Summary
organoids קריפטה מעי הדק תרבית ex vivo לספק מערכת תרבית רקמה שמשחזרת צמיחה של מאורות תלויים בתאי גזע והנישה שלהם. הקמנו שיטה לassay הפרופיל המטבולי בזמן אמת בorganoids קריפטה עכבר העיקרי. מצאנו organoids לשמור על מאפיינים פיסיולוגיים שהוגדרו על ידי המקור שלהם.
Abstract
רירית המעי הקטנה מציגה ארכיטקטורה חוזר על עצמו מחולק לשני מבנים בסיסיים: villi, מקרינים לתוך חלל המעי ומורכב מenterocytes הבוגר, תאי גביע ותאי enteroendocrine; ובכוכים, המתגוררים הפרוקסימלי לsubmucosa וmuscularis, חסת גזע בוגרים ובתאים ותאים הבוגר פנט, כמו גם סטרומה ותאי חיסון של מייקרו-סביבת קריפטה. עד השנים האחרונות, במחקרי מבחנה של מעי דק היה מוגבל לשורות תאים שמקורם בגידולים או שפיר או ממאיר, ואינו מייצג את הפיסיולוגיה של אפיתלים מעיים רגילים ואת השפעתם של מייקרו-הסביבה שבה הם מתגוררים. הנה, אנחנו מדגימים שיטה המותאמת מאל סאטו ואח. (2009) לculturing organoids קריפטה העיקרי מעיים עכבר נגזר מעכברי C57BL / 6. בנוסף, אנו מציגים את השימוש בתרבויות organoid קריפטה לassay הפרופיל המטבולי קריפטה בזמן אמת על ידי מדדment של הצריכה בסיסית חמצן, קצב glycolytic, ייצור ATP ויכולת נשימה. Organoids לשמור על מאפיינים שהוגדרו על ידי המקור שלהם ולשמר היבטים של ההסתגלות המטבולית שלהם באו לידי ביטוי בצריכת חמצן ושיעורי החמצה תאיים. מחקרים מטבוליים בזמן אמת בorganoid מערכת תרבות קריפטה זה הם כלי רב עוצמה כדי לחקור את חילוף החומרים של אנרגיית organoid קריפטה, ואיך זה יכול להיות מווסת על ידי גורמים תזונתיים ותרופתיים.
Introduction
סרטן מעי גס (CRC) הוא הגורם המוביל השלישי של מקרי מוות מסרטן הקשורים בארצות הברית. סרטן מעי גס לא סדיר - כלומר, שנובע מאוחר יותר בחיים (> 50 שנים) וללא גורמים גנטיים לנטייה ברורה - חשבונות ל~ 80% מכל המקרים, עם שכיחות מאוד מושפעות דפוסי תזונה ארוך טווח 1,2. גידולים אלה תערוכת משמרת חילוף חומרים לכיוון התלות בגליקוליזה חמצוני, הידוע בשם האפקט ורבורג, שעשוי בחלק לעשות ריכוזים גבוהים יותר של בלוקים סלולריים בניין זמינים ואנרגיה (באמצעות glutaminolysis) להתיר ואולי לנהוג שיעור גבוה של תאים סרטניים התפשטות 3-5 . מחקרים של סרטן המעי הגס, כמו גם סוגי סרטן אחרים במערכת העיכול, כולל סרטן המעי דק מספקים תובנה חשובה לסיבת היווצרות גידול. חוקר את ההבדלים מטבוליים בין מדינות נורמליות, פרו-סרטניות וסרטניות של מערכות איברים במערכת העיכול עשוי לסייע determination של סיכון יחסי להתפתחות גידולים, כמו גם גילוי המוקדם של גידולים. יתר על כן, הבנת חילוף חומרים ביו-אנרגטיים הכוללים נשימה וגליקוליזה המיטוכונדריה תספק תובנה בסיסית לתוך איך מדינת פיזיולוגיה של תא, הזדקנות והמחלה מדאיגה את הומאוסטזיס מעיים. ניצול של טכנולוגית assay ביו-האנרגיה לניתוח שטף תאי יכול להעריך את השיעורים של נשימה וגליקוליזה המיטוכונדריה בו זמנית בתאי גידול בתרבות בזמן אמת 6,7.
