anvendt i forskellige protein nedbrydningsundersøgelser, herunder identifikation af nedbrydning determinanter 5, E3 ligaser 14 og hjælpeudstyr ubiquitylering faktorer 15 og opdagelsen af nye UPS degrons 16. Alle disse metoder anvendes cellevækst på agarplader som assay udlæsning. Dog, tHan vækst kriterium (positiv / negativ vækst), mens robust og effektiv, er for det meste kvalitativ og ikke give kvantitative oplysninger, der er vigtig for at vurdere en degron potens eller det relative bidrag af forskellige hjælpestoffer nedbrydning faktorer.
Vi har derfor udviklet og anvendt gær vektorer og screeningsmetoder muliggør systematisk og kvantitativ analyse af proteinnedbrydning ved URA3 -degron fusion system. Protokollen er baseret på en let håndterlige assay, der måler Vækstkinetik i flydende kultur under selektive betingelser (Gils) og dannelsen af faste vækstkurver. Gær vækstkinetik er karakteriseret ved tre hovedfaser - forsinkelse, den eksponentielle (log) og den stationære fase. Beregning af gær replikation kinetik under log-fase under selektive betingelser, som er bestemt af niveauet af ekspression af Ura3-degron tilvejebringer en objektiv kvantitativ måling of proteinnedbrydning. Denne metode kan anvendes til at måle og sammenligne nedbrydningshastigheder af multiple UPS substrater samtidigt i flere stammer og under forskellige forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellekultur
- Transformere egnede auxotrofe gærceller, såsom Try467 (tabel 2), med et plasmid, der indeholder (a) en URA3 -degron fusion og (b) et yderligere metabolisk markør for plasmid udvælgelse og vedligeholdelse.
BEMÆRK: Et eksempel på et egnet plasmid er YDpK-MET25p-Deg1-FLAG-Vma12-Ura3 (LYS2) (Deg1- UV) Dette er en gær integrerende plasmid indeholdende et fusionsprotein bestående af Deg1 - en degron afledt af gær transkription. faktor MAT2 17 FLAG epitop - til påvisning af immunoblotting, Vma12 - stabile ER protein, og Ura3 15,18 (figur 3A). (Se tabel 3 for plasmider, der anvendes i denne undersøgelse, og for yderligere eksempler på egnede plasmider.) - For plasmid udvælgelse og vedligeholdelse, at holde cellerne i agarplader under en passende syntetisk Defineret (SD) medium, der mangler aminosyre selektionsmarkører
- Dyrke celler O / N ved 30 ° C i et egnet selektiv SD medium for plasmidopretholdelse indtil en stationær fase er nået. Grow cellerne i reagensglas eller på en plade med 96 brønde, afhængigt af antallet af prøver, der skal undersøges (afsnit 2).
2. Cell Forberedelse til Analyse
- Når et lille antal prøver (N≤15) skal analyseres, fortyndes cellerne og erstatte mediet som følger:
- Fortynd 50 pi celler fra en O / N-kulturen med 150 pi SD medium per brønd i en plade med 96 brønde (klar bund). Bemærk, den første prøve er udpeget som blank indeholder medium alene.
- Bestemme OD600 værdier for prøverne i 96-brønds plade under anvendelse af en mikropladelæser.
- Beregne den faktiske OD 600 i hver brønd ved at multiplicere OD600 aflæsning med fortyndingsfaktoren (x4) fra which værdi blindaflæsningen subtraheres. Normalisere resulterende værdier ved at dividere med 0,55 for at opnå en beregnet vejlængde på 1 cm i henhold til Lambert-Beers lov. Bemærk, denne værdi er konstant ved måling af OD 600 200 pi celler i en standard 96-brønds plade.
- Beregne den nøjagtige nødvendige volumen til opnåelse af gærceller på beløb svarende til OD600 på 0,25 og overføre det til et Eppendorf-rør.
- Spin ned cellerne ved høj hastighed (12.000 x g) i 1 min.
