Abstract
Protein degradering av ubiquitin-proteasom system (UPS) er en viktig reguleringsmekanisme for protein homeostase i alle eukaryoter. Standardmetoden for bestemmelse av intracellulær proteinnedbrytingen er avhengig av biokjemiske analyser for å følge kinetikken til protein nedgang. Slike fremgangsmåter er ofte arbeidskrevende og tidkrevende og derfor ikke mottagelig for eksperimenter med sikte på å vurdere flere substrater og degraderingsbetingelser. Som et alternativ, har cellevekst-baserte assays blitt utviklet, som er, i deres konvensjonelle format, end-point-analyser som ikke kan kvantitativt bestemme relative endringer i proteinnivåer.
Her beskriver vi en metode som trofast bestemmer endringer i proteinnedbrytningshastigheter ved å koble dem til gjærcelle-vekstkinetikk. Metoden er basert på en etablert seleksjonssystem hvor uracil auxotrofi av URA3 -deleted gjærceller blir reddet av en eksogent uttrykt rapportørprotein, Som består av en fusjon mellom de essensielle URA3 genet og en degradering determinant (degron). Rapportørprotein er utformet slik at dens syntesehastighet er konstant mens dens nedbrytningshastigheten er bestemt av degron. Som cellevekst i uracil-manglende medium er proporsjonal med de relative nivåer av URA3, vekstkinetikk er helt avhengig av rapportørprotein nedbrytning.
Denne metoden måler nøyaktig endringer i intracellulære protein nedbrytningskinetikk. Det ble påført på: (a) Å vurdere den relative bidraget av kjente ubiquitin-faktorer for å konjugere proteolyse (b) å konjugere enzym E2 struktur-funksjonsanalyser (c) Identifisering og karakterisering av nye degrons. Anvendelse av degron- URA3-basert system overskrider den proteindegradering feltet, som det kan også være innrettet til å overvåke endringer av proteinnivåer forbundet med funksjoner av andre cellulære veier.
Introduction
Den ubikvitin-proteasom-nedbrytning systemet er en viktig regulerende maskin, som har vært implisert i opprettholdelsen av protein homeostase i alle eukaryotes. UPS utgangspunktet konjugater flere ubiquitin molekyler til en målprotein etter poly-ubiquitin-tagget protein forringes av 26S proteasomet. I de fleste tilfeller er det hastighetsbegrensende trinnet for ubiquitin-formidlet nedbrytning substrat ubiquitylation, mediert av E2 og E3 konjugere enzymer ligering av enzymer (E3-ligaser) 1. Følgelig intracellulære stabiliteten av spesifikke proteiner gjenspeiler deres følsomhet overfor ubiquitin-konjugering og aktiviteten av deres ubiquitylation beslektede enzymer.
E3 ligaser er de viktigste underlaget anerkjennelse komponenter av UPS. Som sådan, disse enzymene gjenkjenner degrons innenfor sine substrater som enten er fraværende eller ikke eksponert i sine stabile kolleger to. For eksempel, mange regulatorer av cellesyklusen must bli syntetisert og nedbrutt i en tidsmessig bestemt måte for å holde cellesyklusprogresjon i rekkefølge. Nedbrytningen av disse proteinene er ofte styrt ved fosforylering, mediert av celle-signal regulerte kinaser 3,4. På den annen side, er abnormt-foldede proteiner anerkjent gjennom kryptiske degrons. Dette er områder som normalt er skjult i den innfødte struktur og er utsatt på struktur forstyrrelse. Slike degrons inkluderer hydrofobe domener 5-7 og egentlig uordnede segmenter 8.
Siden seminal oppdagelsen av ubiquitin-system for proteinnedbrytning og karakterisering av dens grunnprinsipper i retikulocytt-lysater 9, gjær genetikk var medvirkende i å oppdage mange av komponentene i systemet 10 ubiquitin. Suksessen av gjær som et modellorganisme for systematisk analyse av proteindegradering av UPS er hovedsakelig på grunn av det faktum at UPS er høyly konservert i alle eukaryoter 4, kombinert med deres amenability som en eksperimentell system. Faktisk er gjær-baserte systemer som vanligvis benyttes til å dechiffrere de virkningsmekanismer av ubiquitylation maskiner.