עד לאחרונה, מחקרים במבחנה של מעי דק היו מוגבלים לשורות תאים שמקורם בגידולים או שפיר או ממאיר 8,9 ואינו מייצגים את הפיסיולוגיה של אפיתלים מעיים רגילים ואת השפעתם של מייקרו-הסביבה שבה הם מתגוררים. בשינה 2009, סאטו et al. 10 הציג מערכת ex vivo תרבות לגדול organoids אפיתל במעי עכבר תלת-ממדי (3D), או epith"מיני-אומץ" elial, מתאים לחקירות ניסיוניות, אבחון וטיפול 10,11. יתר על כן, מאורות מבודדים מעכברים מוגבלים calorically לשמור על מאפייני הצמיחה שינו כorganoids בתרבויות כגון 12. בהשוואה לשורות תאים הפכו, ניתן להשתמש תרבויות organoid קריפטה להפיק נתונים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית הצגת מודל הרבה יותר טוב כדי להבין את מצב in vivo.
מתאמנים את טכנולוגיית ניתוח ביו-אנרגיה לassay חילוף חומרים של אנרגיה של organoids קריפטה מעיים. organoids קריפטה המעיים העכבר היה בתרבית ex vivo לפתח מחקרי חילוף חומרים של אנרגיית קריפטה organoid הוצגו. שיעור צריכת החמצן (OCR) והמחיר תאי החמצה (ECAR) של organoids קריפטה נמדדו בהעדר ונוכחותם של שני מעכבים שונים חילוף חומרים (oligomycin, rotenone) ונושאת יון (ציאניד-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone קרבוניל). Orga קריפטהתגובה המטבולית noid לתרכובות כימיות אלה באו לידי ביטוי בהצלחה באמצעות ECAR משתנה וערכי OCR.
מחקרים ביו-אנרגטיים תאיים יבהירו את יחסי הגומלין ההדדיים בין מצב מטבולים וסיכון למחלות ופנוטיפ בסרטן, השמנת יתר, סוכרת, הפרעות בחילוף חומרים ומחל מיטוכונדריאליות ולעזור שיטות הקרנה מראש עם השלכות ישירות על רפואת translational. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לבודד את מאורות מעי דקים וorganoids קריפטה התרבות. יתר על כן, אנו מציגים שיטה חדשה לשימוש תרבויות organoid קריפטה למבחנים מטבולים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקר זה בוצע בהתאם להמלצות במדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה של המכון הלאומי לבריאות. הפרוטוקול אושר על ידי הוועדה לאתיקה של ניסויים בבעלי חיים של אלברט איינשטיין קולג 'לרפואה.
1. בידוד קריפטה ותרבות
- בידוד של מאורות מהמעי הדק:
- לבודד מאורות מעיים מכל מודל עכברים של עניין. להרדים את העכברים עם CO 2 ואחריו נקע בצוואר הרחם.
- פתח את בטן אורכית ולמלא את המעי דק (SI) עם פוספט הקר כקרח שנאגרו, PBS (-Ca 2 +; -Mg 2+) עם (אנטי-אנטי) אנטיביוטיקה antimycotic 2x. מהירות לבודד מעי דק.
- ביסודיות לנתח ללא שומן mesenteric באמצעות אזמל. היזהר שלא לנקב את הרקמה - בכל העת לשמור על הרקמה לחה עם PBS הקר כקרח. פתח את inteStine אורכית ולשטוף ביסודיות עם קרח הקר PBS.