- Fjern supernatanten og resuspender cellerne i 1 ml af passende selektivt medium (se afsnit 3.1) til opnåelse af OD600 på 0,25.
- Overfør 200 ul af de fortyndede stammer til en ny brønd i en 96-brønds plade.
- Når et stort antal prøver (N> 15), der skal testes, fortyndes cellerne og erstatte mediet uden forudgående OD600 måling som følger:
- Overfør 10 pi stationære cellergrown O / N i en 96-brønds plade til en ny 96-brønds plade indeholdende 190 ul (fortynding 1:20) af de passende selektive medier (se afsnit 3.1).
3. vækstkinetik i flydende kultur under selektive betingelser (Gils)
- Brug følgende medier for vækst målinger ved hjælp Ura3-degron reporter:
- For positive kontroller af gær vækst under ikke-restriktive betingelser, brug plasmid selektiv SD medie (se afsnit 1.2). Hvis der ikke plasmidselektion er påkrævet, for eksempel ved anvendelse af en integrativ plasmid såsom Deg1 -UV, SD medium indeholdende alle de nødvendige aminosyrer (SD komplet) kan anvendes.
- For eksperimentelle prøver måler vækst under restriktive betingelser, anvende SD-URA medium.
- Indstil en multimode mikropladelæser til:. En inkubationstemperatur på 30 ° C, OD 600 måleintervaller af 15 min, og en orbital og lineære ryste cykler af 1 min hver syv min <br /> BEMÆRK: Denne dual-mode rystning blev optimeret til at opnå homogen fordeling af celler; dog kan andre rystende tilstande eller slet ingen rysten arbejde så godt.
- Inkubere cellerne ved 30 ° C i en mikropladelæser O / N eller indtil cellerne har nået den stationære fase (12-24 timer).
- Eksportere rådata til et regneark fil.
- Bestem gær vækstkinetik anvender MDTcalc, et skræddersyet program, der beregner den minimale tid (i timer) for celler til at fordoble deres befolkningsstørrelse (Minimal fordoblingstid (MDT), for detaljer se afsnit 4).
4. Beregning af Minimal Fordobling Tid (MDT): Principper for det MDTcalc Algoritme
BEMÆRK: Principper for det MDTcalc algoritmen, ved hjælp af et repræsentativt udvalg af Try467 gærceller (tabel 2), der dyrkes i SD komplette medier, er illustreret i tabel 1 og figur 1, der viser en data regneark og vækst plots, respectivt.
- Subtrahere OD 600 blindværdier opnået i det respektive godt, fra hver af de aflæsninger opnået i prøvebrønden. Opdele de resulterende forskelle ved 0,55 (for 96-brønds plader) for at korrigere for lysbanelængden. Plotte endelige værdier (tabel 1, Trans.) Mod tiden for at producere den faktiske gær vækstkurve (OD 600 / hr) (figur 1A).
- Beregn log 2 (OD 600) for hver af de transformerede værdier til at konvertere den logaritmiske vækstfase i en lineær kurve (figur 1B).
- Beregn hældningen for en 10 time-points interval (N = 10) starter ved tiden 0 og flytte én gang-point ad gangen, indtil N <10 (tabel 1, Slope, figur 1C).
- Beregn den inverse værdi af hver hældning til opnåelse af den nødvendige tid til cellepopulationen at fordoble (tabel 1, 1 / Slope, figur 1C). Beregne den minimale1 / Slope værdi at bestemme MDT (tabel 1, sort firkant, figur 1C). Uddrag den beregnede MDT for celler i prøven (tabel 1, 1 / Slope, sort rektangel) fra den valgte tidsinterval (tabel 1, skitseret af rødt rektangel, 1B, 1D).
BEMÆRK: Hastigheden af cellevækst på SD-URA medium er omvendt proportional med MDT.
5. Brug MDTcalc
- Kopier de suppleret programfiler til en angiven mappe på computeren.
