Protocol
Hinweis: Alle Lieferungen sind in Tabelle 1 aufgeführt.
1. Speichern der Hühnerembryonen
- Inkubieren Hühnereier des Stammes Gallus gallus horizontal bei 37 ° C mit ca. 40% Luftfeuchtigkeit und schalten Eier einmal oder zweimal täglich. Drehen Eier ist wichtig, den Embryo aus auf die Eierschale haftet.
- Sie nicht, das Ei in den 24 Stunden vor der Einrichtung der Kultur, da sonst der Embryo ventral der Dottermasse entfernt werden und wird beim Öffnen der Eier in Schritt 3 Zusätzlich beschädigt schalten, halten Sie die Eier bei 4 o C Grad für nicht mehr als eine Woche vor der Inkubation auf "halt" Entwicklung, aber das ist nicht ideal.
2. Staging Hühnerembryonen
- Stufe die Hühnerembryonen mit dem Hamburger und Hamilton 12 Staging-Tabelle. Die ideale Bühne für die Einrichtung des Ex-ovo-Kultivierung ist HH Stadium 19-20 (ca. 3 Tagen Inkubation) because dies kurz nach der Kopf dreht sich mit 53 HPF.
Hinweis: HH Stadium 19-20 wird durch folgende morphologische Merkmale gekennzeichnet: Somiten in die Mehrheit der Schwanz verlängert, aber die ganz am Ende der Schwanz bleibt unsegmentierten die Schwanzknospe gewellt ist, ist die Allantois klein und hat Gefäßsystem beschränkt, die Beinknospen sind größer als die Flügelknospen und die Augen sind nicht pigmentierten oder haben eine gräuliche Farbe.
3. Entfernen der Embryo von der Shell
- Vor dem Entfernen der Embryo aus der Schale, sprühen die Shell mit 70% Ethanol und lassen Sie ihn trocknen. Das Ei Schalten Sie nicht schnell, da dies den Embryo schädigen.
- Darauf achten, daß die Ausrichtung des Eier verändern, vorsichtig knacken das Ei an der Unterseite (dh der Seite, die während der Inkubation ventralen war) und lassen den Embryo in eine sterile wiegen Boot (88 x 88 x 23 mm). Wischen Sie wiegen Boote mit 70% Ethanol. Untersuchen Sie den Embryo, um sicherzustellen, dass der Dottersack nicht beschädigt wird. Wenn das Eigelb hgebrochen, entsorgen Sie den Embryo, da es nicht überlebt.
- Beachten Sie die Embryos zu gewährleisten, dass es machbar ist; das Herz schlägt, erscheint Gefäßsystem normal und keine offensichtlichen Anomalien vorhanden sind. Sicherzustellen, dass die Ränder des Wägeschiffchen trocken sind.
- Mit einer Pipette fallen 40 ul Penicillin / Streptomycin (5.000 Einheiten Penicillin, 5 mg Streptomycin pro ml) auf der Oberseite des Albumin zur Verhinderung einer Infektion.
4. Vorbereiten der Feuchtekammer
- Eine kleine Stapel von Kim-Wipes und / oder ein absorbierendes Kissen aus Baumwolle in den Boden einer sterilen Kunststoffbehälter (12 x 12 x 6 cm) abgewischt und mit 70% Ethanol.
- In sterilem destilliertem Wasser, um die kim-Wischtücher und / oder Baumwolle (ca. 150 ml Wasser) befeuchten.
5. Montage der Ex Ovo Kultur
- Legen Sie die wiegen Boot, das die Embryos auf der Oberseite des feuchten Polsterung. Dann Ort Hälfte eines quadratischen sterile Petrischale (9.5 x 9.5 cm) oben auf ter Boot wiegen, um eine lose Deckel zu bilden.
- Decken Sie die Kunststoffbehälter mit Deckel. Drücken Sie zwei Ecken des Deckels, eine Teildichtung, die noch ermöglicht eine gute Luftzirkulation in der Kammer gewährleistet.
- Legen Sie das Setup in das 37 ° C-Inkubator, bis die gewünschte Stufe.
- Platzieren Behälter Wasser in den Inkubator zur Kontrolle der Feuchtigkeit, wenn ein kontrollierter Luftfeuchtigkeit Inkubator nicht verfügbar ist. Sterilisieren Sie das gesamte Wasser in den Feuchtekammern und in den Inkubator und füllt als während der Inkubationszeit benötigt. 40% Luftfeuchtigkeit ist ideal.
