Summary
우리는 macrophage- C.를 시각화하는 방법에 대해 설명합니다 콕 쿠스 네오 포르 만 스 (CN) 디지털 광 현미경을 사용하여 비 - 용해성 세포 외 유출의 프로세스에 특정 중점을 실시간으로 상호 작용. 개별적 감염된 대 식세포를이 방법을 사용하는 것은 이러한 현상의 다양한 양태를 확인하기 위해 조사 될 수있다.
Abstract
크립토 콕 쿠스 네오 포르 만에 의한 대 식세포의 감염의 많은 측면을 광범위하게 연구하고 잘 정의되어 있습니다. 그러나, 명확하게 이해되지 않는 한 특정의 상호 작용은 세포 외 유출 용균 비이다. 이 과정에서 효모 세포는 대 식세포와 CN 가능한 모두 나뭇잎 제대로 이해 메커니즘에 의해 세포 외 공간으로 해제됩니다. 여기서 우리는 시간 경과 현미경에 의해 24 시간 감염 기간에 대해 개별적으로 감염된 대 식세포의 큰 숫자를 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 감염된 대 식세포가 세포 배양 인큐베이터과 동일한 조건을 제공 현미경에 부착 된 CO 2 분위기의 가열 챔버 내에 수용된다. 라이브 디지털 현미경 정적 이미지에서 사용할 수없는 호스트와 병원체 간의 동적 상호 작용에 대한 정보를 제공 할 수있다. 그 반대의 경우도 마찬가지 대식 세포가 곰팡이 감염을 처리하는 방법에 대한 단서를 제공 할 수 각 감염된 세포를 시각화 할 수 있다는. 이 기술의 전복잡한 현상 뒤에있는 역학을 공부 SA 강력한 도구입니다.
Introduction
크립토 세포와 대식 세포 사이의 곰팡이 감염의 단계가 아니라 1-3 설명되어 있습니다. 효모 세포는 대 식세포에 의해 섭취 된 후, 상호 작용의 다양한 발생할 수 대식구는 세포 외 공간으로의 진균 부하 해제 용해되거나, 그것의 세포막 (4)의 범위 내에서 효모 세포를 유지하여 감염을 제어 할 수있다. 비 용균 세포 외 유출, 식세포가 주변 환경으로 크립토 셀의 일부 또는 전부를 소거하는 프로세스 또는 인접 셀 및 호스트와 병원체 모두 5 가능한 남아 : 그러나, 몇 년 전에 새로운 결과 두 그룹에 의해 독립적으로 설명 된 -8. 몇몇 연구는 이러한 상호 작용의 뒤에 분자 메커니즘을 이해하려고했지만 우리는 여전히이 현상을 원동력에 대한 전체 이해를 필요가 없습니다.
기능은 실시간으로 영상을 캡쳐하고 그 후 여러 감염을 분석 할에드 대 식세포는 하나가 곰팡이 감염시 형태와 대 식세포 심지어 스트레스에서 타이밍, 공간 능력, 변화에 관해서 비 용해성 세포 외 유출을 둘러싼 물리적 특성에 대해 많은 질문에 대답 할 수 있습니다. 세포 배양기의 것과 필적 환경에 수납 될 수 있도록함으로써, 우리는 식세포 진균 세포 상호 작용의 동적 특성을 엿볼 수있다. 연구진은이 과정의 다양한 구성 요소를 연구하기 위해이 기술을 사용하고 있습니다. 또 다른 그룹은 비 용해성 세포 외 유출이 단백질 도메인을 핵 WASH 10 삭제 있었 세포에서 차단 된 것을 보여주기 위해이 방법을 사용하는 동안이 과정에서 phagosome의 역할은, 형광 염색과 액틴 차단제 구를 사용하여 분명했습니다. 사이토 카인 시그널링의 효과도 실시간 현미경 (11)을 사용하여 확인되었다. 이 프로세스는 C. 한정되지 않는다 그와 같은 콕 쿠스 네오 포르 만은 칸디다 알비 칸스 (Candida albicans)로 관찰되었다, anothe대 식세포 (12)을 감염시키는 능력을 가진 곰팡이 병원균 r에. 이러한 연구 결과는이 방법이 우리에 대해 너무 조금 알고있는 지역에 풍부한 정보를 제공 할 수있는 방법에 대한 예입니다.