Studerer protein nedbrytning av biokjemiske midler vanligvis krever forberedelse av celleekstrakter. Mens animalsk celleproteiner kan ekstraheres under relativt milde betingelser som bevarer proteininteraksjoner og funksjon, nærværet av en robust cellevegg i gjær 11 krever betydelig strengere avbrudd betingelser som kan påvirke proteingjenvinning. Faktisk forskjellige fremgangsmåter for gjær celleoppbrytning varierer betraktelig i deres evne til å gjenopprette intakte proteiner i mengder som korrekt representerer deres relative celle overflod. Videre unøyaktighet er iboende i de ulike metoder som benyttes for å bestemme nedbrytningshastigheter av spesifikke proteiner: Metabolsk merking baserte 'puls-chase' eksperimenter fulgt av imimmunoutfelling, for å isolere spesifikke proteiner 12, er ofte ikke strengt kvantitativt. Så når protein nedbrytning sammenlignes med denne metoden, ekstra forsiktighet bør utvises i å tolke resultatene. For å omgå denne ulempen, kan en alternativ cykloheksimid (CHX) chase analysen være ansatt 12. I denne analysen blir oversettelses inhibitor tilsatt til cellekulturer og temporale endringer i protein steady-state nivået blir deretter overvåket. Ikke desto mindre er bruken av CHX begrenset til proteiner med forholdsvis korte halveringstider (<90 min), så langvarig inhibering av proteinsyntesen er cytotoksisk. Spesielt, begge av de ovennevnte analyser som krever bruk av protein-spesifikke antistoffer, som ikke alltid er tilgjengelig.
For å overvinne disse tekniske begrensninger, har forskere utviklet flere metoder som ikke krever celle utvinning og direkte protein håndtering. En tilnærming er basert på etablering av auxotrof jast-stammer, fremstilt ved sletting av gener som koder for viktige metabolske enzymer. Slike gener inkluderer HIS3, LEU2, LYS2 og TRP1, som koder for enzymene som kreves for aminosyre-biosyntese, så vel som URA3 som koder OMP-dekarboksylase (URA3), et essensielt enzym for biosyntesen pyrimidin ribonukleotid. Ura3 har vært mye brukt i protein-nedbrytningsstudier. I disse analysene, konstituerende uttrykk for ura3 redder veksten av ura3 celler i uracil-mangel medium 13. Følgelig kan destabilisere URA3 gjennom fusjonen av en degron redusere celleveksten på minimal-medium som mangler uracil. Denne metoden har vært brukt i ulike protein nedbrytningsstudier, inkludert identifisering av nedbrytning determinanter 5, ligaser E3 14 og hjelpe ubiquitylation faktorer 15 og oppdagelsen av nye UPS degrons 16. Alle disse fremgangsmåter anvendes cellevekst på agarplater som assay avlesning. Imidlertid tHan vekst kriterium (positiv / negativ vekst), mens robust og effektiv, er det meste kvalitativ og gir ikke kvantitativ informasjon som er viktig for å vurdere en degron potens eller den relative bidraget av ulike hjelpenedbrytningsfaktorer.
Vi har derfor utviklet og utnyttet gjærvektorer og screeningmetoder som gjør det mulig systematisk og kvantitativ analyse av proteindegradering av URA3 -degron fusion system. Protokollen er basert på en lett-å-håndtak assay som måler vekstkinetikk i flytende kultur under selektive betingelser (GILS) og på generering av standard vekstkurver. Gjærvekstkinetikken er karakterisert av tre hovedfaser - etterslepet, den eksponensielle (log) og den stasjonære fasen. Beregning av gjær replikering kinetikk under logfase under selektive betingelser, som bestemmes av nivåer av uttrykk for URA3-degron, gir en upartisk kvantitativ måling of protein degradering. Denne fremgangsmåten kan anvendes til å måle og sammenligne nedbrytningshastigheter av flere UPS-substrater samtidig i flere stammer og under forskjellige betingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cell Culture
- Transformere de passende gjær auxotrofe celler, slik som Try467 (tabell 2), med et plasmid inneholdende (a) en URA3 -degron fusjon og (b) en ytterligere metabolsk markør for plasmid seleksjon og vedlikehold.
MERK: Et eksempel på en egnet plasmid er YDpK-MET25p-Deg1-FLAG-Vma12-ura3 (LYS2) (Deg1- UV) Dette er en gjær integrerende plasmid som inneholder et fusjonsprotein som består av Deg1 - en degron avledet fra gjær transkripsjon. faktor Mat2 17, FLAG epitop - for deteksjon av immunoblotting, Vma12 - en stabil ER protein, og ura3 15,18 (figur 3A). (Se tabell 3 for plasmider brukt i denne studien, og for ytterligere eksempler på egnede plasmider). - For plasmid valg og vedlikehold, holde cellene i agar plater under en egnet Syntetisk definert (SD) medium mangler aminosyre seleksjonsmarkører
- Dyrk celler O / N ved 30 ° C i et egnet medium for selektivt SD plasmid vedlikehold til en stasjonær fase er nådd. Dyrke cellene i reagensglass eller i en 96-brønns plate, avhengig av antallet prøver som skal undersøkes (seksjon 2).