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Representative Results
Diese ex ovo Verfahren erlaubt die Beobachtung von Embryonen aus einem frühen Entwicklungsstadium (HH 19/20) zum fortgeschrittenen Stadium der Entwicklung (HH 40-41) (1A und 1B). Einrichten der Kultur bei HH 19-20 erhöht die Überlebensfähigkeit der Embryonen in der Kultur. Vor dem Drehen des Kopfes (vor 53 HPF) Überlebensfähigkeit in Kultur und nach der Stufe 21 sehr niedrig ist, neigt der Embryo mehr an die Shell auf Entfernung bleiben so weniger intakte Embryonen gewonnen werden. Im Allgemeinen ist die Überlebensfähigkeit des Embryos in ex ovo Kultur hoch bis zu HH 35-36 (90-100%), aber es Tropfen in den fortgeschrittenen Stadien der Entwicklung (ca. 40% überleben HH 40-41). Dazu kommt, obwohl es hat sich gezeigt, dass die Entwicklung normal erscheint bei diesen späten Stadien und Strukturierung des Skeletts ist unempfindlich 4,15 haben wir beobachtet, dass die Schenkel an diesen späten Stadien darauf hindeutet, dass das Ausmaß und Zeitpunkt der Knochenbildung beeinträchtigt werden gebogen. Dies istnicht überraschend angesichts der Bedarf an Kalzium aus der Schale zur Knochenbildung. Ein detaillierter Vergleich der Entwicklung des Embryos im Vergleich zu Kontrollen ist im Gange und geht über den Umfang dieser Methoden Papier.
Den Zugang zu den Embryo während der Entwicklung ist aus zwei Hauptgründen. Erstens sind die Forscher in der Lage, die Entwicklung auf einer täglichen Basis, ohne zu entsiegeln und verschließen ein Fenster anzuzeigen. Zum Beispiel sind Menschen in der Lage, des Körpers und der Augenentwicklung in mehreren Stufen (1C und 1D) zu beobachten. Zweitens ex ovo Kultivierung ermöglicht eine größere (uneingeschränkt) Zugriff auf den Embryo, wodurch ein einfacher Manipulationen oder Operationen.
Embryonale Manipulationen häufig, müssen mit einem Stereomikroskop durchgeführt werden. Mit der ex ovo hier beschriebenen, im Gegensatz zu dem Styropor / Plastikfolie Methode 6,7,8 Kultivierungsverfahren der Embryo Set-up ist einfach und platzierter das Mikroskop ist weniger tief und nicht umkippt. Dies ermöglicht es dem Forscher, die Feuchtigkeitskammer genau zu positionieren, wie benötigt, und um es zu drehen, um den Zugriff auf den Embryo zu optimieren, da es keine Hindernisse (Eischale) Verschleiern der Embryo und da die Kammer ist sehr stabil. Insgesamt ist die Unterstützung der Embryo empfängt von dem Wägeschiffchen ermöglicht sanften Druck auf den Embryo während der Handhabung ohne die Einrichtung Umkippen angewendet werden.
Mehrere Entwicklungsbiologie Methoden können auf die Embryonen in diesem Kultursystem durchgeführt werden. Dazu gehören detaillierte Beobachtungen der Orgel (zB Auge, Gehirn usw.) oder Gewebeentwicklung (zB Wachstum von Blutgefäßen) oder Anwendung teratogene Mittel. Manipulationen umfassen Pfropfung von Geweben auf die Chorioallantoismembran um die Wirkung der Kombination von verschiedenen Gewebeschichten zu studieren oder Tumorwachstum und Metastasierung 14 zu studieren. Eine andere beliebte Manipulation während der Entwicklung durchgeführt wird bead oder Barriere Implantation. Bead Implantation ermöglicht ein Forscher, einen Inhibitor oder Faktor auf den Wulst örtlich tränken und dann implantieren den Wulst zu inhibieren oder induzieren Gene lokal in dem Bereich von Interesse. Dies wird oft mittels Affigel oder Heparin-Kügelchen (2A) durchgeführt. So kann beispielsweise bone morphogenetic proteins (BMPs) lokal bei der Induktion der Neuralleiste Knochen 4, 15 gesperrt werden, oder in der sich entwickelnden Extremitätenknospe 13. Nachdem eine Wulst implantiert, kann der Embryo in den Inkubator gegeben werden, und es wird weiter zu entwickeln. Dies ermöglicht es den Forschern, die stromabwärts Wirkungen der Hemmung eines bestimmten Gens (in diesem Fall BMP), wie beispielsweise die Hemmung der skleralen Ossikel Bildung im Skleralring (2B und 2C) 15 anzuzeigen. Auch Hindernisse können einfach zwischen Gewebeschichten, um Gewebe zu Gewebe-Signalisierung und die Mikroinjektion von Farbstoffen können auch einfach durchgeführt werden studieren eingefügt werden. 