- חותך מעי דק לשני חלקים ולרדד באמצעות קצה צמר גפן רטוב, בעדינות לגרד את villi באמצעות שקופיות מקוררות מראש. לשטוף במרץ כמה פעמים PBS קר כקרח.
- דגירה 3 דקות ב 20 מיליליטר 1x PBS לכל חומצת ethylenediaminetetraacetic 3 מ"מ (EDTA) /0.5 dithiothreitol מ"מ (DTT) לניתוק אינו אנזימטית של הרקמה.
- חיתוך ברקמה לחתיכות קטנות (2-4 מ"מ) באמצעות סכין גילוח בשקופית מקורר מראש. העבר את החתיכות לתוך צינור 50 מיליליטר המכיל 20 מיליליטר קר PBS קרח.
- פיפטה מעלה ומטה בעדינות 10x באמצעות פיפטה חד פעמית סטרילי 10 מיליליטר. בואו ברי רקמה משקעים על ידי כוח הכבידה. הסר את supernatant עם טפטפת. חזור שלוש פעמים נוספות; להפוך את supernatant בטוח הוא ברור.
- להוסיף 20 מיליליטר של PBS לכל 2 מ"מ EDTA. מערבולת ודגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם נדנדה עדינה.
- בואו משקעי רקמות ולהשליך supernatant. להוסיף 15 מיליליטר קרח PBS ופיפטה הקריםלמעלה ולמטה 5x עם פיפטה 10 מיליליטר. בואו ברי רקמת משקעים ולאסוף את supernatant כבר 1 (F1). חזור על איסוף F2-F5, כל חלקן בנפרד.
- להוסיף 15 מיליליטר קרח הקר PBS ולרעוד הפעם במרץ ביד במשך 15 שניות. לאסוף F6 ולחזור לF7, F8. אם חתיכות רקמה מתחילות לצוף, הקש כדי לעזור להם להתיישב.
- בדוק aliquot של כל חלק מתחת למיקרוסקופ. בריכת שברים המכילים כוכים.
- להעביר את השברים ונקוו דרך מסננת תא ניילון 70 מיקרומטר, איסוף מאורות בשפופרת 50 מיליליטר.
- צנטריפוגה בלמשך 5 דקות 100 XG ב 4 מעלות צלזיוס, זורקת את כדור supernatant וגלול ב-10 PBS קר כקרח מיליליטר עם מאורות אנטי-אנטי והעברת 2x לצינור 15 מיליליטר. חזור על לשטוף עוד פעם אחת.
- שטוף את מאורות פעם אחת עם 10 מיליליטר ADF קר כקרח, מתקדם DMEM / ("נשר בינוני / חם של שינוי" Dulbecco של F-12) F-12 - 2x אנטי-אנטי.
- שטוף את מאורות פעם אחת עם 10 מיליליטרDF - 1x אנטי-אנטי.
- לספור את מאורות באמצעות hemocytometer. התאם את קריפטה פתרון הנפח ומעביר לצינור 1.5 מיליליטר, כך שריכוז קריפטה הסופי כאשר resuspended יהיה 100-500 מאורות לכל 50 μl של תערובת דביקה חלבון (Matrigel). צנטריפוגה בלמשך 5 דקות 100 XG ב 4 מעלות צלזיוס ומאורות גלולים בתערובת החלבונים הדביקה.
- צלחת 50 μl של קריפטה - השעיה תערובת חלבונים דביקה לכל גם בצלחת 24 גם (אזור גידול: 2 סנטימטר 2), הצבה בזהירות טיפת ההשעיה במרכז כל אחד. לשמור את הצלחת בCO 2, 37 ° C חממה ל~ 30 דקות עד שההשעיה מתמצקת.
- הוסף 500 מדיה μl תרבות השלמה קרה כקרח (מתקדם DMEM / F12 עם אנטי 1x - אנטי, 10 מ"מ 4 (2-hydroxyethyl) חומצת -1-piperazineethanesulfonic (HEPES), 1x Glutamax, מוסף 1x B27, מוסף 1x N2, 1 מ"מ N-Acetyl-L-ציסטאין ng / ml (NAC), 50 ng / ml גורם גדילה באפידרמיס (EGF), 100גולגולת של, R-Spondin 500 ng / ml).
