Abstract
Coleta e processamento de amostras de sangue total em um ambiente não-clínica oferece uma oportunidade única para avaliar indivíduos residentes na comunidade com e sem condições pré-existentes. Transformação rápida destas amostras é essencial para evitar a degradação dos componentes celulares principais. Incluem-se aqui métodos para simultânea de células mononucleares do sangue periférico (PBMC), DNA, RNA e isolamento de soro a partir de uma única coleta de sangue realizados nas casas dos consentindo participantes através de uma área metropolitana, com o processamento iniciado no prazo de 2 horas da coleta. Temos usado essas técnicas para processar mais de 1.600 amostras de sangue produzindo, materiais de alta qualidade consistente, o que foi posteriormente utilizado na metilação do DNA, genotipagem, expressão gênica bem sucedido e citometria de fluxo analisa. Alguns dos métodos empregados são padrão; No entanto, quando combinados da maneira descrita, permitem um processamento eficiente das amostras a partir de participantes de populacional e / ou comunitáriaestudos baseados que normalmente não seriam avaliadas em um ambiente clínico. Por conseguinte, este protocolo tem o potencial de se obter amostras de dados (e, posteriormente), que são mais representativas da população geral.
Introduction
Vários estudos têm caracterizado diferenças na expressão genética, a metilação do DNA e subconjunto de células no sangue entre os indivíduos com e sem mental (ou outras) doenças 1-4. Esses estudos, no entanto, foram obtidos a partir de situações clínicas em que as diferenças associados à doença podem ser ampliadas devido à natureza geralmente mais grave das doenças para as quais os pacientes procuram tratamento. Devido aos avanços na "ómicas" abordagens, a última década assistiu a uma explosão de interesse em obter amostras biológicas de comunidade e / ou contextos epidemiológicos 5-7, a fim de fornecer estimativas populacionais de prevalência da doença e um quadro mais amplo do determinantes ambientais destas doenças mentais e / ou físicas.
Um desafio fundamental a este respeito é a exigência de um rápido processamento dos espécimes coletados. Degradação de células mononucleares, os componentes do sistema imunológico que são fundamentais frequently utilizado para avaliar a saúde de um indivíduo, começa imediatamente após a colheita de sangue com uma diminuição significativa na recuperação após 2 horas de recolha de 8-10. Para enfrentar esse desafio, apresentamos um protocolo otimizado em que vários componentes do sangue humano são simultaneamente isolado a partir de amostras obtidas nas casas de indivíduos que vivem em uma grande área metropolitana. O protocolo é baseado em nossa compilação e modificação das técnicas atuais, incluindo o armazenamento de todas as frações "extra" em caso futuras técnicas permitem um maior isolamento / análises. Enquanto os métodos alternativos ou estojos podem ser utilizados no lugar dos métodos descritos aqui individuais, aqueles descritos provaram ser um meio fiável e eficiente para o processamento de amostras de um modo de alto rendimento. Frações de alta qualidade (PBMC, DNA, soro e RNA) de sangue fresco pode ser produzido dentro de 2 horas de coleta e todos os espécimes de ensaio-pronto pode estar disponível dentro de 2 dias (Figura 1).
Este protocolo foi desenvolvido para permitir o processamento eficiente de amostras coletadas de comunidade-moradia, adultos residentes na cidade de Detroit para testes no Estudo de Saúde Bairro Detroit (DNHS; DA022720, RC1MH088283, DA022720-05-S1) uma base populacional, estudo dos determinantes sociais e biológicas do transtorno de estresse pós-traumático (PTSD) e outras doenças mentais. A prevalência de TEPT em Detroit é mais do que o dobro da média nacional 11,12. Identificar os determinantes biológicos de PTSD nesta população pode ajudar a desenvolver farmacológico adequado e / ou intervenções cognitivo-comportamentais para ajudar aqueles que sofrem de transtorno, tanto na população urbana, e em outras populações de alto risco (por exemplo, retornando veteranos militares). Nosso laboratório, anteriormente localizado na Wayne State University, em Detroit, Michigan, foi selecionado para o processamento com base em nossa experiência em lidar com amostras de tecido fresco derivadas de uma variedadede fontes, a necessidade de começar a processar as amostras no prazo de 2 horas da coleta, e nossa proximidade com os locais de coleta. Com esta oportunidade única na mão, o nosso objetivo foi otimizar o processamento para maior rendimento de DNA, RNA, soro e células mononucleares do sangue periférico (PBMC) a partir de cada amostra (de um total de n = 1.639 amostras ao longo de 5 ondas de coleta de amostra). Os procedimentos descritos aqui podem ser realizadas simultaneamente num ambiente não-clínica, produzindo, assim, o material (ver Tabela 1 para os rendimentos médios) a partir de um grande número de aplicações a jusante, incluindo microarrays, epigenética, em tempo real de RT-PCR, e a citometria de fluxo análises.
Figura 1. fluxo geral de trabalho. O processo global descrito aqui inclui a logística de obtenção das amostras de sangue de identificar consentindo participants para o sangue desenhar a si próprio. De alta qualidade, as fracções (células mononucleares do sangue periférico; PBMC, ADN, soro, ARN) e de sangue inteiro fresco pode ser produzido dentro de 2 horas de recolha e todas as amostras de ensaio prontos podem estar disponíveis no prazo de 2 dias. Além disso, as fracções preparadas por este método são adequados para armazenamento a longo prazo se as amostras não são para ser testada imediatamente. Todo o cronograma descrito aqui pode ser concluído em um único dia (~ 5 horas total). No entanto, um tal dia seria extremamente trabalhoso, especialmente para um único técnico com experiência substancial com as técnicas. Assim, recomendamos dividindo os procedimentos no dia 1 entre pelo menos dois técnicos e concluir o processamento do RNA no dia 2. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Protocol
O Estudo de Saúde Detroit Neighborhood foi revisado e aprovado pela Universidade de Institutional Review Board do Michigan. Todos os participantes forneceram consentimento informado antes de sua participação no estudo.