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Protocol
모든 동물의 작업은 규정과 의학의 알버트 아인슈타인 대학 동물 연구소의 지침에 따라 이루어졌다.
C.의 1 성장 조건 콕 쿠스 네오 포르 만 H99 (혈청 형 A)
- 개별 C. 성장 사부로 한천 접시에 콕 쿠스 네오 포르 만 스 (CN) 식민지.
- 어느 날 이전에 실험 한 식민지를 선택하고 사부로 배지 10 ㎖를 접종.
- 문화가 250 rpm의 속도로 흔들어 37 ° C에서 하룻밤 성장하도록 허용합니다.
2 분리 및 C57에서 차 뼈 대 식세포의 제조 / BL6 마우스
- 더 이상 호흡까지 CO 2 챔버 내에 동물을 배치하여 마우스를 안락사. 두 번째 조치로, cervically 해부를 시작하기 전에 목을 탈구. 70 %의 에틸 알코올로 몸 전체를 소독.
- 멸균 DMEM 모두 대퇴골 및 경골과 장소 뼈를 제거합니다.
- 여분의 조직과 근육 드를 사용하여 제거뼈가 완전히 깨끗해질 때까지 licate가 정리합니다.
- 70 % 에틸 알코올을 포함하는 페트리 접시 만 그대로 뼈를 삽입하고 관련 미생물을 죽이기 위해 3 분 동안 배양한다. 멸균 DMEM과 페트리 접시에 뼈와 장소를 제거합니다.
- 조심스럽게 뼈의 끝을 잘라. 빈 50 ML 원뿔 튜브 얼음에 배치하고 각 뼈를 통해 25 G 바늘을 사용하여 차가운 DMEM 10 ㎖ 조심스럽게 세척을 통해 뼈를 잡습니다.
주 : 각 마우스가 4 뼈 (대퇴골 두, 두 경골)를 얻을 것입니다. 따라서 한 마우스 세포 현탁액의 약 40 mL로 수득한다. - 650의 X g에서 10 분 동안 실온에서 원심 분리 세포 현탁액.
- 이 원심 중에 준비하고 필터 골수 대 식세포는 20 % L929, 10 % 소 태아 혈청, 10 % NCTC-109, 1 % 펜 연쇄상, 1 % HEPES, 1 % L-글루타민이 보충 된 DMEM으로 구성되어 용지를 공급하는 살균 비 필수 아미노산 1 %, 0.1 %, 2 - 메르 캅토 에탄올.
- 용지를 넣기 10 mL로 재현 탁 결과 펠릿. 세포 suspens 합격세포 덩어리를 중단하고 큰 부스러기를 제거하기 위해 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 이온.
- 플레이트 (10 판의 총) 조직 배양에 사용하도록 지정된 배양 접시에서 먹이 미디어의 10 ML에 세포 현탁액 1 ㎖.
- 세포가 10 % CO 2와 37 ° C에 부착 할 수 있습니다. , 일 7 일 3 일에 신선한 공급 용지 5 ㎖를 추가 완전히 공급 매체 및 대 식세포가 사용될 준비가 교체.
- 이전 실험에 날, 먹이 미디어를 제거하여 플레이트에서 대 식세포를 분리하고 플레이트에 시약을 제거 부드러운 세포의 5 ㎖를 추가합니다.
- 37 ° C에서 5 ~ 10 분 동안 품어 부드러운 피펫 팅으로 대 식세포를 제거합니다.