- מחדש גורמי גדילה ב0.1% הסרום אלבומין שור (BSA) ב- PBS.
- קריפטה Organoid תרבות ומעבר:
- organoids קריפטה לאחר זריעת 14-21 יום מעבר (או לפי צורך) באופן הבא:
- תקשורת שינוי בכל יום שישי וביום שני. בימי רביעי, להחליף מחצית התקשורת עם תקשורת טרי.
- הסר את מדיום התרבות. לשטוף את המדגם פעמיים עם 500 μl PBS ב 5 דקות במרווחים.
- הסר PBS ועדינות לשבור את תערובת חלבונים הדביקה באמצעות קצה פיפטה מייקר P1000 סטרילי.
- הוסף מדיה תרבות 1 מיליליטר מלאה וליחיד וresuspend organoids ב 1 מיליליטר תקשורת.
- בעדינות לשבש organoids באמצעות P1000 על ידי pipetting למעלה ולמטה 20-30x (לבדוק מתחת למיקרוסקופ לניתוק organoid נכון עם תשואת קריפטה טובה עד שיטה עקבית מפותח).
- העבר את המאורות לצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge;צנטריפוגות ב 100 XG ב 4 מעלות צלזיוס, 5 דקות.
- שטוף את הכדור פעמיים עם 1 מיליליטר תקשורת ותרבות שלמה.
- פיצול ביחס של 1: 3 או 1: 6 במידת צורך מאורות resuspending, ב -50 μl Matrigel לכל טוב. המשך כפי שתואר לעיל (סעיף 1.1.16-18).
- organoids קריפטה לאחר זריעת 14-21 יום מעבר (או לפי צורך) באופן הבא:
- הקפאת Organoid קריפטה:
- הסר את מדיום התרבות. לשטוף את המדגם ב500 μl PBS.
- לפזר את תערובת חלבונים הדביקה באמצעות קצה פיפטה P1000.
- הוסף 1 מיליליטר תקשורת ולאחת וresuspend organoids ב 1 מיליליטר תקשורת.
- בעדינות לשבור את organoids באמצעות P1000 על ידי pipetting למעלה ולמטה 20-30x.
- העבר את organoids לצינור 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה ב 100 XG ב 4 מעלות צלזיוס, 5 דקות.
- שטוף את הכדור פעמיים עם 1 מיליליטר תקשורת ותרבות שלמה.
- מאורות גלולים ב500 μl הקפאת תקשורת.
- העברת מאורות לcryotube, במקום הצינור במכל וחנות הקפאה ב-80 ° C מקפיא overnight.
- העבר את הכוכים לN 2 טנק נוזלי.
- לשחזר organoids קריפטה קפואה במהירות הפשרה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. לשטוף עם 500 μl מדיה מלאה תרבות אחת, צנטריפוגות ב 100 XG, 5 דקות וגלולות בתערובת חלבונים דביקה, ותרבות כפי שתואר לעיל. להתאוששות טובה יותר, להוסיף מעכב רוק (Y-27632) לתקשורת ההקפאה.
2. קריפטה Organoid מטבוליזם Assay
- הכנת צלחת 24 גם:
- לבודד ולספור מאורות בהתאם לפרוטוקול (ראה סעיף 1.1 לבידוד קריפטה וסעיף 1.2 למעבר קריפטה).
- מאורות גלולים בתערובת חלבונים דביקה (100-200 מאורות לכל 20 μl).
- השעיה צלחת קריפטה-דביקה תערובת חלבונים בצלחת 24 גם assay (לוודא שיש בtriplicates לפחות עבור כל דגימה) ולאפשר ההשעיה לבסס על 37 מעלות צלזיוס בCO 2חממה; לאחר מכן להוסיף 500 μl תקשורת ותרבות השלמה.