1. Visão Geral
- Documentado corretamente todas as fases de recrutamento através da análise de dados do nó de extremidade. Executar os protocolos no dia 1 simultaneamente, alternando fases e sobrepondo o tempo permitir. A sequência de estágios é escrito para otimizar a eficiência de desempenho. A Figura 1 fornece uma visão geral de todo o processo.
Nota: O termo "participante" é usada em toda a significar a amostra de sangue identificou-de colher de um indivíduo consentir. Os tempos entre parênteses indicam abaixo hands-on tempo. Exemplos de acompanhamento e a folha de registo da amostra pode ser encontrada nas tabelas suplementares S1 e S2, respectivamente. As amostras são coletadas por phlebotomists em casasde indivíduos identificados como consentindo participantes pelo coordenador do estudo e transportados para o laboratório por um mensageiro (ver Informações Suplementares (SI) 1 Para mais detalhes de pré-processamento).
2. Dia 1 Setup
- Preparar solução salina tamponada 1x com fosfato (PBS).
- Pré-aqueça um bloco de calor a 56 ºC.
- Prepare a protease (ver SI 2) por alíquotas de 20 ul para o número apropriado de tubos de microcentrífuga para as entregas do dia (2 por participante).
- Assegurar buffers AW1 e AW2 (tampões de lavagem fornecidas com o kit de isolamento de ADN que aumentam a pureza do DNA) estão prontas para uso, a adição de etanol a 100%, conforme indicado no rótulo, se necessário.
- Arrefecer centrífuga refrigerada a 4 ° C.
- Recoloque a tampa do frasco de 1x PBS com a tampa de septo de borracha fornecida e perfurar a membrana de borracha com um bico de transferência, mantendo a tampa de rosca no topo do spi transferênciake para evitar a evaporação. Repita com a garrafa de solução de estabilização RNA.
- A seguir à preparação do bloco de tampões, centrífuga e de calor, registar o tempo de entrega Vacutainer na folha de rastreamento da amostra (ver Tabela SI).
3. Dia 1: Processamento de amostra de sangue total para o DNA, RNA PBMC e leucócitos (2 h)
- Visão geral
- Alocar tempo suficiente para minimizar o atraso entre a coleta de sangue e hora de início o processamento. Iniciar o processamento dos Ficoll contendo vacutainers dentro de 2 horas de coleta de sangue para evitar um aumento da contaminação de glóbulos vermelhos e uma diminuição na recuperação de células mononucleares.
- Suponha recolha de 2 vacutainers contendo gel de gradiente de Ficoll, 2 K 2 ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), e 1 vacutainers Vacutainer soro por participante adulto. Após a entrega das vacutainers para o laboratório, têm um técnico de assinar a aceitação significando folha de rastreamento das amostras. Implorarno processamento imediatamente com a hora de início documentado em uma base por Vacutainer no registo de amostra.
- Soro Isolamento Fase 1 (1 min)
- Documentar a hora de início no registro da amostra (ver quadro SI 2). Centrífuga (com freio e aceleração OFF) o vacutainer 7,0 ml de soro (vermelho) (1 por participante) usando um rotor de caçamba móvel com tampas de aerossóis (nível de biossegurança 2; BSL2 autenticada) por 20 min, 1300 xg, 4 ºC.
- Isolamento de DNA Fase 1 (15 min)
Nota: Para mais detalhes sobre este procedimento de isolamento, consulte o protocolo do fabricante 13.- Documentar a hora de início. Num capuz de cultura de células BSL2, inverter os vacutainers contendo o gel de Ficoll 5 vezes, em seguida, adicionar 200 uL de sangue total a partir do topo de um dos vacutainers em cada uma das duas aliquotas de 20 ul de protease (400 mL no total) por participante. Deixando os protease + microcentrífuga sangue tubos na capa, continue para a centrifugation do Ficoll contendo vacutainers no passo 3.4.1.
Nota: Utilizar o Vacutainer com o maior volume de recolha, tendo em mente a necessidade de equilibrar a centrifugadora (isto é, pode ser necessário remover a 200 ul a partir de cada um dos dois vacutainers) ao girar a vacutainers no passo 3.4.1. Além disso, para assegurar uma separação adequada durante o processamento dos vacutainers azul, o nível de sangue que permanece no recipiente sob vácuo não deve ser inferior a 2,5 polegadas acima da camada de Ficoll.
- Documentar a hora de início. Num capuz de cultura de células BSL2, inverter os vacutainers contendo o gel de Ficoll 5 vezes, em seguida, adicionar 200 uL de sangue total a partir do topo de um dos vacutainers em cada uma das duas aliquotas de 20 ul de protease (400 mL no total) por participante. Deixando os protease + microcentrífuga sangue tubos na capa, continue para a centrifugation do Ficoll contendo vacutainers no passo 3.4.1.
- Isolamento de PBMC Fase 1 (1 min)
- Documentar a hora de início (deve estar dentro de 2 horas de coleta de sangue para evitar um aumento da contaminação de glóbulos vermelhos e uma diminuição na recuperação de células mononucleares) .Invert o Ficoll contendo vacutainers 8-10 vezes. Centrífuga (com freio e aceleração OFF) os vacutainers (2 por participante) usando um rotor de caçamba móvel com tampas de aerossóis (BSL2 certificado) para 30 min, 1600 xg, 22 ° C.