- 10 분 동안 650 XG에 원심 분리하여 펠렛 세포.
- 미디어를 공급하는 1 ㎖에 재현 탁 펠렛. 1:20 희석하여, 상 혈구 세포 현탁액 10 ㎕를 피펫 팅에 의해 대 식세포의 농도를 계산한다.
- 페트리 접시를 14mm 유리 바닥 사용을 판직접 200 ㎕의 최대 보유하고있는 내부 아니라 상에 1 × 10 5 대 식세포의 농도는, 그래서 그림 4와 같이이 볼륨을 초과하지에주의하십시오.
- 세포가 1 시간 동안 37 ° C의 배양기에서 접시를 배치하여 유리 페트리 접시에 부착 할 수 있습니다.
- 500 U / ㎖에서 1 ㎎ / ㎖ 및 IFNg에서 LPS로 보충 미디어를 먹이의 1-2 ML을 추가하고 세포가 하룻밤 배양 할 수 있습니다.
차 쥐과 대 식세포와 C의 3 공동 배양 콕 쿠스 네오 포르 만
- 실험의 날, 420 X g에서 5 분 동안 원심 분리하여 하룻밤 접종 문화와 펠렛 효모 세포를 1 ㎖를 제거합니다.
- 위에서 언급 한 속도 및 시간에 다당류 glucuronoxylomannan (GXM)와 같은 매체 및 크립토 외 제품을 제거하기 위해 멸균 PBS로 세포를 3 회 반복한다.
- 100 희석 : 멸균 PBS 1 ㎖에 재현 탁 된 세포 펠렛과 1을 확보. t의 피펫 10 μL그는 혈구에 희석 세포를 계산합니다. 하나의 MOI에서 효모 세포를 추가합니다 5. 1 × 105 식세포가있는 경우 예를 들면, / 웰, CN의 5 × 106 / ㎖의 세포 현탁액을 5 × 105 CN의 전량이 용액 100 ㎕를 추가한다.
- 10 μg / ml의 농도에서 단클론 항체 18B7 항체와 함께 먹이 미디어의 1 ml의 크립토 세포 현탁액의 계산 된 볼륨을 추가합니다. 5 분 동안 실온에서 세포 현탁액을 배양한다.
- 유리에서 공급 된 용지를 제거은 페트리 접시를 바닥 및 멸균 PBS로 1 배를 씻는다. 물론 직접 옵 소닌 CN의 100 μl를 추가합니다.
- 세포가 10 % CO 2와 37 ° C에서 2 시간 동안 배양 할 수 있습니다.
- 공동 배양 후, 대 식세포는 CN을 내면화 한 것을 현미경으로 확인합니다. 내면화 고려하기 위해, 크립토 셀은 명확하게 식세포의 범위 내에서 볼 수 있어야합니다.
- 멸균 PBS로 세척 페트리 접시의 3 배는 모든 extracellula를 제거합니다R CN.
- 1-2 단클론 항체 18B7의 추가없이 미디어를 공급 ml의 설정 현미경을 추가합니다.
디지털 광학 현미경을 활용하여 실시간으로 4 떠올리 비 용해성 세포 외 유출
주 :, CO 2 배달 및 가열 장치가 필요합니다 포함 된 첨부 배양 챔버와 함께 제공되는 현미경을이 실험을 수행 할 수 있습니다.
- 실험 전에 적어도 30 분에 37 ° C에 대한 배양 챔버를 미리 따뜻하게. CO 2 장치는 실험 시작시 5 %를 읽고 있는지 확인합니다.
- 장소 유리 CO 2 뚜껑 커버, 더 열 탈출 없도록 모든 문을 닫고, 현미경 플랫폼에서 페트리 접시를 바닥.
- 위상 콘트라스트 현미경으로 10X 대물 렌즈를 이용하여 감염된 대 식세포의 클리어 필드에 초점. 실험을 바탕으로 연구 될 필요가 얼마나 많은 대 식세포에 의해 사용 목적을 결정한다.