- מאורות תרבות (כמפורט בסעיף 1.1) ולבחון תחת מיקרוסקופ עד מאורות לגדול לתוך organoids פותח באופן מלא.
- תאי השטף Assay:
- מחסנית מימה הלילה ב2 אינם CO (0% CO 2), 37 ° C חממה.
- הסר את מדיום התרבות ולשטוף organoids פעמיים עם 500 DMEM μl (בלי: גלוקוז, L- גלוטמין, פירובט נתרן וסודיום ביקרבונט, ועם: פנול אדום). חכה 5 דקות.
- להוסיף 675 μl לבינוני גם assay (DMEM עם 2 המ"מ L- גלוטמין ו5 מ"מ D-גלוקוז) זה טוב.
- בדוק המורפולוגיה המיקרוסקופית organoids קריפטה כדי להבטיח שorganoids ותערובת החלבונים הדביקה לא ניזוקו לאחר שטיפה. דגירה 1 שעה שבאינו CO 2, 37 ° C חממה.
- הכן 10 מיקרומטר תרכובות להזרקה (oligomycin, קרבוניל ציאניד-p-trifluoro-פניל-hydrazone methoxy (FCCP), rotenone) במדיום assay.
- הגדרת המחסנית על ידי טעינת 75 μl של 10 מיקרומטר תרכובות להזרקה ליציאות ברצף המחסנית: נמל - oligomycin; הנמל B - FCCP; והנמל C - rotenone (הריכוזים הסופיים במהלך assay יהיה 1 מיקרומטר).
- דגירה דקות 30 מחסנית - שעת 1 ב 37 ° C בחממת 2-CO שאינה.
- במקביל, מפעיל את מנתח XF וליצור תבנית פרוטוקול assay.
- הנח מחסנית וצלחת שירות לXF Analyzer ולהפעיל "לכייל" מחסנית.
- בדוק organoids קריפטה מיקרוסקופית כדי לוודא שהם מחוברים לתערובת החלבונים הדביקה.
- צלחת תרבית תאי עומס לפרוטוקול assay המכשיר ולהפעיל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
organoids קריפטה הוקמו מ8 חודש C57BL / 6 עכברים ישנים האכיל מטוהר דיאטה מכרסם מכון לתזונת 76A (AIN76A) אמריקאי. ניתן לגדל organoids קריפטה מעיים בתרבות לפרקי זמן ארוך מכוך בודד (איור 1 א, חץ אדום יחיד). Organoids לצמוח מתוך מבנים דמויים מערים ב18-20 ימים בתרבות (איור 1, חיצים אדומים). מאורות היו passaged כל 3 שבועות וorganoids יעילות התאוששו לאחר כל מעבר.
מכשור ביו-אנרגית סוסון ים יכול להעריך את שיעורי הנשימה וגליקוליזה המיטוכונדריה בו זמנית בתאי גידול בתרבות בזמן אמת. מתאמנים בטכנולוגיה זו כדי assay חילוף חומרים organoid קריפטה. עם organoids נגזר מהדיאטה AIN76A עכברים שהוזנו מטוהרת במשך 8 חודשים, מדדנו:. 1 שיעור צריכת חמצן, OCR שמוצג באיור 2 א - קו אדום מייצג את שיעור חמצן הצריכה (pmol / min) בorganoids קריפטה, כחול הוא הבארות שליטת דואר רק עם Matrigel (תערובת חלבונים הדביקה); 2. שיעור תאי החמצה (ECAR) שמוצג באיור 2 ב - קו אדום מייצג את השיעור תאי החמצה (MPH / min) בorganoids קריפטה, כחול הוא בארות שליטה רק עם תערובת החלבונים הדביקה.