- Sørg for, at regnearket fil, der indeholder data vækst gemmes og lukkes. Åbn MDTcalc program for at se startskærmen vises.
- Sæt de nødvendige oplysninger, som vist i figur 2:
- Under 'File sti', klik på rektanglet til højre for at finde regnearksfilen.
- Under 'Arknavn «, skriver regnearket navn hvor than rå data ligger.
- Under 'Udgangsstilling ", indsætte regnearket koordinere tid 0 i den første prøve.
- Under 'Time kolonne anføres bogstavet definerer placeringen af tidspunkt kolonne (tidspunkt bør gives i sekunder).
- Under 'Blank kolonne anføres bogstavet definerer placeringen af tom kolonne (sædvanligvis, men ikke nødvendigvis i brønd A1 af 96-brønds plade).
- Under 'OD-værdi «, vælge den minimale transformerede OD 600 værdi er nødvendig for initiering af MDT beregning (normalt 0,15-0,25). Indstilling af denne værdi forhindrer beregninger af MDT for kulturer i latensfasen på grund af overdreven fortynding, således at MDT beregnes kun for prøver, der når den definerede OD600 værdi eller højere.
- Når den sidste værdi er indtastet, skal du trykke på knappen 'Beregn' nederst på skærmen. Sørg for, at de fremskridt, der bar på højre gradvist skifter til gReen. Forsøg ikke at åbne regnearket fil under beregningsprocessen.
- Eksportere de to sæt data, der vises automatisk på skærmen, ved afslutningen af MDT beregning i et regneark. Sørg for, at data omfatter: (a) MDT-værdi for hver brønd, der passerer den minimale OD-værdi test (som fastsat i afsnit 5.2.1.6) og (b) den oprindelige tidspunkt af intervallet, hvorfra MDT blev beregnet (Start tid).
- Sæt de nødvendige oplysninger, som vist i figur 2:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
At undersøge betydningen af enzymer Doa10 pathway i nedbrydningen af et reporter-substrat
For at teste gyldigheden af Gils metode, den blev sammenlignet med en traditionel nedbrydning assay. Dette forsøg vurderer det relative bidrag af komponenter i ER-membranen lokaliseret Doa10 E3-ligase kompleks 20,21 til nedbrydning af proteinet kvalitetskontrol reporter substrat Deg1- VU (figur 3A). Den Deg1- VU plasmid blev integreret i vildtypeceller eller i celler, der mangler genet for E2 konjugerende enzym blev UBC7 (ubc7) og proteinstabilitet efterfølgende bestemt ved en CHX chase assay 6. Anti-FLAG immunoblotting viste en stabil Deg1 -VU protein band i ubc7 celler, der var fraværende i vildtypeceller (figur 3B). Fraværet af Deg1 -VU i vildtypeceller er kan henføresTed til dets fortsatte nedbrydning, der blev afskaffet i ubc7 celler, hvilket indikerer, at Deg1 -VU stabilitet er stærkt afhængig af Ubc7.
Det er klart, nedbrydningen af Deg1- VU er hurtig. Imidlertid kan den relative nedbrydningshastighed ikke kan bestemmes ved en CHX assay eftersom proteinet kan ikke påvises i vildtypeceller fra starten. Følgelig blev nyudviklet Gils assayfremgangsmåde anvendes med henblik på at sammenligne de relative forskelle i kinetikken for proteinnedbrydning mellem vildtype og forskellige mutante stammer (figur 3C). Oprindeligt blev vilde type ubc6, ubc7 eller doa10 celler, der udtrykker Deg1 -VU dyrket på SD komplet medium. At måle Gils blev cellerne vasket og inkuberet i SD-URA. MDT beregning blev henrettet som eksemplificeret i protokollen. Figur 3C, 3D viser lignende vækstkurver og beregnet MDT (~ 2,5 timer) for alle stammer, der dyrkes i SD fuldstændig, excluding muligheden for, at udeladelsen af nogen af de undersøgte gener påvirker cellevækst. I modsætning hertil inkubation i SD-URA resulterede i dårlig vækst af vildtypeceller (MDT = 6,34), mens kun en mindre vækstdefekt blev observeret i de mutante stammer (MDT ~ 3 h).