Abbildung 1. Anzeigen des Embryos ex ovo. (A) HH Stufe 20 Hühnerembryo nach der Entnahme aus der Schale, Pfeil zeigt auf den Embryo mit vaskularisierten embryonalen Membranen. (B) A HH Stufe 40 Embryos in einem offenen feuchten Kammer. (C) HH Stufe 35 Embryo zeigt frühe Extremitätenknospen (Pfeil). (D) Stadium HH 41 Embryos, die später Entwicklung von Strukturen, wie das Auge (Pfeil). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 2. Beispiel für Noggin getränkt Wulst Implantation experiment. 4 (A) Embryo HH Stufe 35 durch ein kleines Loch in den übereinanderliegenden Membranen, um einen Zugang zu der darunter liegenden Auge für Korn Implantation gewinnen zerrissen ausgesetzt. Hohe Vergrößerung der Affigel Wulst neben einem Binde Papille in Leiste dargestellt. Maßstabsbalken in C ist 75 um. (B) Die alkalische Phosphatase nach Noggin Wulst Implantation (Pfeil), die Lücke im Ring der Gehörknöchelchen, HH 38 (C) AP gefärbten linke Auge zeigt keine Störung an den Ring der Gehörknöchelchen (Steuer befleckt rechten Auge ), HH 38. Einzelheiten dieses Experiments sind in Duench und Franz-Odendaal 4 zur Verfügung gestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Discussion
Ex Ovo Kultivierung und Fenster beide haben Vorteile und Herausforderungen. Hier vergleichen wir die Vorteile und Herausforderungen der Styroporbecher ex ovo-Methode und der Fenster Methode, um unsere verbesserte ex ovo Methode angezeigt. Unsere Methode ermöglicht Manipulation und einfache Beobachtung des Hühnerembryos in späten Entwicklungsstadien und unsere Verbesserungen der traditionellen ex ovo Verfahren 1, 2, 3 machen es zudem sehr einfach, in grundständigen Lehre Labor Klassen verwenden.
Obwohl viele Forscher bevorzugen die Fenstermethode Huhn Entwicklung zu studieren, weil es einfach durchzuführen und hat eine ausgezeichnete Überlebensfähigkeit zu späten Entwicklungsstadien (HH 41-42), hat es Einschränkungen. Die größte ist die begrenzte Fähigkeit, den gesamten Embryo nach HH Stufe 30 zu sehen Nach Stadium HH 30, muss das Fenster in der Eierschale sehr groß, um den wachsenden Embryo bewegen sehen sein. Das große Fenster ist difficult zur Abdichtung vollständig (was zu Problemen mit der Sterilität und Überlebensfähigkeit) und erhalten eine gute Beleuchtung im Inneren des Eis kann eine Herausforderung sein. Darüber hinaus sind fortgeschritten Embryonen großen und schwer zugänglichen (oder zu manipulieren) durch das Fenster.
Die ex ovo hier beschriebene Verfahren bietet volle ungehinderten Zugang zum Embryo. Sobald die Wägeschiffchen in der Feuchtigkeitskammer gelegt, ist die gesamte Aufbau sehr stabil. Der gesamte Feuchtigkeitskammer kann unter einem Präpariermikroskop angebracht werden und eine hohe Vergrßerung verwendet werden, um den gesamten Embryo beobachten. Im Vergleich dazu hat der Styroporbecher Verfahren eine feuchte Kammer, die groß ist (Tassenhöhe) und das macht es sehr schwierig, unter dem Mikroskop Ziele zu setzen. Der Becherentwurf ist auch weit weniger stabil als die Flach wiegen Boot und diese Becher kann leicht umgestoßen werden. Unsere Verbesserungen des ex ovo Verfahren machen diese Methode einfach, in einem Klassenzimmer oder Labor-Einstellung zu verwenden und ermöglicht die student um vollen Zugriff auf Embryonen aus Stadium HH 19 bis zu HH 40 haben; inszeniert, wenn wichtige Organentwicklung auftritt. Der größte Nachteil der ex ovo Methode ist Sterilität. Um Infektionen zu vermeiden, umfaßt unsere Methode die Zugabe von Antibiotika. Eine weitere Dosis des Antibiotikums können für den Embryo in späteren Phasen gegeben werden. Die während der Kultur-Setup verabreichten Antibiotika auch scheint nicht die Entwicklung des Embryos beeinflussen. Sterilisieren von Behältern mit 70% igem Ethanol vor der Anwendung drastisch erhöhen die Überlebensfähigkeit.
Insgesamt ist die ex ovo Verfahren ideal für die Anzeige und Bearbeitung von Embryonen ohne Zugangsbeschränkungen oder Entwicklungsphase. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass die Kultivierung der Embryonen ex ovo nicht negativ beeinflusst Strukturierung 4,15. Zum Beispiel haben wir keine Veränderungen in der Strukturierung oder Induktion des Skeletts sehen trotz der Abwesenheit von der Eierschale. Unsere verbesserte Verfahren löst mehrere cERAUSFORDERUNGEN die mit der aktuellen traditionellen ex ovo-Methode 1,2, 3 existieren.
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Disclosures
Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen in Bezug auf die in diesem Manuskript bereitgestellten Informationen.
Acknowledgments
Wir möchten Paul Poirier, der Medienproduzent, am Mount St. Vincent Universität für seine Arbeit in Filmen und Bearbeiten der Videoteil des Manuskripts danken. Wir sind uns der Naturwissenschaft und Technik Research Council of Canada für die Finanzierung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4458 | Make small aliquots to avoid freeze/thaw events |
| Square Petri Dish | 9.5 cm x 9.5 cm | ||
| Weigh Boat | Fischer Scientific | 8732113 | 88 x 88 x 23 mm |
| Ziplock container | Ziplock | N/A | 12 cm x 12 cm x 6 cm |
References
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