- Retornar para a capa e adicionar 200 mL de buffer AL a cada um dos tubos de protease + sangue microcentrífuga (etapa 3.3.1). Cap, retire do capô, vortex 15 seg e rotação flash.
- Incubar 56 ºC em um bloco de aquecimento, 10 min.
- Retirar os tubos do bloco de calor. Rotação Flash. Voltar para o capô BSL2. Adicionar 200 ul de etanol a 100%. Cap, retire do capô, vortex 15 seg e rotação flash. As demais etapas pode ser concluído fora do capô.
- Aplicar lisado (dentro de 30 minutos do passo 3.5.3) para uma coluna de centrifugação marcado (num tubo de recolha de 2 mL). Feche a tampa para evitar a contaminação cruzada através de aerossóis. Centrífuga 6000 xg, 1 min.
- Descarte o tubo de recolha que contém o filtrado e coloque a coluna de spin em um novo tubo de recolha de 2 ml.
- Adicionar 500 mL de buffer AW1 para a coluna sem umedecendo o aro, feche a tampa, e centrifugar 6000 xg, 1 min.
- Descarte o tubo de coleta contendo a filtrate e colocar a coluna de spin em um novo tubo de recolha de 2 ml.
- Adicionar 500 mL de buffer AW2 para a coluna sem umedecendo o aro, feche a tampa, e centrifugar 20.000 xg, 3 min.
- Rejeitar o tubo de recolha que contém o filtrado e colocar a coluna de centrifugação em um novo tubo de recolha de 1,5 ml (não incluída no kit), e centrifuga-se 20.000 xg, 1 min.
- Rejeitar o tubo de recolha que contém o filtrado e colocar a coluna de centrifugação em um novo tubo de recolha de 1,5 ml (não incluído no estojo).
- Adicionar 200 ul de tampão AE ou água para cada coluna e incuba-se à temperatura ambiente durante 5 min. Centrífuga 6000 xg, 1 min.
- Repita o passo 3.5.11 eluição no mesmo tubo de coleta.
- A piscina do DNA fluido das 2 colunas por participante. Rendimento total ~ 800 ul por participante.
- Quantificar as amostras usando um espectrofotômetro quando o tempo permite.
- Aliquota de ADN tal como desejado em 2 ml criotubos, que documentam a concentração de cada um na specimelog n. Transferência para criotubos e um cryobox lugar à temperatura de -80 ° C para armazenamento a longo prazo. Documentar a hora de início congelador.
Nota: Executar em uma capa de cultura de célula certificada Nível de Biossegurança 2. Para mais detalhes sobre esse isolamento veja as instruções do fabricante 15.
- Perfurar a membrana de borracha do K 2 EDTA vacutainer com um bico de transferência. Reter a bainha e tampa de rosca para uso na etapa 3.6.11. Seguindo práticas padrão BSL2, ter o cuidado de evitar a exposição a patógenos.
- Ligue o conector deslizamento branca ao topo do bico de transferência.
- Rotular o filtro com o ID participante correspondente em seguida, ligue a entrada (extremidade alargada) do filtro ao conector de deslizamento branco.
- Anexar uma agulha com bainha 25⅝ G para a saída (extremidade cónica) do filtro. Preparando o conjunto do filtro antes da entrega acelera consideravelmente e, por conseguinte, o processo,fixar o conector de deslizamento branco para o bico de transferência, a adição do filtro, em seguida, a agulha embainhada e ajustando a montagem num suporte de tubos de cultura até à sua utilização, é recomendado.
- Após montagem do sistema de tubos EDTA K 2, unsheathe com segurança a agulha (utilize a extremidade de uma espátula de metal). Esfaquear a agulha num 10 ml tubo vazio coleta de sangue evacuados (tubo de receptor de soro) e inverter o conjunto do tubo de K 2 EDTA vacutainer / filtro / receptor. Seguindo práticas padrão BSL2, ter o cuidado de evitar a exposição a patógenos.
- Permitir que o sangue para filtrar através até que as secções em forma de cunha de o filtro ter limpo de sangue. A filtração leva cerca de 2 min e pode ser colocado num suporte de tubos de ensaio durante a filtração.
- Retire o filtro do conjunto. Deixe a agulha no tubo que contém o filtrado e descartar todo o conjunto em um recipiente Sharps.
- Anexar uma seringa de 5 ml para o bico de transferência no frasco de 1x PBS, emverter o frasco, e retirar-se 3 ml.
- Introduzir a seringa com PBS para a entrada do filtro e lavar o filtro (3-5 gotas por segundo). Recolher o flow-through em um recipiente de resíduos biológicos. Retire a seringa do filtro sem retrair o êmbolo.
- Após filtração e uma lavagem com PBS, 3 ml de retirar o agente de estabilização de RNA usando uma nova seringa de 5 ml e o método descrito no passo 3.6.8. Lave o filtro como no passo 3.6.9. O agente de estabilização de ARN deve permanecer no filtro. Retire a seringa do filtro sem retrair o êmbolo.
- Selar a entrada do filtro e saída com a tampa da bainha e parafuso retidos a partir do bico de transferência deixando o filtro saturado com o agente de estabilização de RNA. O filtro pode ser armazenado neste ponto. Guarde o filtro a -80 ºC até que o tempo permitir (~ 2 h) para completar os passos 5.3 a 5.4.7.
Nota: Filtros armazenadas a -80 ºC por até um ano após a coleta foram processados sem uma reduSE na qualidade de ARN.