איור 1:. Organoids קריפטה נגזר מ8 חודשים C57BL / 6 עכברים ישנים מאורות הם () 2-ימים או (ב) 18 ימים בתרבות. Scale: 100 מיקרומטר.
איור 2: assay ביו-אנרגיה באמצעות organoids נגזר מ8 חודשים C57BL / 6 עכברים ישנים. (א) שיעור צריכת חמצן (OCR) הוא מוצג;
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בדקנו את שיעור צריכת חמצן (OCR) והמחיר תאי החמצה (ECAR) של מאורות מבודדים מעכברים בן 8 חודשים וגדלו והפכו לorganoids ex vivo. לאחר המדידה של קצב הבסיסי, חילוף החומרים קריפטה הוערך על ידי הוספת oligomycin, ציאניד קרבוניל -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) וrotenone, ברצף.
הסל OCR וECAR הבסיסי נרשמו 0-29 דקות (איור 2 א ו -2 ב). בדקות ה -29, oligomycin (מנמל) הוזרק לכל אחד גם (n = 3, עבור שני מאורות ובארות שליטה). Oligomycin הוא מעכב סינתזת ATP. הוא משמש כדי למנוע מצב 3 נשימה (phosphorylating). כך, oligomycin ההזרקה הביאה להפחתה קלה בOCR, בשל מצור של סינתזת ATP במיטוכונדריה, והמאורות עברו לגליקוליזה כדי לענות על הדרישה שלהם ל- ATP וכתוצאה מכך עלייה בECAR. בדקות ה -64, FCCP (הלוך ושובמ 'יציאת B) הוזרק לכל אחד. FCCP היא נשאית יון ניידת, הובלת יוני מימן על פני קרום המיטוכונדריה, שמובילה לצריכת אנרגיה מהירה ללא הצורך בדור ה- ATP. OCR מוגבר בשל מתיר וECAR גדל מאז המאורות נשמרו מאזן האנרגיה שלהם על ידי שימוש בגליקוליזה לייצר ATP, וכך הסינתזה והפרשת חומצה לקטית. בדקות ה -99, rotenone (מC הנמל) הוזרק לכל אחד. Rotenone הוא מעכב של המיטוכונדריה. כך, הזריקה השלישית הביאה לירידה בOCR בשל תפקוד המיטוכונדריה פגום והעבירה את הכוכים למדינת glycolytic יותר שמירה על ערכי ECAR גבוהים.
ישנן שתי מסקנות עיקריות: 1) organoids קריפטה מעכברים בן 8 חודשים היו בתרבית בהצלחה דרך מעברים מרובים; 2) organoids שpassaged בתרבות במשך 2 חודשים לאחר הגזירה הציגה תגובה המטבולית לoligomycin, ציאניד-p-trifluoromethoxyphen קרבוניל ylhydrazone וrotenone. כך, יכולת glycolytic של organoids הייתה יציבה אחרי 2 חודשים בתרבות, בקנה אחד עם הדו"ח שorganoids מעכברים מוגבלים calorically הם יחסית קבוע מותאמים לצמיחה שונה ופנוטיפים חילוף חומרים בתרבות 12.
הפרוצדורות מתוארות בפרוטוקול זה תהיה בעל חשיבות רבה במחקרי חילוף חומרים של מאורות מעיים. הפרוטוקול לבידוד קריפטה מותאם אל סאטו ואח. 10 הפרוטוקול ללימוד חילוף החומרים קריפטה בתרבויות קטנות מעיים קריפטה organoid באמצעות ביו-אנרגית טכנולוגית ניתוח לא דווחה. ניתן להאריך את לימודי חילוף החומרים organoid קריפטה מציגים נוסף משתנים שונים לתקשורת והתרבות ותנאי assay, כגון מקורות שונים של אנרגיה, מעכבים ומפעילים של איתות ספציפית ומסלולים המטבוליים, ותנאי חוסר חמצן שעשוי לווסת מסלולים המטבוליים.