At undersøge effekten af forskellige mutanter af E2 konjugerende enzym Ubc7 på nedbrydningen af Deg1- VU
Det faktum, at der er absolut nødvendigt Ubc7 for Deg1- VU nedbrydning muliggør nøjagtig vurdering af selv partielle effekter af forskellige E2 mutanter, da den eksperimentelle vifte af systemet er meget bred. Følgelig blev plasmider indeholdende vildtype eller mutant UBC7 integreret i Ubc7 celler, der udtrykker Deg1 -VU og deres bidrag til nedbrydning blev bestemt ved Gils. Som forventet var hurtige vækstkinetik observeret i celler, der udtrykker Ubc7 med aktiv-site munende C89S og N81A 22 (figur 4). Hertil kommer, at to mutanter forventes at indirekte forhindrer Deg1 -VU nedbrydning (V25G og H94K) blev testet. Disse mutationer også forbedret cellevækst sammenlignet med vildtype Ubc7, om end i mindre grad end de aktive-site mutanter (gennemsnit MDTs på 3,4 timer for V25G og H94K i forhold til de gennemsnitlige MDTs på 2,7 timer for C89S og N81K) (Figur 4 ). Således kan Gils metode anvendes til nøjagtig måling af det relative bidrag fra forskellige nedbrydningsfaktorer til stabiliteten af en reporter substrat.
Isolering og evaluering af hidtil ukendte degrons
Den Gils systemet blev også anvendt i en high throughput screen format til at identificere hidtil ukendte degrons og kvantificere deres relative potens, dvs. graden, som de fremkalder nedbrydning (figur 5). For at optimere identifikation af bona fide degrons en yderligereselektionstrin, der er vækst i nærvær af fluoroorotinsyre (5-FOA), blev tilsat. Ura3 effektivt omdanner 5-FOA i en toksisk forbindelse (5-fluorouracil), der kan tjene som en positiv selektion til isolering af gærstammer, hvor Ura3 destabiliseres 16,23. At identificere nye degrons blev et bibliotek af reporterplasmider genereret ved sammensmeltning af tilfældige fragmenter afledt fra en gær-cDNA-bibliotek til Ura3-GFP plasmid 24 (figur 5A). GFP-delen blev tilføjet for at gøre det muligt for en sekundær skærm, og give oplysninger om lokaliseringen af fusion degron (se diskussionen). Biblioteket blev transformeret ind i gær, derefter udvalgt i nærvær af 5-FOA (figur 5B), og positive kloner blev isoleret og re-podet på agarplader i en 96-brønds plade-format. Hver koloni blev overført til 96-brønds plade, inkuberet O / N, og fortyndes i en ny 96-brønds plade som beskrevet i afsnit 2.2. Det forventes, at væksten af celler i SD-URA mediumvil korrelere med graden af Ura3 udtryk, der er resultatet af degron potens til at inducere nedbrydning. Dette blev efterfølgende bekræftet ved at anvende Gils (figur 5C). Vi bekræftede, at alle tilfældigt plukket kolonier, der blev valgt på forhånd med 5-FOA viste lignende MDT værdier på SD-Leu medium (figur 5C, tomme søjler). I modsætning hertil alle kloner viste variable vækstrater på SD-URA, som var markant langsommere end celler, der udtrykker kontrol Ura3-GFP (data ikke vist). Som nævnt, er der et omvendt forhold mellem vækstrate på SD-URA og MDT. Således, at jo højere MDT, jo mere potent er degron. Faktisk alle MDTs afledt af positivt udvalgte kloner var højere end i kontrolgruppen (over den røde linje) (Figur 5C, udfyldte søjler).