- Remova os Ficoll contendo vacutainers da centrífuga (passo 3.4.1) e continuar em uma capa BSL2. Vacutainers deve exibir separação como na Figura 2. Se não, ver Tabela 2.
- Uma vez que o vacutainer é devolvido para a capa BSL2, retire a tampa e retire 1,5 ml de topo, amarelado, camada de plasma (Figura 2) utilizando uma pipeta sorológica sem ficar perto da mononuclear (branco claro /) camada. Transfira o plasma para a 5 ml cryovial - (Pool de 2 vacutainers - 1 participante). Registrar o volume coletado. Veja o passo 3.7.6 para instruções de armazenamento.
Nota: O melhor separação e maiores rendimentos PBMC vêm de participantes que tenham em jejum, pelo menos, 12 horas antes da coleta de sangue. - Transfira o plasma remanescente e a camada esbranquiçada, mononuclear (tudo acima da camada de gel - A figura 2) ucantar uma pipeta serológica, para um tubo cónico de 15 ml, juntando a camada de células mononucleares a partir de cada um dos dois Ficoll contendo vacutainers por participante num tubo cónico.
- Adicionar 1x PBS para perfazer o volume total no tubo cónico de 15 ml. Tape o tubo e inverta 5 vezes. Centrífuga (com freio e aceleração OFF) 15 min, 300 x g, 22 ° C.
- Voltar à Ficoll contendo vacutainers na capa e recolher as células vermelhas do sangue (RBC), utilizando um "pipeta de Pasteur 5¾ a girar em torno e soltar a parte externa da camada de gel de Ficoll e removê-lo, se possível. Usar uma pipeta serológica para recolher e transferir a RBCs (~ 4,5 ml) para um frasco de congelação 5 ml. Registrar o volume coletado.
- Transferir ambos os 5 ml de plasma em criotubos (passo 3.7.2 e glóbulos vermelhos no passo 3.7.5) para um recipiente de congelamento controlado e colocar a -80 ° C durante pelo menos 24 horas, após o que eles podem ser transferidos para um cryobox e voltou a -80 ºC para armazenamento a longo prazo.
- Retorne o conica para o tubo exaustor, quando a centrifugação no passo 3.7.4 está completa, e aspirar todo mas ~ 500 ul de PBS sem perturbar o sedimento. Rendimento de PBMC é maior se ~ 200 ul de PBS é deixado acima da pelete, nesta fase.
- Adicionar PBS 1x fresco para levar o volume até 10 ml. Delicadamente ressuspender o sedimento. Tape o tubo e inverta 5 vezes. Centrífuga (com freio e aceleração OFF) 10 min, 300 x g, 22 ° C.
Nota: Executar em uma capa BSL2.
- Alíquota da camada superior do soro Vacutainer soro, após a centrifugação (passo 3.2.1), em 2 ml criotubos como desejado. Rendimento típico é de 2,5 ml (Tabela 1). Registrar o volume. Por exemplo, usar 4 cryovials alíquotas de 200 ul em cryovial 1, 1.000 ul em cryovial 2 e, em seguida, dividir o restante em cryovials 3 e 4.
- Transferir os criotubos para um cryobox lugar e a -80 ° C para armazenamento a longo prazo. Documente o início congeladorTempo.
- E volta para o capuz, após a centrifugação (passo 3.7.8), e aspirado tanto sobrenadante / PBS quanto possível, sem perturbar o sedimento. Ressuspender pellet por pipetagem em 2,5 ml PBMC Congelamento Médio 1 (ver SI 2).
- Adicionar 2,5 ml de meio de congelação 2 de PBMC (ver SI 2) para o / solução de meio de células no passo 3.9.1. Vortex suavemente.
- Alíquota de 10 ul da solução de células para um tubo de microcentrífuga de 0,65 ml (diluição adicional pode ser necessário). Adicionar 10 ul de tripano a 0,4% apresentam uma coloração azul para dentro do tubo de microcentrífuga de 0,65 ml e misturar por pipetagem várias vezes. Para mais detalhes veja o manual do fabricante 16.
- Pipetar 10 ul da mistura numa célula de contagem corrediça câmara lugar e deslize para o contador de células dentro de 3 minutos de mistura. Zoom e foco as células. Pressione o botão "Contagem de Células" para obter contar PBMC.
- Alíquota, se o viávelNúmero de PBMC é superior a 3 milhões de células por mililitro (mc / ml), conforme se desejar em criotubos e continuar para o passo 3.9.9. Armazenar as CMSPs em criotubos até 5 a uma concentração de pelo menos 3 mc / ml cada.
- Se o número de PBMC viáveis é inferior a 3 mc / ml, calcular o número total de células através da multiplicação da viável mc / ml com 5 ml. Dividir esse número por 4, 3, 2 ou 1 ml, de modo que haverá pelo menos um tubo com 3 mc / ml.
- Centrifugar o tubo cónico contendo as células / solução de meio de congelamento durante 5 minutos a 300 xg (freio e aceleração OFF). Após centrifugação, aspirar o volume apropriado de meio de congelação (sobrenadante), deixando o volume calculado acima (4, 3, 2 ou 1 mL).
- Ressuspender o sedimento no sobrenadante restante alíquota e, pelo menos, 3 mc / ml para o número apropriado de criotubos (1-4) em 1 ml / frasco de congelação. Meio de congelação final é 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) / 20% de Soro Fetal Bovino (FBS) / 70% de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640.
- Document a contagem de células por frasco de congelação. Transferir os criotubos para um recipiente de congelamento controlado e colocar a -80 ° C durante pelo menos 24 h depois do que os criotubos pode ser transferido para um cryobox e colocar em um tanque de azoto líquido (fase vapor) para o armazenamento a longo prazo. Documento congelador a hora de início.