- 타에 현미경 소프트웨어를 설정이미지에게 24 시간 동안 매 4 분 애.
- 24 시간 후, 실험이 완성에 도달 한 것 및 361 화상의 총 수집 된 것이다. 5 % 압축에 .jpegs으로 이러한 이미지를 내 보냅니다. 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 초당 5 프레임에서 비주얼 스택으로 이미지를 볼 수 있습니다. 동영상이 게시 또는 프리젠 테이션을 볼 수 할 필요가있는 경우, AVI로 또는 형식 뷰어에 가장 적합한에 따라 .MOV 파일 중 하나로 저장합니다.
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Representative Results
이 기술은 이미지를 생성 세포 C. phagocytosed 후에 발생하는 주변 환경 정보를 수집하기 위해 다양한 방식으로 분석 될 수있다 콕 쿠스 네오 포르 만이.도 1에 도시 된 바와 같이, 감염되거나 감염되지 않은 아르 중 약 100 대 식세포있다. 이 대 식세포의 각각은 시청자에게 매우 미세한 수준에서 호스트 병원체 상호 작용을 연구 할 수있는 기회를 제공합니다. 그림 2와 3은으로, 다른 대식 세포 및 효모 세포 사이에 발생할 수있는 결과, 심지어 식세포 대 식세포 사이에있다. 대 식세포는 비 용해성 세포 외 유출, 세포 - 세포 이동, 또는 발생할 수있는 다른 세포 과정을 겪고으로 득점 할 수있다. 감염시 이러한 이벤트의 타이밍은 또한 동영상 촬영시 설정 매개 변수를 기준으로 확인 할 수 있습니다.
그림 1 :. 감염된 대 식세포의 필드이 그림은 24 시간 감염 기간의 시작에 개별적으로 감염된 대 식세포의 전체 필드를 보여줍니다. 그것은 더 중요한 것은 대 식세포는 (a 큰 화살촉으로 표시됨) 감염되는 (작은 화살표로 표시된 바와 같이)에는 진균 세포를 함유하지되는 방법 클리어 필드 외 CN없는 주목되어야한다. 스케일 바는 50 μm의를 나타냅니다.
영화 1 : Macrophage- C.의 시각화 콕 쿠스 네오 포르 만 24 시간 감염 기간. 영화의 초기 프레임은 감염되지 않은 아르 일부와 크립토 셀의 다양한 양을 phagocytized 한 일부와 분야에 걸쳐 많은 대 식세포를 보여줍니다. 영화가 진행되면서 세포 아칸소전자 모든 운동성 및 분야에 대해 이동을 볼 수 있습니다. 우리는 그들이 겪는 세포 프로세스의 어떤 종류의 볼이 대 식세포의 각을 수행 할 수 있습니다.
그림 2 :. 차 쥐과 대 식세포을받은 비 용해성 세포 외 유출 (흰색 화살촉으로 표시 패널)에 감염된 대 식세포가 아닌 용해성 세포 외 유출의 시작 단계를 겪고 볼 수 있습니다. phagosome는 (패널 BC) 확대하기 시작하고 곰팡이 부하가 이동하기 시작합니다. 패널 DE에서 알 수있는 바와 같이 여러 CN 세포는 세포 외 공간으로 방출된다. 흰색 화살촉으로 표시 패널 F에서 초 감염된 대 식세포는 또한 비 용균 세포 외 유출 이벤트 (패널 GH)을 겪는다. 흰색 화살표 머리로 도시 된 바와 같이 프로세스의 끝에서, 두 식세포는 빈 (패널 I) 남아있다. 스케일 바는 25 μm의를 나타냅니다.