2. Cell Forberedelse til analyse
- Når et lite antall prøver (N≤15) er som skal analyseres, fortynnes cellene og erstatte mediet som følger:
- Fortynn 50 ul av celler fra en O / N-kultur med 150 ul av SD-medium pr brønn i en 96-brønns plate (klar bunn). Legg merke til den første prøven er betegnet som blank inneholder kun medium.
- Bestem OD-600-verdier for prøvene i 96-brønns plate ved hjelp av en mikroplateleser.
- Beregn selve OD 600 i hver brønn ved å multiplisere OD 600 lesing med fortynningsfaktoren (x4), fra which verdien av emnet avlesning blir subtrahert. Normalisere de resulterende verdiene ved å dividere med 0,55 for å oppnå en beregnet bane-lengde på 1 cm i henhold til Beer-Lambert-loven. Legg merke til at denne verdien er konstant ved måling av OD 600 av 200 ul av celler i en standard 96-brønns plate.
- Beregne det eksakte volumet som er nødvendig for å oppnå gjærceller ved beløp tilsvarende OD600 på 0,25 og overføre den til et Eppendorf-rør.
- Spinne ned cellene ved høy hastighet (12.000 x g) i 1 min.
- Fjern supernatanten og resuspender cellene i 1 ml av det passende selektivt medium (se avsnitt 3.1) for å oppnå OD600 på 0,25.
- Overfør 200 ul av de fortynnede stammer til en ny brønn i en 96-brønns plate.
- Når et stort antall prøver (N> 15) er som skal testes, fortynn cellene og erstatte mediet uten forutgående måling av OD 600, som følger:
- Overfør 10 mL av stasjonære cellervoksen O / N i en 96-brønners plate i en ny 96-brønners plate inneholdende 190 ul (fortynning 1:20) av passende selektive medier (se avsnitt 3.1).
3. Vekst Kinetics i flytende kultur under selektive betingelser (Gils)
- Bruk følgende medier for vekst målinger ved hjelp URA3-degron reporter:
- For positive kontroller av gjær vekst under ikke-restriktive forhold, bruk plasmid selektiv SD media (se kapittel 1.2). Hvis ingen plasmid valg er nødvendig, for eksempel når man bruker en integrerende plasmid som Deg1 -UV, SD-medium inneholdende alle nødvendige aminosyrer (SD komp) kan brukes.
- For eksperimentelle prøver måler vekst under restriktive betingelser, bruker SD-URA medium.
- Angi en flermodusmikroplateleser til:. En inkubasjonstemperatur på 30 ° C, OD 600 måleintervaller på 15 min, og en orbital rister og lineære sykluser med 1 minutt hver syv minutter <br /> MERK: Denne dual-mode rystelser ble optimalisert for å oppnå homogen fordeling av celler; Imidlertid kan andre risting moduser eller ingen risting fungerer like godt.
- Inkuber cellene ved 30 ° C i en mikroplateleser O / N eller inntil cellene har nådd den stasjonære fasen (12-24 timer).
- Eksportere rådata til et regneark-fil.
- Bestem gjær vekstkinetikk ved hjelp MDTcalc, et tilpasset program som beregner minimal tid (i hr) for celler å doble sin populasjonsstørrelse (Minimal Dobling Tid (MDT), for detaljer se kapittel 4).
4. Beregning av Minimal Dobling Tid (MDT): Prinsipper for MDTcalc Algoritme
MERK: Prinsipper for MDTcalc algoritmen, ved hjelp av et representativt utvalg av Try467 gjærceller (tabell 2) dyrket i SD komplett media, er illustrert i tabell 1 og figur 1, som viser et data regneark og vekst tomter, henholdsvis.
- Subtraher OD 600 tomme verdier, oppnådd i den respektive brønn, fra hver av de avlesninger som oppnås i prøven godt. Dele de resulterende forskjeller ved 0,55 (i 96-brønners plater) til å korrigere for lysbanen lengde. Plotte de endelige verdier (tabell 1, Trans.) Mot tiden for å produsere selve gjærvekstkurve (OD 600 / hr) (figur 1A).
- Beregn log 2 (OD 600) for hver av de transformerte verdier for å omdanne den logaritmiske vekstfase til en lineær kurve (figur 1B).
- Beregn skråningen av en 10 tidspunkter intervall (N = 10) starter på tidspunkt 0 og flytte ett tidspoeng om gangen til N <10 (tabell 1, Slope, figur 1C).
- Beregne den inverse verdi av hver skråning for å oppnå den nødvendige tid for cellepopulasjon for å dobbelt (Tabell 1, 1 / Slope; figur 1C). Beregn minimal1 / Slope verdi for å bestemme MDT (Tabell 1, svart firkant, figur 1C). Pakk den beregnede MDT for celler i utvalget (tabell 1, 1 / Slope, sort rektangel) fra den valgte tidsintervall (tabell 1, skissert av rødt rektangel, Figurer 1B, 1D).