<strong> tabel 1. Illustration af beregning af gær MDT. Tid enheder er timer (h). Blank og prøve er fra OD 600 læser. Transformation (Trans.) er OD 600 værdi efter blank subtraktion og sti-længde korrektion. Log 2 beregnes ud fra de transformerede data. Slope er Log 2 (OD 600) værdier inden fortløbende intervaller på 10 tidspunkter divideret med tid. 1 / Slope er den tid, der kræves for cellepopulationen at kopiere sig selv. sort firkant markerer MDT værdi. Red rektangel markerer tidsinterval hvorfra MDT blev beregnet.
| Gær | Genotype | Source |
| TRy467 | α, his3Δ1, lys2Δ0, ura3Δ0, leu2Δ; 0 | Euroscarf |
| TRy508 | α, HIS3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7-3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: MET25-Deg1-Flag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1-1, ubc7 Δ :: LEU2 | Denne undersøgelse |
| TRy528 | α, HIS3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [N81A] -3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: MET25-Deg1-Flag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1- 1, ubc7Δ :: LEU2 | Denne undersøgelse |
| TRy530 | α, HIS3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [C89S] -3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: MET25-Deg1-Flag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1- 1, ubc7Δ :: LEU2 | Denne undersøgelse |
| TRy532 | α, HIS3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [H94K] -3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: MET25-Deg1-Flag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1- 1, ubc7Δ :: LEU2 | Denne undersøgelse |
| TRy556 | α, HIS3-Δ200 :: pRS303 :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: MET25-Deg1-Flag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1-1, ubc7Δ :: LEU2 | Denne undersøgelse |
| TRy563 | α, HIS3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7-3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: MET25-Deg1-Flag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1-1, ubc7 Δ :: LEU2, ubc6Δ :: KanMX | Denne undersøgelse |
| TRy633 | α, HIS3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [V25A] -3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: MET25-Deg1-Flag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1- 1, ubc7Δ :: LEU2 | Denne undersøgelse |
| TRy786 | α, HIS3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7-3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: MET25-Deg1-Flag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1-1, ubc7 :: LEU, doa10Δ :: HIS3 | Denne undersøgelse |
Tabel 2. Liste over gærstammer anvendt i denne undersøgelse.
| Plasmider, der anvendes i denne undersøgelse | ||
| Plasmid | Relevante markører | Source |
| pTR717 | YDpK-MET25p-Deg1-Flag-Vma12-Ura3 (integrativ plasmid indeholdende LYS1) | Denne undersøgelse |
| pTR1412 | pRS315-CUP1p-URA3-HA-GFP (LEU) | Denne undersøgelse |
| Yderligere egnede reporterplasmider | ||
| Plasmid | Relevante markører | Source |
| pOC9-CL1 | pOC9-CUP1p-HA-URA3 (TRP1) | (17) |
| URA3-2 (GFP) | pPS414-TRP1p-MYC-ura3-2-GFP | Lewis og Pelham |
Tabel 3. Liste over plasmider, der anvendes i denne undersøgelse Reference:.. Lewis, MJ & Pelham, HR Ineffektiv kvalitetskontrol af varmefølsomme proteiner på plasmamembranen PLoS One 4, e5038, doi: 10,1371 / journal.pone.0005038 (2009).
Figur 1. Principper for beregning af MDT. Try467 gærceller ved OD600 0,22, blev inkuberet i SD komplette medier i den angivne tidsperiode. OD 600 målinger blev taget hver ~ 15 min, og data blev indsamlet i et regneark. (A) Transformerede OD600 værdier fra tabel 1 plottet mod tid. (B)Log 2 af OD600 plottes mod tiden røde linje:. Markerer tidsinterval hvorfra MDT blev beregnet (D). (C) Gær vækstrate (hældning) blev beregnet ved at måle ændringer i OD 600 på hinanden følgende 10 tidspunkter (under forudsætning af linearitet) over tid Start tid:. Den tid, fra hvilket beregningen blev indledt. (D) Den tid, der kræves for gær at fordoble er den inverse af hældningen fra (C) (1 / Slope) MDT:. Den beregnede Minimal Fordobling tid (i timer).