4. Dia 2 Setup
- Aquece-se uma alíquota (220 ul por filtro) de livre de nuclease 0,1 mM de EDTA num tubo livre de nuclease a 80 ° C num bloco de aquecimento.
- Preparar soluções de lavagem 1 e 2 (ver SI 2).
5. Dia 2: Long Term Amostra de armazenamento e processamento do filtro de leucócitos (3 hr)
- Visão geral.
- Execute este procedimento no prazo de 6 meses da aplicação dos leucócitos para o filtro.
Nota: Em geral, Dia 2 processamento leva cerca de 3 horas e enquanto ele é rotulado de "Dia 2", a principal exigência é que a parte de processamento do filtro deve ser realizada em um dia quandonão há dia 1 de processamento que ocorrem no laboratório.
- Execute este procedimento no prazo de 6 meses da aplicação dos leucócitos para o filtro.
- Armazenamento de amostras a longo prazo (15 minutos)
- Execute este procedimento todos os dias, antes da entrega de novos vacutainers para o laboratório para o dia 1 de processamento. Transfira os criotubos que foram armazenados O / N em recipientes de congelamento controlado no Dia 1 em cryoboxes devidamente rotulados e devolvê-los aos -80 ºC ou nitrogênio líquido (fase de vapor) para o armazenamento de longo prazo. Organizar as criotubos com base no tipo de amostra (por exemplo, ADN, as PBMC, RBCs, etc.) para acelerar a localização da amostra de rastreamento para ensaios de ponto final.
- Leucócitos Filtros de ARN de processamento (45 min).
Nota: Para mais informações sobre este procedimento ver as instruções do fabricante 17.- Traga o filtro à temperatura ambiente (cerca de 5 min a descongelação).
- Remover a tampa de rosca e invólucro do filtro. Retrair o êmbolo de uma seringa de 5 ml e conectá-lo à entrada (extremidade alargada) do filtro, pressionar o êmbolopara expelir o agente de estabilização de RNA a partir dos portos filtrar para um recipiente de resíduos biológicos.
- Carregar uma nova seringa de 5 mL com 4 ml de uma solução de isotiocianato de f enol e de guanidina para o isolamento de ARN e coloque-o da entrada do filtro, pressionar o êmbolo para esvaziar a solução através do filtro, recolhendo o lisado num tubo de 15 mL cónico marcado (2 por participante).
- Desconecte a seringa do filtro, retrair o êmbolo, anexá-lo novamente para o filtro, e pressionar o êmbolo para expulsar amostra residual preso no disco de filtro para os mesmos 15 ml tubo cônico. Descarte o filtro ea seringa.
- Adicionar 800 ul BCP para o tubo cônico, fechar o tubo firmemente e agitar vigorosamente a preparação durante 30 segundos.
- Incubar à temperatura ambiente durante 5 min. Centrifugar durante 10 minutos a 2.000 x g.
- Transferir a fase (topo) aquosa para um recém-rotulados tubo de 15 ml (~ 2,5 mL).
- Adicionar 0,5 vezes o volume da fase aquosa de um livre de nuclease de águad misture bem. Em seguida, adicionar 1,25x o volume aquosa de etanol a 100% e misturar novamente.
Nota: Para um volume aquoso 2,5 ml, adicionar 1,25 ml de água livre de nuclease, misture, em seguida, adicionar 4,7 ml de etanol a 100% (2,5 ml x 0,5 = 1,25 ml água livre de nuclease ENTÃO 2,5 ml + 1,25 ml = 3,75 ml novo volume aquoso ENTÃO 3,75 ml x 1,25 = 4,7 ml de etanol a 100%). Este passo permite que o isolamento de ARN total, que inclui a fracção de ARN pequenas. Um método para omitir os pequenos RNAs de isolamento podem ser encontrados no manual 17. - Retirar o êmbolo de uma seringa de 5 ml e inserir um cartucho de rotação no seu lugar. Fixe o conjunto do cartucho / seringa para um tubo de vácuo. Para uma conexão mais segura para o colector de vácuo, coloque o conjunto do cartucho / seringa dentro de um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, com o fundo cortado.
- Aplicar a amostra a partir do passo 5.3.8 ao cartuxo giratório lentamente com o vácuo na, adicionando mais cuidadosamente amostra tal como é puxado através do cartucho.
Nota: Se nenhum vácuo éActualmente, ver método de centrifugação a http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf. - Transferir o cartucho de rotação para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e adicionar 750 ul de lavagem 1. Centrifugar o cartucho de rotação / conjunto do tubo de 5 - 10 segundos a 12.000 x g.
- Descartar filtrado a partir do tubo e devolver o cartucho de rotação para o mesmo tubo de microcentrífuga.
- Adicionar 750 mL de lavagem 2 e centrifugar o cartucho de rotação / tubo para 5 - 10 segundos a 12.000 x g. Descarte filtrado como no passo 5.3.12. Devolver o cartucho de rotação para o mesmo tubo de microcentrífuga.
- Repita com outros 750 mL de lavagem e centrifugação 2 como no passo 5.3.13. Filtrado descarte. Devolver o cartucho de rotação para o mesmo tubo de microcentrífuga. Centrifuga-se o cartucho de rotação / tubo à velocidade máxima durante 1 min para secar o filtro.
- Transferir o cartucho de rotação para um novo, rotulado tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Adicionar 200 ul de EDTA mM livre de nuclease 0,1 (pré-aquecido a 80 & #176; C) para o centro do filtro de cartucho de rotação (por participante 2). Incubar à temperatura ambiente durante 1 min.