MERK: Hastigheten av cellevekst på SD-ura medium er omvendt proporsjonal med MDT.
5. Bruke MDTcalc
- Kopier de supplert programfilene til en bestemt mappe på datamaskinen.
- Sørg for regnearkfilen som inneholder vekst data blir lagret og lukket. Åpne MDTcalc program for å se på startskjermen vises.
- Sett inn den nødvendige informasjonen, som vist i Figur 2:
- Under "Filbane", klikk på firkanten til høyre for å finne regnearkfilen.
- Under 'Sheet navn', skriver regnearknavnet der than rå data ligger.
- Under "Startposisjon", setter regneark koordinere tid 0 av den første prøven.
- Under 'Time kolonne ", sett brevet som definerer plasseringen av tidspunkt kolonne (tid bør gis i sekunder).
- Under "Blank kolonne ', sett brevet som definerer plasseringen av tomme kolonnen (vanligvis, men ikke nødvendigvis i brønn A1 av 96-brønns plate).
- Under 'OD verdi', velge den minimale transformert OD 600 verdi som er nødvendig for initiering av MDT beregning (vanligvis 0,15 til 0,25). Sette denne verdien hindrer beregninger av MDT for kulturer i lagfase grunn av overdreven fortynning slik at MDT er beregnet kun for prøver som når den definerte OD 600 verdi eller høyere.
- Når den siste verdien er lagt inn, trykker du på "beregn" knappen nederst på skjermen. Sørg for at fremdriftslinjen på høyre gradvis endres til green. Ikke åpne regnearkfilen under beregningen prosessen.
- Eksportere de to datasettene som vises automatisk på skjermen ved avslutningen av MDT beregning inn i et regneark. Sikre at dataene omfatter: (a) MDT verdi for hver brønn som passerer minimal OD verdien test (som angitt i punkt 5.2.1.6) og (b) den første tiden punktet i intervallet hvorfra MDT ble beregnet (Start tid).
- Sett inn den nødvendige informasjonen, som vist i Figur 2:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gransker rolle enzymer av Doa10 veien i nedbrytning av en reporter substrat
For å teste gyldigheten av Gils metoden det ble sammenlignet med en tradisjonell degradering analysen. Dette forsøk vurderer det relative bidrag av komponentene i ER-membranen lokalisert Doa10 E3-ligase kompleks 20,21 til nedbrytning av proteinet kvalitetskontroll reporter substrat Deg1- VU (figur 3A). Den Deg1- VU plasmid ble integrert i villtype-celler eller i celler som mangler genet for E2 konjugerende enzym, ble UBC7 (ubc7) og proteinstabilitet deretter bestemt ved en CHX chase assay 6. Anti-FLAG immunoblotting avdekket en stabil Deg1 -VU protein band i ubc7 celler som var fraværende i villtype celler (Figur 3B). Fraværet av Deg1 -VU i villtypeceller er attributed til sin kontinuerlige fornedrelse som ble avskaffet i ubc7 celler, noe som indikerer at Deg1 -VU stabilitet er sterkt avhengig Ubc7.
Selvfølgelig er det nedbrytning av Deg1- VU rask. Imidlertid kan den relative nedbrytningshastigheten ikke bestemmes av en CHX-analysen, siden proteinet ikke påvises i vill-type-celler fra begynnelsen. Følgelig ble det nyutviklede GILS analysemetode som anvendes, for å sammenligne de relative forskjeller i kinetikken av proteinnedbrytning mellom vill-type og mutante stammer forskjellige (figur 3C). I første omgang ble det vill type, ubc6, ubc7 eller doa10 celler som uttrykker Deg1 -VU dyrket på SD komplett medium. For å måle Gils ble cellene vasket og inkubert i SD-URA. MDT beregningen ble utført som eksemplifisert i protokollen. Tall 3C, 3D viser lignende vekstkurver og beregnet MDT (~ 2,5 timer) for alle stammer dyrket i SD komplett, excluding muligheten for at delesjon av en hvilken som helst av de undersøkte gener som påvirker cellevekst. I motsetning til dette, inkubering i SD-ura resulterte i dårlig vekst av villtype-celler (MDT = 6,34), mens bare en mindre defekt vekst ble observert i de mutante stammer (MDT ~ 3 time).