영화 2 :. 떠올리 차 뮤린 대 식세포 겪고 비 용균 세포 외 유출이 영화에서, 크립토 세포가 감염된 대 식세포의 범위 내에있는 것이 분명하다. 대 식세포는 교반되고 효모 세포 내 신진 phagosome 알 수있다. 크립토 셀은 신속하게 주변 환경에 정리되어있다. 제 감염된 대 식세포는 비 용균 세포 외 유출 등 효모 세포는 세포 외 공간으로 방출된다 겪는다. 계속 이동하는 능력으로 나타낸 바와 같이 숙주 세포는 세포 외 유출 크립토 후 생존 유지.
그림 3 :. 차 쥐과 대 식세포을받은 셀 셀 전송 또 다른 PROC이 프로토콜을 이용하여 포착 될 수있는 ESS는 크립토 세포 식세포 이웃 한 마크로파지로부터 전송 될 때 발생하는 세포 - 세포 전사이다. 두 감염된 대 식세포 화이트 화살촉 (패널 A)로 나타낸 서로 가까이에있는 세포 - 세포 이동 (패널 B)을 개시하도록 더 가까이 이동한다. 붉은 화살표 머리로 나타낸 세포 간 다리는 크립토 세포가 전사 (패널 C, E) 중에 주변 환경에 노출되지 않도록 두 식세포 사이에 형성된다. 전송이 완료되면, 셀 (패널 D, F)를 이탈. 스케일 바는 25 μm의를 나타냅니다.
영화 3 :. 감염된 대 식세포 사이 셀 셀 전송을 떠올리 경우에 따라 대 식세포는 숙주 세포 사이의 크립토 셀의 전송을 용이하게하는 방식으로 상호 작용하는 것입니다. 효모 세포는 노출되지 않습니다세포 외 환경 및 숙주 세포 생존에 남아있다. 이 영화에서,이 감염된 대 식세포는 한 대 식세포에서 다른 셔틀 크립토 셀이 분리되는 경우에 세포 - 세포 교량을 만들 수 있습니다.
그림 4 : 세포의 도식 보여주는 준비.
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Discussion
여기서 우리는 곰팡이 식세포 작용을 기록하고 24 시간 동안 실시간으로 분석 할 수있는 방법을 설명 하였다. 본 연구실은 비 용균 세포 외 유출의 시간적 측면 많은 공부이 프로토콜을 사용하고이 프로세스를 둘러싸고 형태 요소를 확인하기 위해 실시간으로 현미경을 사용하는 것을 계속할 것이다.
이 기술은 이상적인 결과를 산출하기 위해서는 특별한주의가 프로토콜의 특정 단계에 부여해야합니다. 너무 많은 세포 이동 및 각 셀의 상호 작용의 관찰이 방해로 사용할 수 없다 동영상을 생성 할 수 있기 때문에 너무 적은 세포가 상당한 수없는 데이터를 얻을 수있는 반면 전날 밤 도금 셀 밀도가 중요하다. 목표는 각각의 대 식세포가 감염 기간의 지속 기간 동안 추적 될 수있는 대 식세포의 균등 필드를 달성하는 것이다. 같은 맥락에서, 세포 외 CN을 멀리 세척하는 것은 전으로 중요한 단계입니다tracellular CN 필드를 모호하고 대 식세포의 가시성의 손실로 이어질 수 시간에 걸쳐 분할됩니다. 동영상의 길이에 따라, 상기 프레임 공부 불가능한 화상을 만들고, 따라서, 기록이 감염 동안에 다양한 지점에서 확인 될 필요가 초점이 이동할 수있다.