- Centrifugar durante 1 minuto a 12000 xg para eluir o ARN. Manter o filtrado. Descarte cartucho de rotação.
- Dividir cada filtrado 200 mL em duas, 100 mL alíquotas de 1,5 ml em frescos microtubos, rótulo e manter em gelo. Neste ponto, começando com 2 filtros por participante produzirá quatro alíquotas de 100 ul de ARN por participante.
- Tratamento de DNase (1 h)
Nota: Para mais detalhes sobre este tratamento ver protocolo do fabricante 18.- Criar uma mistura principal, combinando 10 ml de DNase I Tampão e 2 ul rDNase I por alíquota + 1 (a conta para a pipetagem de erro).
Nota: Para as quatro amostras, alíquotas de 100 ul 50 ul utilizar ADNase I + 10 ul de tampão de rDNase I. - Alíquota de 12 ul da mistura principal no passo 5.4.1 em cada uma das alíquotas de RNA a partir do passo 5.3.18 e misture delicadamente. Incubar a 37° C durante 30 min num bloco de calor.
- Vortex do Reagente de Inactivação DNase e adicionar 11,2 ul para cada alíquota, misture bem. Incubar à temperatura ambiente durante 2 min vortex 2-3 vezes durante a incubação.
- Centrifugar a 10.000 xg durante 1,5 min.
- Transferir o sobrenadante (ARN) para um novo tubo de 1,5 ml. Aliquotas da mesma participante podem ser reunidas aqui.
- Executar cada amostra num espectros otómetro para obter a concentração. A análise do RNA de qualidade é recomendado utilizar um Bioanalyzer (veja o passo 5.5).
- Alíquota da RNA em criotubos como desejado. Se uma análise Bioanalyzer não irá ser realizada imediatamente, alíquota de 1,5 ul de amostra para um tubo de microcentrífuga para análise posterior. Documentar as concentrações ea hora de início congelador. Armazene as amostras a -80 ° C.
- Criar uma mistura principal, combinando 10 ml de DNase I Tampão e 2 ul rDNase I por alíquota + 1 (a conta para a pipetagem de erro).
- Análise Bioanalyzer (1 hr)
- Siga o protocolo do fabricante 19. Quando a execução é concluída, os dados são automaticamente armazenados, mas salvá-lo novamente wom um menor, nome do arquivo mais reconhecível. Resultados esperados (Figura 3): a escada deve ter picos 6, as amostras devem ter picos de 3 (2 picos ribossomais em 44 seg e 50 seg, respectivamente, e um pico de marcador precoce a 25 seg).
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Representative Results
É essencial que o procedimento geral produzir material de alta qualidade, para análise num grande número de aplicações a jusante, incluindo a expressão do gene através de microarray e análise por RT-PCR, a detecção de modificações epigenética, e variações de subconjuntos de células. A Tabela 1 indica que o rendimento médio e qualidade de materiais a partir de cada um dos processos. A Figura 3 proporciona um exemplo de saída dos métodos de processamento de isolamento de ARN de leucócitos e de filtro de qualidade. A imagem na parte superior esquerda da Figura 3 representa a imagem do gel resultante da electroforese capilar. Cada pista deve produzir duas bandas distintas, com sombreamento mínimo, o que indicaria degradação. Os cromatogramas abaixo do gel de proporcionar uma aparência adicional ao nível e tipo de degradação que pode ser determinado com base na localização e tamanho dos picos. O RNA Integridade Number (RIN) é outra medida de qualidade que varia de 1 (baixo; degradada) para10 (alta; puro, bom RNA qualidade).
Tal metodologia um alto throughput presta-se a um erro ocasional, mas existem vários postos de controle ao longo das várias fases de transformação para garantir o controlo de qualidade. A Figura 2 mostra a separação adequada após a centrifugação do Ficoll contendo vacutainer. Há várias razões para um vacutainer podem não mostrar essa separação, incluindo um erro na velocidade de centrifugação, baixo volume de coleção, ou a falta de um participante jejum como indicado na Tabela 2.
Subconjuntos (n = 100) das amostras isoladas usando este procedimento foram analisados com sucesso por HumanMethylation27 (HM27) Análise de DNA BeadChips incluindo a validação dos resultados por pyrosequencing 11. Genotipagem, alvejado pyrosequencing bissulfito, e em tempo real RT-PCR foi realizada com sucesso no Wildman e Uddin laboratórios 20,21,22,23. Soro, isolado no parALLEL com o isolamento de ADN tanto para o Beadchip e genotipagem análises, foi analisada com sucesso para a IL-6 e C-reactiva actividade da proteína 24. Subconjuntos de células T a partir das PBMC isoladas foram analisadas por citometria de fluxo com sucesso 25-28. Além disso, o ARN a partir de leucócitos do procedimento modificado foi sujeito a expressão do gene Genoma Grande perfilar 29.