Undersøkelse av effekten av forskjellige mutanter av E2 konjugerende enzym Ubc7 på degradering av Deg1- VU
Det faktum at Ubc7 er absolutt nødvendig for Deg1- VU nedbrytning muliggjør nøyaktig vurdering av selv partielle effekter av ulike E2 mutanter, siden den eksperimentelle systemets rekkevidde er svært bredt. Følgelig ble plasmider som inneholder villtype eller mutant UBC7 integrert i Ubc7 celler som uttrykker Deg1 -VU og deres bidrag til nedbrytning ble bestemt av Gils. Som forventet ble raske vekstkinetikk observert i celler som uttrykker Ubc7 med den aktive-site mutants C89S og N81A 22 (figur 4). I tillegg er to mutanter spådd å indirekte hindre Deg1 -VU nedbrytning (V25G og H94K) ble testet. Disse mutasjonene også forbedret cellevekst, sammenlignet med villtype Ubc7, om enn i mindre grad enn mutantene aktiv-site (gjennomsnittlig MDTs på 3,4 time for V25G og H94K sammenlignet med gjennomsnittet MDTs på 2,7 time for C89S og N81K) (figur 4 ). Således kan GILS fremgangsmåte anvendes for nøyaktig måling av det relative bidraget av forskjellige nedbrytningsfaktorer for stabiliteten til en reporter substrat.
Isolasjon og evaluering av nye degrons
Den GILS systemet ble også anvendt i en høy gjennomstrømning skjermformat for å identifisere nye degrons og kvantifisere deres relative potens, dvs. graden av nedbrytning som de induserer (figur 5). For å optimalisere identifisering av bona fide degrons, en ekstraseleksjonstrinnet, som er veksten i nærvær av fluororotinsyre (5-FOA), ble tilsatt. Ura3 effektivt omdanner 5-FOA inn i en toksisk forbindelse (5-fluoruracil) som kan tjene som en positiv utvelgelse for isolering av gjærstammer der URA3 blir destabilisert 16,23. For å identifisere nye degrons, ble et bibliotek av rapportør plasmider som genereres ved å fusjonere tilfeldige fragmenter avledet fra et cDNA-bibliotek til gjær URA3-GFP-plasmidet 24 (figur 5A). GFP-delen ble lagt for å muliggjøre en sekundær skjerm og gi informasjon om lokalisering av fusion degron (se diskusjon). Biblioteket ble transformert inn i gjær, så utvalgt i nærvær av 5-FOA (figur 5B), og positive kloner ble isolert og re-utsådd på agarplater i et 96-brønners plateformat. Hver koloni ble overført til 96-brønns plate, inkubert O / N, og fortynnet i en ny 96-brønners plate som beskrevet i avsnitt 2.2. Det er forventet at vekst av celler i SD-ura mediumkorrelerer med graden av ura3 uttrykk, som er resultatet av degron potens å indusere nedbrytning. Dette ble senere bekreftet ved å påføre Gils (figur 5C). Vi har bekreftet at alle tilfeldig plukket kolonier som ble forhåndsvalgt med 5-FOA viste lignende MDT verdier, på SD-LEU medium (figur 5C, tomme barer). I motsetning til dette viste alle kloner variable vekstrater på SD-ura, som var signifikant langsommere enn celler som uttrykker kontroll URA3-GFP (Data ikke vist). Som antydet, det er en invers sammenheng mellom vekstrate på SD-URA og MDT. Således, jo høyere MDT, er mer potente den degron. Faktisk er alle MDTs avledet fra positivt selekterte kloner var høyere enn den til kontrollen (over den røde linje) (Figur 5C, fylte søyler).
<strong> Tabell 1. Illustrasjon av beregning av gjær MDT. Tid enheter er timer (time). Blank og prøven er fra OD 600 leser. Transformation (Trans.) er OD 600 verdi etter blank subtraksjon og banelengde korreksjon. Logg 2 er beregnet ut fra de transformerte data. Slope er Log 2 (OD 600) verdier innenfor rad av intervaller på 10 tidspunkter dividert med tiden. 1 / Slope er den tid som er nødvendig for cellepopulasjonen til å duplisere seg selv. svart firkant markerer MDT verdi. rødt rektangel markerer tidsintervallet fra hvilken MDT ble beregnet.
| Gjær | Genotype | Source |
| TRy467 | α, his3Δ1, lys2Δ0, ura3Δ0, leu2Δ; 0 | Euroscarf |
| TRy508 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7-3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-Flag-Vma12-ura3 :: LYS, trp1-1, ubc7 Δ :: LEU2 | Denne studien |
| TRy528 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [N81A] -3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-Flag-Vma12-ura3 :: LYS, trp1- 1, ubc7Δ :: LEU2 | Denne studien |
| TRy530 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [C89S] -3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-Flag-Vma12-ura3 :: LYS, trp1- 1, ubc7Δ :: LEU2 | Denne studien |
| TRy532 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [H94K] -3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-Flag-Vma12-ura3 :: LYS, trp1- 1, ubc7Δ :: LEU2 | Denne studien |
| TRy556 | α, his3-Δ200 :: pRS303 :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-Flag-Vma12-ura3 :: LYS, trp1-1, ubc7Δ :: LEU2 | Denne studien |
| TRy563 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7-3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-Flag-Vma12-ura3 :: LYS, trp1-1, ubc7 Δ :: LEU2, ubc6Δ :: KanMX | Denne studien |
| TRy633 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [V25A] -3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-Flag-Vma12-ura3 :: LYS, trp1- 1, ubc7Δ :: LEU2 | Denne studien |
| TRy786 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7-3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-Flag-Vma12-ura3 :: LYS, trp1-1, ubc7 :: LEU, doa10Δ :: HIS3 | Denne studien |
Tabell 2. Liste over gjærstammer anvendt i denne studien.