Figur 2. MDTcalc startskærm: Protokol afsnit 5.1. Typiske input værdier, der skal indtastes, er vist.
Figur 4. Måling relative nedbrydning satser Deg1 -VU i Ubc7 mutantstammer Venstre:. Plot af de transformerede OD 600-værdier, målt under replikation af w ILD-typen, ubc7 Δ og de angivne Ubc7 mutanter, versus tid. Celler, der udtrykker Deg1 -VU blev dyrket på SD-URA medium og OD600 blev målt hver ~ 15 min. Til højre: MDT for hver stamme blev beregnet ved hjælp MDTcalc.
1 / 52021fig5highres.jpg "width =" 500px "/>
Figur 5. Et high throughput assay til identificering og isolering af hidtil ukendte degrons. (A) Skematisk præsentation af funktionerne i Ura3-GFP-cDNA reporter. (B) Et rutediagram, der beskriver de eksperimentelle trin til isolering af gær stammer, der bærer en degron. Plasmidet bibliotek beskrevet i A blev transformeret ind Try467 celler, efterfulgt af udvælgelse på SD-LEU plader. Kolonier blev replikeret til SD-Leu plader indeholdende 5-FOA og hurtigtvoksende kolonier blev opsamlet og organiseret på plader i en ordnet array. (C) Kolonier udtrykker Ura3-GFP-cDNA der voksede på plader indeholdende 5-FOA blev inkuberet i enten SD-Leu eller SD-URA medier til 20 timer. OD600 blev målt hver ~ 15 min og minimal gær fordobling tid (MDT) blev beregnet ved anvendelse af MDTcalc software Nr degron:. Et plasmid, der udtrykker Ura3-GFP uden degron, tjener som en positiv kontrol for growth Rød linje:. tærskel bestemmes af MDT værdien af kontrol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en assay baseret på cellevækst til bestemmelse af relativ proteinnedbrydningsprodukter satser, såkaldte "Vækstkinetik i flydende kultur under selektive betingelser« (Gils). Den Gils analyse har flere fordele: Det er nemt at sætte op, indsamling og analyse af data er ligetil, og det er yderst modulær. Følgelig kan Gils anvendes samtidig på flere prøver på en brugervenlig multi-brønds plade-format, der kan tilpasses til automation for højt gennemløb applikationer. Vigtigst er det, Gils giver meget reproducerbare kvantitative og solide data og er mere fleksibel end agar-plade baseret-vækstassays der selekterer for positiv / negativ vækst. Desuden Gils er meget følsom, at den kan detektere små variationer i proteinnedbrydningsprodukter satser eller steady state-niveauerne afspejler aktiviteten af relevante UPS komponenter eller degrons. Endelig Gils analyser kræver betydeligt kortere vækstperioder (<12 timer) i forhold til growth assays på agarplader (typisk 2-4 dage).
Mens Gils assay er meget nyttigt til at studere protein nedbrydning, bør der tages adskillige vigtige hensyn. For eksempel er det vigtigt at anvende en isogen gærstamme baggrund skyldes stamme-specifikke vækstkarakteristika. Desuden at fastslå assay gyldighed, hver analyse bør gentages mindst tre gange under identiske betingelser, vigtigst, den oprindelige celle densitet (OD 600), væksttemperatur, og cellekultur ryster intensitet bør ikke ændres. Det anbefales derfor, at den særlige assayprotokol er lagret i mikropladelæseren software for gentagne anvendelser. En yderligere variabel, der bør overvejes, er, hvor degron er placeret inden Ura3. Som degron stilling kan bestemme dens funktion, positionering ved enten C eller N 'regioner skal empirisk afprøvet.