Figura 2. Camada de separação de Ficoll após centrifugação contendo vacutainer. A visualização da separação de múltiplos componentes do sangue após a centrifugação. A camada mononuclear é mais purificada, enquanto as outras camadas são armazenadas a -80 ° C. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Resultados esperados do processamento de RNA de leucócitos. Resultados Bioanalyzer exibindo duas bandas distintas que representam 18S e 28S RNA ribossomal com números de integridade de RNA (RINs) acima de 8 isolados com os métodos de leucócitos descrito isolamento do RNA e filtro de processamento (ver protocolo 3.6 e 5.3). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Total de Rendimento Médio (N≈500) | Qualidade média | |
| Sérum | 2,30 mL | N / D |
| ADN a partir de sangue inteiro | 39.97 ug | A absorvância a 260/280 = 1,74 |
| PBMC | 22,25 milhões de células viáveis | Pelo menos 95% de viabilidade de isolamento global |
| ARN a partir de leucócitos | 44.09 ug | A absorvância a 260/280 = 2,01 RNA Integridade Number (RIN) = 6,48 |
Tabela 1. Esperado rendimentos. Quantidade média e qualidade das amostras processadas utilizando os métodos descritos.
| Problema | Solução Potencial |
| Sem separação após centrifugação Ficoll contendo vacutainer | Vacutainer não foi preenchido à capacidade - o volume de recolha mínima para o processamento adequado é de 6 ml. |
| Verifique as configurações de centrífuga, certifique-se a velocidade está em força-g. Se estiver errado, definido para g-force e respin. | |
| Baixa PBMC count | Volume de sangue desenhar muito baixo. |
| Aspirado muito perto do pellet no passo 3.7.8 | |
| Participante não-jejum. | |
| Sem separação após vacutainer soro centrifugação | Verifique as configurações de centrífuga, certifique-se a velocidade está em força-g. Se estiver errado, definido para g-force e respin. |
| Concentração inesperada utilizando o Nanodrop 1000 | Certifique-se a medição é para o tipo de amostra apropriado (por exemplo, ADN ou ARN). |
Tabela 2. Solução de problemas. Os problemas mais comuns encontrados com os métodos descritos e as possíveis soluções.
Folha de rastreamento Tabela 1. Complementar. Um exemplo de rastreamento dos vacutainers from coleta de sangue para a entrega de laboratório. Por favor clique aqui para ver este quadro.
Log Specimen Suplementar Tabela 2.. Um exemplo de documento utilizado para documentar o processamento dos vacutainers no momento da entrega para o laboratório. Por favor clique aqui para ver este quadro.
Tabela Complementar 3. cryovial Sistema de Numeração. Um exemplo do sistema de numeração usado para cada participante. Por favor clique aqui para ver este quadro.
Informações Suplementares 1. Dados pré-processamento. Detalha os deveres do Coordenador do Estudo, Courier e Phlebotomist. Por favor clique aqui para ver informações complementares 1.
Informações Suplementares 2. Receitas. A lista de receitas para os reagentes necessários. Por favor clique aqui para ver informações complementares 2.
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Discussion
Nós descrevemos um protocolo simplificado que tem sido aplicado com sucesso para processar mais de 1.600 amostras de sangue total no Estudo de Saúde Detroit Neighborhood. Apesar de muitas destas técnicas estão disponíveis na literatura existente, a compilação passo-a-passo, incluindo alterações precisamente programado entre cada passo, reflecte, um protocolo optimizado eficiente que produz com sucesso uma variedade de amostras biológicas com uma ampla gama de aplicações a jusante, incluindo a metilação do DNA, expressão de mRNA e análise imunológica. Estes espécimes já foram testados em uma variedade de experiências, cujos resultados foram publicados na literatura peer-reviewed e / ou apresentados em encontros nacionais 11,20,21,23,24,29. Este protocolo deve, portanto, ser de interesse para outros pesquisadores que buscam coletar amostras biológicas em estudos de base populacional semelhante ao DNHS.
Ao utilizar amostras em tal alta throughput forma, é de extrema importância para manter registros precisos em todas as fases. Recomendamos o desenvolvimento de um banco de dados para armazenar todas as informações cryovial no início. Esta base de dados deverá incluir todos os aspectos da amostra dentro de cada cryovial incluindo o volume, concentração, qualidade, código de barras, e local de armazenamento (número caixa de armazenamento e localização no interior da caixa). Recomendamos preparar cryovials pré-rotulados e caixas de armazenamento que contêm um código de barras. Além disso, nós descobrimos que é conveniente ter um documento "mestre" que contém os códigos de barras para cada tubo, específicas para cada participante (Tabela S3). Isso permite a entrada rápida das criotubo dados na base de dados sem manuseamento excessivo das amostras, a introdução de ciclos de congelamento / descongelamento desnecessários para as amostras e elimina a possibilidade de erro humano no inserindo nos códigos de barras manualmente. É também essencial que os rótulos aderir ao extremo (por exemplo, fase, de vapor de nitrogênio líquido a -150 -178ºC) temperaturas. A documentação pode ser demorado, e com a necessidade de um processamento eficiente na entrega, verificou-se que tendo pelo menos dois técnicos dividir os processos produz a maior eficiência.
Uma limitação deste método é a proximidade do laboratório para o local de recolha. Para PBMC isolamento em particular, as amostras devem ser processadas no prazo de 2 horas da coleta, para evitar aumentos significativos na contaminação células vermelhas do sangue e diminui em células mononucleares viáveis. Como tal, o laboratório deve ser não mais do que 30 minutos a partir de um local de coleta para esclarecer quaisquer questões relacionados com o tráfego que possam surgir. Além disso, qualquer laboratório propõe-se realizar o protocolo descrito aqui vai exigir dois técnicos na mão para garantir uma transformação óptima amostra. Além disso, cada laboratório tem de ter acesso ao equipamento necessário para cada passo delineado acima. Assim, laboratórios com menos pessoal e / ou equipamento limitado would provavelmente será incapaz de realizar esse protocolo.