| Plasmider benyttet i denne studien | ||
| Plasmid | Relevante markører | Source |
| pTR717 | YDpK-MET25p-Deg1-Flag-Vma12-ura3 (integrerende plasmid som inneholder LYS1) | Denne studien |
| pTR1412 | pRS315-CUP1p-URA3-HA-GFP (LEU) | Denne studien |
| Andre egnede reporter plasmider | ||
| Plasmid | Relevante markører | Source |
| pOC9-CL1 | pOC9-CUP1p-HA-URA3 (TRP1) | (17) |
| URA3-2 (GFP) | pPS414-TRP1p-MYC-ura3-2-GFP | Lewis and Pelham |
Referanse Tabell 3. Liste over plasmider brukt i denne studien. Lewis, MJ & Pelham, HR Ineffektiv kvalitetskontroll av termo proteiner på plasmamembranen PLoS One 4, e5038, doi:. 10,1371 / journal.pone.0005038 (2009).
Figur 1. Prinsipper for beregning av MDT. Try467 gjærceller ved OD 600 0,22, ble inkubert i SD komplett media for den angitte tidsperioden. OD 600 målinger ble tatt hver 15 min ~ og data ble oppsamlet på et regneark. (A) Transform OD-600-verdier fra tabell 1 plottet mot tid. (B)Tilkopling 2 av OD 600 plottet mot tid rød linje:. Markerer tidsintervallet fra hvilken MDT ble beregnet (D). (C) Gjær vekstrate (helling) ble beregnet ved å måle endringer i OD 600 påfølgende 10 tidspunkter (forutsatt linearitet) over tid Starttid:. Tiden som beregningen ble igangsatt. (D) Den nødvendige tid for gjær å fordoble er den inverse av helningen fra (C) (1 / Slope) MDT:. Den beregnede Minimal fordoblingstiden (i timer).
Figur 2. MDTcalc starte skjermen: Protokoll kapittel 5.1. Typiske inngangsverdier legges inn vises.
Figur 4. Måling relative nedbrytningsrater Deg1 -VU i Ubc7 mutante stammer Venstre:. Plot av de transformerte OD 600 verdier, målt under replikering av w ILD-type, ubc7 Δ og de indikerte Ubc7 mutanter, i forhold til tid. Celler som uttrykker Deg1 -VU ble dyrket på SD-URA medium og OD 600 ble målt hver ~ 15 min. Høyre: MDT for hver stamme ble beregnet ved hjelp MDTcalc.
1 / 52021fig5highres.jpg "width =" 500px "/>
Figur 5. En høy gjennomstrømning analyse for identifisering og isolering av nye degrons. (A) Skjematisk fremstilling av funksjonene i URA3-GFP-cDNA reporter. (B) Et flytdiagram som beskriver den eksperimentelle fremgangsmåten for isolering av gjærstammer som bærer en degron. Plasmidet biblioteket beskrevet i A ble forvandlet til Try467 celler, etterfulgt av valg på SD-Leu plater. Kolonier ble replikert til SD-Leu plater som inneholder 5-FOA og raskt voksende kolonier ble samlet og organisert på tallerkener i en sortert array. (C) Colonies uttrykker ura3-GFP-cDNA som vokste på plater som inneholder 5-FOA ble inkubert i enten SD-Leu eller SD-URA medier for 20 hr. OD 600 ble målt hvert ~ 15 min, og den minimale gjær doblingstid (MDT) ble beregnet ved anvendelse av programvaren MDTcalc Ingen degron:. Et plasmid som uttrykker GFP-URA3 uten degron, tjener som en positiv kontroll for growth rød linje:. terskel bestemt av MDT verdien for kontrollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en analyse basert på cellevekst for å bestemme relative protein nedbrytningshastigheter, kalt 'Vekstkinetikk i flytende kultur under selektive betingelser' (Gils). Den Gils analysen har flere fordeler: Det er enkelt å sette opp, datainnsamling og analyse er grei, og det er ekstremt modulær. Følgelig kan GILS påføres samtidig til flere prøver på en brukervennlig multi-brønn plate-format som kan tilpasses til automatisering for høy gjennomstrømning. Viktigst, gir svært reproduserbare GILS, kvantitative og robuste data og er mer fleksibel enn agar-plate-baserte vekstmålinger som selekterer for positiv / negativ vekst. I tillegg er Gils svært følsom i at det kan oppdage små variasjoner i proteinnedbrytningshastigheter eller steady-state nivåer, gjenspeiler aktiviteten til relevante UPS komponenter eller degrons. Endelig Gils analyser krever betydelig kortere vekstperioder (<12 timer) sammenlignet med growth-analyser på agarplater (vanligvis 2-4 dager).