ontent "> ישנן בעיות טכניות הדורשות תשומת לב מיוחדת בעת החלת הפרוטוקולים הללו. מספר קריפטה ויעילות הצמיחה של תרבויות organoid קריפטה עשוי להשתנות בהתאם למקור קריפטה, למשל מאורות משינוי גנטי לעומת עכברים מסוג בר. כך, צפיפות זריעת קריפטה יכולים להיות מותאם לניסויים על ידי הפעלת ניסוי. בנוסף, יש לי מאורות וorganids נטייה חזקה להיצמד למשטחים. לתשואות טובות יותר, כל הצינורות (1.5 מיליליטר, 15 מיליליטר, וצינורות 50 מיליליטר), טפטפות, טיפים ועצות פיפטה יכולים להיות מצופה עם 1% בסרום שור העובר שבנאגר מלוח פוספט ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. יכולות להיות מנורמלות תוצאות לסך ריכוז חלבון באמצעות חומצת bicinchoninic assay (BCA). לאחר assay חילוף החומרים, צלחת 24 גם היא שמרה על קרח עד BCA assay. עבור assay BCA, מאורות נשטפים בעדינות ב500 μl הקר PBS שלוש פעמים וlysed ב -75 μl 0.1 N NaOH בPBS ואחריו נמרץ רעד במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר. יכולה פיפטה P1000להשתמש בהם כדי לשבור את תערובת חלבונים הדביקה וpipetting למעלה למטה מקדם תמוגה. לאחר תמוגה קריפטה, ניתן בעקבות פרוטוקול assay BCA הסטנדרטי לתאים. חשוב לי "רק Matrigel" בארות שליטה בכל הניתוח ביו-האנרגיה כדי למדוד את ריכוז חלבון רקע בבארות אלה ובכך להעריך את ריכוז חלבון קריפטה בצורה מדויקת על ידי assay BCA.מחקרי חילוף חומרים organoid קריפטה הציגו יכולים להיות מיושמים על מיני-אומץ האפיתל נורמלי ומטופל נגזר לחקור את הכלי להערכה מוקדמת של סיכון למחלות יחסי וגישות שיכולות לווסת את הפנוטיפ חילוף חומרים ובכך להקטין את הסיכון. מבחני חילוף החומרים המתוארים כאן להציג אסטרטגיות חדשות להערכה אפשרית של סיכון יחסי להתפתחות מחלה ולגילוי מוקדם של מצב מחלה, לנתיחה ביוכימי והמולקולרית שלו ואפנון פוטנציאלי. לסיכום, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לבודד intestina הקטןמאורות l וorganoids קריפטה התרבות. בנוסף, אנו מציגים שיטה חדשה לשימוש קריפטה organoid תרבות לקביעת תעריפי החמצה וצריכת חמצן תאיים ללמוד חילוף החומרים של אנרגיית organoid קריפטה. Ex vivo קריפטה organoid חילוף חומרים תרבות פרופיל מחקרים יגדירו אסטרטגיות חדשות להבנת ביולוגיה של המעיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין גילויים.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מענקי RO1 CA 135,561, R01 CA151494, R01 CA174432 וP3013330 מהמכונים הלאומי לבריאות.
ברצוננו להודות למישל יוסטון, אלנה Dhima וד"ר אנה Velcich על הערותיהם מועילות בפיתוח פרוטוקול בידוד קריפטה.