Uma vantagem deste protocolo é a capacidade de recolher amostras diretamente nas casas dos indivíduos consentindo. Isso permite que o estudo para alcançar indivíduos com problemas de saúde mental ou outra que não seria normalmente procuram ajuda médica, talvez por causa de uma falta de seguro ou de transporte. Ele também permite a comparação de indivíduos afetados e não afetados que vivem na mesma comunidade que sofreram gatilhos semelhantes, mas diferem em termos de seus sintomas de saúde mental. A obtenção de espécimes dessa maneira exige sincronismo preciso e coordenação de phlebotomists no campo. Porque o nosso laboratório foi localizado dentro da comunidade estávamos estudando, um flebotomista poderia tipicamente coletar amostras de dois e três casas e entregar as amostras para o laboratório dentro da janela de 2 horas da primeira coleção. Eficiência é a chave para a nossa amostra de transformação, e, como tal, tivemos várias phlebotomists nocampo, aumentando a necessidade de uma coordenação precisa. O laboratório recebeu várias entregas de sangue com até oito participantes por entrega espaçadas 2 horas de intervalo. Os phlebotomists se conheceram em um local designado e combinadas as suas colecções com apenas um phlebotomist entregar as amostras para o laboratório como um único lote. Os métodos descritos aqui podem ser facilmente adaptado para estudar muitos outros fenótipos e os espécimes biológicos recolhidos podem ser utilizados em uma grande variedade de ensaios a jusante.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses conflitantes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | Day 1: DNA isolation |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P5493-1L | Day 1: PBMC isolation |
| 5 ¾” Pasteur pipets | Fisher | 13-678-6A | Day 1: PBMC isolation |
| Fetal Bovine Serum (FBS), heat inactivated | Life Technologies | 10082147 | Day 1: PBMC isolation |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418-500ml | Day 1: PBMC isolation |
| RPMI Medium 1640, liquid | Invitrogen | 11875119 | Day 1: PBMC isolation |
| 0.4% trypan blue stain | Invitrogen | T10282 | Day 1: PBMC isolation |
| Countess Cell Counting Chamber | Invitrogen | C10283 | Day 1: PBMC isolation |
| Countess Automated Cell Counter or cell counting device such as a microscope and hemocytometer | Invitrogen | C10281 | Day 1: PBMC isolation |
| LeukoLOCK Fractionation & Stabilization Kit | Ambion | 1933 | Day 1: Leukocyte RNA isolation |
| 25 G x 5/8 in. needles | Becton Dickinson | 305122 | Day 1: Leukocyte RNA isolation |
| Syringes (5 ml) | Becton Dickinson | 309646 | Days 1 and 2: Leukocyte RNA isolation |
| Denaturing Lysis Solution | Ambion | 8540G | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| 5 M NaCl | Life Technologies | 24740011 | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| TRI Reagent | Ambion | 9738 | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| Bromo-3-chloro-propane (BCP) | Sigma | B-9673 | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| spin cartridges | Ambion | 10051G | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| 0.1 mM EDTA | Ambion | 9912 | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| DNA-free Kit | Ambion | AM1960 | Day 2: DNase treament |
| RNA 6000 Ladder | Agilent | 5067-1529 | Day 2: Bioanalyzer analysis |
| RNA 6000 Nano Series II Kit | Agilent | 5067-1511 | Day 2: Bioanalyzer analysis |
| RNaseZAP | Ambion | AM8782 | Day 2: Bioanalyzer analysis |
| Ethanol >99% | Sigma | E7023-500ml | |
| Isopropanol >99% | Sigma | I9516-500ml | |
| Nuclease-free ultra pure water | Invitrogen | 9938 | |
| Pipette tips (nuclease-free) | Eppendorf | 22491253 | |
| Pipetter (serological) | Eppendorf | 2223020-4 | |
| Pipetters (for volumes under 1 ml) | Eppendorf | 3120000-054 | |
| Pipettes (serological) | Fisher | 13-678-27E | |
| Controlled rate freezing containers | Nalgene | 5100-0001 | |
| Cryoboxes (to hold 2 ml and 5 ml cryovials and 1.5 ml microcentrifuge tubes) | Fisher | 03-395-464 | |
| Test tube rack | Thermo Scientific | 14-804-134 | |
| 15 ml polypropylene tubes | Fisher | 14-959-49D | |
| 1.5 ml and 0.65 microcentrifuge tubes | Fisher | 07-200-534 and 07-200-185 | |
| 2 ml and 5 ml cryovials | Fisher | 10-500-26 and 10-269-88F | |
| 8 ml CPT vacutainer | BD Biosciences | 362761 | 2 tubes |
| 6 ml K2 EDTA vacutainer | BD Biosciences | 367863 | 2 tubes |
| 8.5 ml SST vacutainer | BD Biosciences | 367988 | 1 tube |
| Vortexer | Fisher | 2215365 | |
| Dry bath incubator with heating block for microcentrifuge tubes | Fisher | 11-715-1250 | |
| Filtration/vacuum system for use within the cell culture hood | Fisher | 01-257-87 | |
| Fixed-angle rotor for microcentrifuge tubes with aerosol-tight lid | Eppendorf | 22637002 | |
| Refrigerated centrifuge with a swing-bucket rotor and aerosol-tight caps for 16 x 125 mm vacutainers and 15 ml polypropylene tubes | Eppendorf | 22628157 | 2, one does not need to be refrigerated |
| Nanodrop 2000 (recommended for accuracy of small volumes) or other spectrophotometric device | Fisher | 13-400-411 | |
| Agilent Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2940CA | |
| Liquid nitrogen tank | Thermo Scientific | 11-676-56 | |
| Sharps container | Fisher | 22-037-970 | |
| Biological waste container | Thermo Scientific | 1223P52 | |
| Biosafety Level 2 certified cell culture hood | Thermo Scientific | 13-261-315 |
References
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