Mens GILS analysen er svært nyttig for å studere proteindegradering, bør flere viktige hensyn tas i betraktning. For eksempel er det viktig å benytte en gjærstamme isogene bakgrunnen på grunn av stammespesifikke vekstegenskaper. Videre, for å fastslå assay gyldighet, hver analyse bør gjentas minst tre ganger under identiske betingelser, aller viktigst, den initielle celle tetthet (OD 600), veksttemperatur, og cellekultur risting intensitet skal ikke forandres. Det anbefales derfor at det spesifikke analyseprotokollen er lagret i mikroplateleser programvare for gjentatte anvendelser. En ekstra variabel som bør vurderes er hvor degron er posisjonert innenfor ura3. Som degron stilling kan bestemme dens funksjon, ved å plassere enten C 'eller N' regioner må testet empirisk.
Kalibrering av reporter protein uttrykksnivå er også avgjørende for vellykket bruk av Gils. En optimal reporteren er en som er effektivt nedbrutt av systemet som undersøkes, og dermed overfører uracil auxotrofi. Men variasjoner i auxotrofi bør også trofast speile reporter stabilitet. Dette kan bestemmes empirisk ved testing av de forutgående korrelasjon mellom rapportørproteinnedbrytningshastighet, som bestemmes av ytterligere biokjemiske metoder, og MDT-verdier, bestemt ved GILS (figur 3B). Et vanlig problem oppstår når den basale steady-state ekspresjon av et reporter ikke når et terskelnivå og er således for lav til å muliggjøre vekst på SD-ura, selv når den er helt stabilisert. Et slikt problem kan overvinnes ved å plassere rapportør ekspresjon under kontroll av en induserbar promoter som øker basal protein ekspresjon uten å påvirke degradering. Arrangøren aktivitet i slike systemer bør være fint kalibrert for å unngå permanent vekst på SD-URA grunn high proteinnivåer og reporter enzym aktivitet selv når den er delvis degradert. De promotorer og ekspresjonsvektorer betingelser som er beskrevet i denne studien ble utvalgt fordi de tillater følsom regulering av proteinekspresjon: MET25p CUP1, og p er metabolitt-induserte aktiviteten av promotorer som kan bli finjustert ved kontroll av metionin og kobber, henholdsvis (tabell 3).
Kvalitetskontrollrapportør substrater (for eksempel de som er beskrevet i denne studien) kan danne intracellulære aggregater som kan sekvestrerer URA3 og hindrer dens funksjon. I et slikt tilfelle uracil auxotrofi kan bli feilaktig tolkes som resultatet av proteindegradering. For å teste forskjellige degrons tendens til å aggregere, bør en ytterligere reporter anvendes. For eksempel URA3-GFP reporter utformet for degron skjermen (figur 5A), muliggjør visualisering av intracellulære aggregater av fluorescerende mikroskopi av cellene vokser i presence av 5-FOA. Disse aggregater vises som tette foci som GFP klart kan skilles fra det diffust utseende av det oppløselige protein (data ikke vist). URA3-GFP-degron reporter kan på lignende måte anvendes for å bestemme effekten av protein degron på co-lokalisering og subcellulære fordeling. Den kan også anvendes for å følge nedbrytingen av utvalgte substrater ved strømningscytometri, som en sekundær skjerm 25.