Kalibrering af reporter protEin udtryk niveau er også kritisk for succesfuld anvendelse af Gils. En optimal reporter er en, der effektivt nedbrudt af systemet under undersøgelsen, og således giver uracil auxotrofi. Imidlertid bør variationer i auxotrofi også trofast spejle reporter stabilitet. Dette kan bestemmes empirisk ved forudgående kontrol af sammenhængen mellem reporter proteinnedbrydningsprodukter rater, bestemt ved yderligere biokemiske metoder, og MDT værdier, bestemt ved Gils (figur 3B). Et fælles problem opstår, når den basale steady-state ekspression af et reporter ikke når en tærskelværdi, og er derfor for lav til at muliggøre vækst på SD-URA selv når det er helt stabiliseret. Et sådant problem kan løses ved at placere reporter ekspression under kontrol af en inducerbar promotor, der øger basal proteinekspression uden at påvirke nedbrydning. Promotor aktivitet i sådanne systemer bør fint kalibreret for at undgå permanent vækst på SD-URA grund HIGh protein niveauer og reporterenzym aktivitet, selv når det er delvist nedbrudt. Initiativtagerne og ekspressionsbetingelser beskrevet i denne undersøgelse blev valgt, fordi de tillader følsom regulering af protein udtryk: MET25p og CUP1 p er metabolit-inducerede promotorer, hvis aktivitet kan fintunes ved kontrol af methionin og kobber (tabel 3).
Kvalitetskontrol reporter substrater (som dem, der er beskrevet i denne undersøgelse) kan danne intracellulære aggregater, der kan sekvestrerer Ura3 og forhindre dens funktion. I et sådant tilfælde uracil auxotrofi kan fejlagtigt fortolkes som resultatet af proteinnedbrydning. For at teste tendensen forskellige degrons til at aggregere, skal en ekstra reporter anvendes. For eksempel Ura3-GFP reporter konstrueret til degron skærmen (figur 5A), muliggør visualisering af intracellulære aggregater ved fluorescensmikroskopi af celler, der vokser i presence af 5-FOA. Disse aggregater fremstår som tætte GFP foci der klart adskiller sig fra den diffuse udseende opløselige protein (data ikke vist). URA3-GFP-degron reporter kan tilsvarende anvendes til at bestemme virkningen af degron på protein co-lokalisering og subcellulær distribution. Det kan også anvendes til at følge nedbrydningen af udvalgte substrater ved flowcytometri som en sekundær skærm 25.
En mest betydningsfulde fordel af Gils metode er, at det er tilstrækkeligt fleksibelt og kan således nemt tilpasses til en bred vifte af anvendelser ud over dem der er beskrevet i heri. For eksempel kan fremgangsmåden også anvendes til at undersøge egnetheden af proteasom under forskellige betingelser. I dette tilfælde en ikke-ubiquitylated proteasom substrat, såsom ornithin-decarboxylase (ODC) er fusioneret til Ura3. Fremgangsmåden kan også teste proteinnedbrydning i forskellige intracellulære rum, når en specifik lokalisering signal anvendes.I denne undersøgelse Vma12 forankret reporter til ER-membranen (figur 3, 4). Ligeledes kan en kernelokaliseringssignal (NLS), ER retention signal (KDEL) eller cytosol (fravær af et specifikt signal) anvendes. Et system, der muliggør samtidig analyse af protein nedbrydning i forskellige intracellulære rum kan have stor indflydelse på vores forståelse af, hvordan proteinnedbrydningsprodukter netværker. Endelig kan der anvendes principperne i udvælgelsesmetode til forskning af proteinnedbrydning i andre model cellebaserede systemer, fra bakterier til humane celler, som alle kræver URA3-genet produkt for at overleve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Difco yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate | BD Biosciences | 233520 | For yeast growth on SD minimal media. Amino acids to be supplied are: Arginine, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, Methionine, Phenylalanine, Threonine, Tryptophan |
| Ammonium sulfate | Sigma - Aldrich | A4418 | |
| Glucose | Sigma - Aldrich | 16325 | |
| Adenine | Sigma - Aldrich | A8626 | |
| Uracil | Sigma - Aldrich | U0750 | |
| Amino acids | Highest purity available | ||
| 96-well plates | Nunc | 167008 | Any other compatible brand can be used |
| Cyclohexamide | Sigma - Aldrich | C7698 | Working conc. 0.5 mg/ml |
| Infinite 200 PRO series | Tecan | For yeast incubation and OD600 measurements. Any other compatible temp-controled reader can be used. | |
| MDTcalc | Experimental software |
References
- Hershko, A., Ciechanover, A.
- Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 679-689 (2008).
- Willems, A. R., et al. SCF ubiquitin protein ligases and phosphorylation-dependent proteolysis. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 354, 1533-1550 (1999).
- Tyers, M., Jorgensen, P. Proteolysis and the cell cycle: with this RING I do thee destroy. Curr Opin Genet Dev. 10, 54-64 (2000).
- Johnson, P. R., Swanson, R., Rakhilina, L., Hochstrasser, M. Degradation signal masking by heterodimerization of MATα2 and MAT a1 blocks their mutual destruction by the ubiquitin-proteasome pathway. Cell. 94, 217-227 (1998).
- Furth, N., et al. Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope. Molecular Biology of the Cell. 22, 4726-4739 (2011).
- Fredrickson, E. K., Gallagher, P. S., Clowes Candadai, S. V., Gardner, R. G. Substrate recognition in nuclear protein quality control degradation is governed by exposed hydrophobicity that correlates with aggregation and insolubility. J Biol Chem. 10, (2013).
- Rosenbaum, J. C., et al. Disorder Targets Misorder in Nuclear Quality Control A Disordered Ubiquitin Ligase Directly Recognizes Its Misfolded Substrates. Molecular cell. 41, 93-106 (2011).
- Ciechanover, A., Hod, Y., Hershko, A. A heat-stable polypeptide component of an ATP-dependent proteolytic system from reticulocytes. Biochemica., & Biophysical Research Communications. 81, 1100-1105 (1978).
- Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
- Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. Cell wall construction in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 23, 185-202 (2006).
- Zhou, W., Ryan, J. J., Zhou, H. Global analyses of sumoylated proteins in Saccharomyces cerevisiae. Induction of protein sumoylation by cellular stresses. J Biol Chem. 279, 32262-32268 (2004).
- Alani, E., Kleckner, N. A new type of fusion analysis applicable to many organisms: protein fusions to the URA3 gene of yeast. Genetics. 117, 5-12 (1987).
- Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation. Genes Dev. 15, 2660-2674 (2001).
- Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. EMBO J. 25, 533-543 (2006).
- Gilon, T., Chomsky, O., Kulka, R. G. Degradation signals for ubiquitin system proteolysis in Saccharomyces cerevisiae. Embo J. 17, 2759-2766 (1998).
- Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast 2 repressor. Cell. 61, 697-708 (1990).
- Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. J Biol Chem. 283, 32302-32316 (2008).
- Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. 194, Academic Press. (1991).
- Carvalho, P., Goder, V., Rapoport, T. A. Distinct ubiquitin-ligase complexes define convergent pathways for the degradation of ER proteins. Cell. 126, 361-373 (2006).
- Denic, V., Quan, E. M., Weissman, J. S. A luminal surveillance complex that selects misfolded glycoproteins for ER-associated degradation. Cell. 126, 349-359 (2006).
- Wu, P. Y., et al. A conserved catalytic residue in the ubiquitin-conjugating enzyme family. Embo J. 22, 5241-5250 (2003).
- Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. 5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics. Methods Enzymol. 154, 164-175 (1987).
- Alfassy, O. S., Cohen, I., Reiss, Y., Tirosh, B., Ravid, T. Placing a disrupted degradation motif at the C terminus of proteasome substrates attenuates degradation without impairing ubiquitylation. J Biol Chem. 288, 12645-12653 (2013).
- Cronin, S. R., Hampton, R. Y. Measuring protein degradation with green fluorescent protein. Methods in Enzymology. 302, 58-73 (1999).