설명한 바와 같이,이 기술은 다른 실험 변수에 맞도록 수정 될 수있는 다양한 방법이있다. 많은 다른 형광 염료 및 마커 막과 phagosomal 역 동성을 강조하기 위해 사용할 수 있지만 한 사진 표백에주의해야하며, 이것이 세포의 적합성에 미칠 수있는 영향을줍니다. 세포 유형의 다양한 발생할 수 차이를 연구하는 다른 진균 균주와 함께 J774.1 식세포 유사 세포, 단핵구 또는 아메바와 같은 사용될 수있다. 실험은 세포의 대량의 데이터 수집을 필요로하기 때문에 우리는 그러나 하나 이상 사용할 수, 10X의 목적을 사용할 것을 제안몇 가지 세포를 연구 할 목적. 각각의 이미지가 촬영 타이밍도 조절할 수 있습니다. 화상 촬영 시간 동안 24 분마다 4는 모든 프레임이 압축되었을 때의 길이가 대략 1 분 정도 실행되는 동영상을 산출한다. 증가 하나 양태 (감염의 재생 시간 또는 프레임 사이의 시간)은 약간의 실험 실용 문제가 될 수있다 저장 될 필요가있는 파일의 양을 증가시킨다.
비 용해성 세포 외 유출은 감염시 신속하고 다양한 시간 간격으로 발생하는 매우 역동적 인 과정이다. 따라서, 송신 및 주사 전자 현미경과 같은 다른 방법을 이용하여 이러한 상호 작용을 겪고 식세포를 포착하려고하는 것은 극히 드문 일 수있다. 때문에 샘플을 고정 및 처리 방법의 특성으로, 하나는 무엇을보고있는 것은 결정적으로 같은 용해 또는 세포 사멸 등의 세포 과정에 비해 비 용해성 세포 외 유출 것을 확신 할 수 없습니다. 또한, 비 용해성 세포 외 유출의 특징은 호스트와 병원체로 남아 있다는 것입니다 이후 BLE 이러한 방법은 주어진 순간에 프로세스의 스냅 샷을 생성 할 수 있기 때문에 고정 된 이미지에서 추론 할 수없는 무언가이다.
이 프로토콜은 세포 과정의 수많은 이미지를 제공 할 수 있지만, 호스트 병원체 상호 작용을 연구하기 위해이 기술을 사용하여 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 낮은 목표 우리 phagosome 비 용균 세포 외 유출의 잘 이해 양태 아니다 세포막 간의 상호 작용을 시각화하는 충분히 높은 해상도 이미지를 허용하지 않는 동시에 식세포 다량 공부를 사용한다. 모든 이미지가 기록되고 나면, 다음과 같은 많은 대 식세포의 사후 분석은 매우 번거롭고 시간이 많이 걸리는 일일 수 있습니다. 대 식세포, 유리에 부착 심지어는 매우 운동성이 될 수 있습니다 매우 빠르게 및 프레임 밖으로 이동합니다. 이것은 하드 처음부터 끝까지 개인 대 식세포, 프레임의 가장자리 근처에 그 특히를 수행 할 수 있습니다.
jove_content는 "> 이러한 제한에도 불구하고,이 프로토콜은 호스트 병원체 상호 작용의 다양한 양상을 연구하기위한 다양한 방법에 사용될 수있다.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 우리가 더 경쟁 재정적 이해 나 관심의 다른 충돌이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 NIH 상 5T32AI07506, 5R01AI033774, 5R37AI033142, 5R01AI052733에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sabouraud Dextrose Agar | BD | DF0109-17-1 | |
| Sabouraud Dextrose Broth | BD | DF0382-17-9 | |
| Dubelcco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Atlanta Biologicals | S12450 | |
| NCTC 109 | Invitrogen | 21340-039 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| HEPES Buffer | Corning Cellgro | 25-060-Cl | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | |
| Non-essential Amino Acids | Corning Cellgro | 25-025-Cl | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | Toxic |
| 3003 Tissue Culture Petri Dishes | Fisher Scientific | 08772E | |
| CellStripper | Corning Cellgro | 25-056-Cl | |
| Mat-tek Glass Bottom Culture Dishes | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| LPS | Sigma | L3137 | |
| Mouse IFN-g | Roche | NC 9222016 | |
| mAb 18B7 | Non-commerical antibody produced in our lab | ||
| Axiovert 200M Microscope with Incubating Chamber | Zeiss |
References
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