En mest betydelige fordel av GILS metoden er at det er tilstrekkelig fleksibelt og kan således lett tilpasses til en rekke anvendelser i tillegg til dem som er beskrevet i det foreliggende. For eksempel kan fremgangsmåten også brukes for behandlingen av egnethet av proteasomet under forskjellige betingelser. I dette tilfellet er en ikke-ubiquitylated proteasom-substrat slik som ornitin-dekarboksylase (ODC) er kondensert til URA3. Fremgangsmåten kan også teste proteindegradering i forskjellige intracellulære kamre når en bestemt lokaliseringssignal blir anvendt.I denne studien Vma12 forankret reporteren til ER-membranen (figurene 3, 4). På samme måte kan en kjernefysisk lokaliseringssignal (NLS), ER oppbevaring signal (KDEL) eller cytosol (fravær av et bestemt signal) benyttes. Et system muliggjør samtidig analyse av protein nedbrytning i ulike intracellulære kunne ha betydelig innflytelse på vår forståelse av hvordan protein nedbrytnings nettverk opererer. Endelig, kan prinsippene for den valgmetoden anvendes på forskning av proteindegradering i andre modellcellebaserte systemer, fra bakterier til humane celler, som alle krever URA3-genet produkt for overlevelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Difco yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate | BD Biosciences | 233520 | For yeast growth on SD minimal media. Amino acids to be supplied are: Arginine, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, Methionine, Phenylalanine, Threonine, Tryptophan |
| Ammonium sulfate | Sigma - Aldrich | A4418 | |
| Glucose | Sigma - Aldrich | 16325 | |
| Adenine | Sigma - Aldrich | A8626 | |
| Uracil | Sigma - Aldrich | U0750 | |
| Amino acids | Highest purity available | ||
| 96-well plates | Nunc | 167008 | Any other compatible brand can be used |
| Cyclohexamide | Sigma - Aldrich | C7698 | Working conc. 0.5 mg/ml |
| Infinite 200 PRO series | Tecan | For yeast incubation and OD600 measurements. Any other compatible temp-controled reader can be used. | |
| MDTcalc | Experimental software |
References
- Hershko, A., Ciechanover, A.
- Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 679-689 (2008).
- Willems, A. R., et al. SCF ubiquitin protein ligases and phosphorylation-dependent proteolysis. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 354, 1533-1550 (1999).
- Tyers, M., Jorgensen, P. Proteolysis and the cell cycle: with this RING I do thee destroy. Curr Opin Genet Dev. 10, 54-64 (2000).
- Johnson, P. R., Swanson, R., Rakhilina, L., Hochstrasser, M. Degradation signal masking by heterodimerization of MATα2 and MAT a1 blocks their mutual destruction by the ubiquitin-proteasome pathway. Cell. 94, 217-227 (1998).
- Furth, N., et al. Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope. Molecular Biology of the Cell. 22, 4726-4739 (2011).
- Fredrickson, E. K., Gallagher, P. S., Clowes Candadai, S. V., Gardner, R. G. Substrate recognition in nuclear protein quality control degradation is governed by exposed hydrophobicity that correlates with aggregation and insolubility. J Biol Chem. 10, (2013).
- Rosenbaum, J. C., et al. Disorder Targets Misorder in Nuclear Quality Control A Disordered Ubiquitin Ligase Directly Recognizes Its Misfolded Substrates. Molecular cell. 41, 93-106 (2011).
- Ciechanover, A., Hod, Y., Hershko, A. A heat-stable polypeptide component of an ATP-dependent proteolytic system from reticulocytes. Biochemica., & Biophysical Research Communications. 81, 1100-1105 (1978).
- Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
- Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. Cell wall construction in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 23, 185-202 (2006).
- Zhou, W., Ryan, J. J., Zhou, H. Global analyses of sumoylated proteins in Saccharomyces cerevisiae. Induction of protein sumoylation by cellular stresses. J Biol Chem. 279, 32262-32268 (2004).
- Alani, E., Kleckner, N. A new type of fusion analysis applicable to many organisms: protein fusions to the URA3 gene of yeast. Genetics. 117, 5-12 (1987).
- Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation. Genes Dev. 15, 2660-2674 (2001).
- Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. EMBO J. 25, 533-543 (2006).
- Gilon, T., Chomsky, O., Kulka, R. G. Degradation signals for ubiquitin system proteolysis in Saccharomyces cerevisiae. Embo J. 17, 2759-2766 (1998).
- Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast 2 repressor. Cell. 61, 697-708 (1990).
- Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. J Biol Chem. 283, 32302-32316 (2008).
- Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. 194, Academic Press. (1991).
- Carvalho, P., Goder, V., Rapoport, T. A. Distinct ubiquitin-ligase complexes define convergent pathways for the degradation of ER proteins. Cell. 126, 361-373 (2006).
- Denic, V., Quan, E. M., Weissman, J. S. A luminal surveillance complex that selects misfolded glycoproteins for ER-associated degradation. Cell. 126, 349-359 (2006).
- Wu, P. Y., et al. A conserved catalytic residue in the ubiquitin-conjugating enzyme family. Embo J. 22, 5241-5250 (2003).
- Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. 5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics. Methods Enzymol. 154, 164-175 (1987).
- Alfassy, O. S., Cohen, I., Reiss, Y., Tirosh, B., Ravid, T. Placing a disrupted degradation motif at the C terminus of proteasome substrates attenuates degradation without impairing ubiquitylation. J Biol Chem. 288, 12645-12653 (2013).
- Cronin, S. R., Hampton, R. Y. Measuring protein degradation with green fluorescent protein. Methods in Enzymology. 302, 58-73 (1999).