אנו מודים גם להדרכת הסוכרת ומרכז המחקר של אלברט איינשטיין קולג 'לרפואה נתמך על ידי NIH P60DK20541, וד"ר מיכאל בראונלי וד"ר Xue-יאנג Du, שינחה ויפעיל את מתקן סוסון הים, בהתאמה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Matrigel Basement Membrane Matrix, GFR, Phenol Red-free, LDEV-free | BD Biosciences | 356231 | |
| PBS (phosphate buffered saline), no magnesium, no calcium, pH 7.2 | Life Technologies | 20012-027 | |
| Advanced DMEM/F-12 (1x) | Life Technologies | 12634-028 | |
| Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium w/o glucose, L-glutamine, phenol red, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | D5030 | |
| Phenol red sodium salt | Sigma-Aldrich | P4758 | Final Concentration 15 mg/l in DMEM (D5030) - step 2.2.2 |
| Antibiotic-Antimycotic, 100x, 100 ml | Life Technologies | 15240-062 | Final concentration 1x or 2x |
| Penicilin-Streptomycin, liquid | Life Technologies | 15140-122 | Final concentration 1x |
| Gibco® GlutaMAX™ supplement | Life Technologies | 35050061 | Final concentration 1x |
| Gibco® HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid), 1 M | Life Technologies | 15630-080 | Final concentration 10 mM |
| N-acetyl-L-cysteine, 25 g | Sigma-Aldrich | A9165-25G | Final concentration 1 mM |
| 100x N-2 supplement, liquid | Invitrogen | 17502-048 | Final concentration 1x |
| 50x B-27® supplement minus Vitamin A, liquid | Invitrogen | 12587-010 | Final concentration 1x |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1, CF, 50 μg | R&D Systems | 3474-RS-050 | Final concentration 500 ng/ml |
| Recombinant Murine EGF, 100 μg | Peprotech | 315-09 | Final concentration 50 ng/ml |
| Recombinant Murine Noggin, 20 μg | Peprotech | 250-38 | Final concentration 100 ng/ml |
| Gibco® L-glutamine, 200 mM | Life Technologies | 25030-081 | Final concentration 2 mM |
| Gibco® glucose powder | Life Technologies | 15023-021 | Final concentration 5 mM |
| Ambion® 0.5 M EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), pH 8.0 | Life Technologies | AM9260G | Final concentration 3 mM for step 1.1.5; 2 mM for step 1.1.8 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DTT (dithiothreitol), 1M | Life Technologies | P2325 | Final concentration 3 mM |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | 0.1% in PBS |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | 1% in PBS |
| Recovery™ Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| ROCK inhibitor (Y-27632) | Sigma-Aldrich | Y0503 | Final concentration 10 μM |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | Final concentration 1 μM |
| Carbonyl cyanide-p-trifluoro-methoxy-phenyl-hydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | Final concentration 1 μM |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Final concentration 1 μM |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | Final concentration 0.1 N in PBS |
| XF24 Extracellular Flux Analyzer (XF Analyzer) | Seahorse Bioscience |
References
- Jemal, A., et al. CA Cancer J Clin. 58, 71-96 (2008).
- Slattery, M. L., Boucher, K. M., Caan, B. J., Potter, J. D., Ma, K. N. Eating patterns and risk of colon cancer. Am J Epidemiol. 148, 4-16 (1998).
- Warburg, O.
- Coles, N. W., Johnstone, R. M. Glutamine metabolism in Ehrlich ascites-carcinoma cells. Biochem J. 83, 284-291 (1962).
- Medina, M. A., Castro I, N. unezde Glutaminolysis and glycolysis interactions in proliferant cells. Int J Biochem. 22, 681-683 (1990).
- Anso, E., et al. Metabolic changes in cancer cells upon suppression of MYC. Cancer Metab. 1, 7 (2013).
- Malmgren, S., et al. Coordinate changes in histone modifications, mRNA levels, and metabolite profiles in clonal INS-1 832/13 β-cells accompany functional adaptations to lipotoxicity. J Biol Chem. 288 (17), 11973-11987 (2013).
- Whitehead, R. H., et al. Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).
- Roig, A. I., et al. Immortalized epithelial cells derived from human colon biopsies express stem cell markers and differentiate in vitro. Gastroenterology. 138 (3), 1012-1021 (2010).
- Sato, T., et al. Single LGR5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340, 1190-1194 (2013).
- Yilmaz, O. H., et al. mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake. Nature. 486, 490-495 (2012).
