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Chemistry

Vorbereitung adhärenter Zellen für die Röntgenfluoreszenzbildgebung durch chemische Fixierung

Published: March 12, 2015 doi: 10.3791/52370
Automatic Translation
1, 2
1X-ray Science Division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory, 2Department of Physics and Astronomy, Northwestern University

Introduction

Röntgen-Fluoreszenz-Bildgebung ermöglicht sowohl für die Identität und Menge der in einer Probe vorhandenen Elemente räumlich aufgelöst werden. Einfallenden Röntgenstrahlen, einer größer gewählt als die Elektronenbindungsenergie der schwerste Element von Interesse zu sein, Energie, die Überwindung der Bindungsenergie von Elektronen der inneren Schale an den Kern 1. Dadurch entsteht ein "Loch" in der Elektronenhülle. Als höherenergetischen Elektronen fallen in diese Löcher werden die Röntgenfluoreszenzstrahlung emittiert, dessen Wellenlänge abhängig von der Energie Trennung dieser Orbitale. Da der Energieabstand der Orbitale ist charakteristisch für ein gegebenes Element weist die Röntgenfluoreszenzemission ebenfalls charakteristischen Wellenlängen, abhängig von dem Element. Es ist diese Emission bei einer charakteristischen Wellenlänge, welche die Identifikation der vorhandenen Elemente ermöglicht. Die Kalibrierung der Fluoreszenzintensität ermöglicht die Quantifizierung der vorhandenen Elemente.

Röntgenfluoreszenz microscopy (XFM) zunehmend genutzt, zum Teil auf die Entwicklung von sehr brillanten Röntgensynchrotronquellen, wie sie bei Spring-8 in Japan, der Europäischen Synchrotron Radiation Facility (ESRF) in Frankreich und der Advanced Photon Source ( APS) in den USA 2. Diese Quellen liefern eine sehr hohe Intensität von Röntgenstrahlen. Zur gleichen Zeit, Verbesserung der Röntgenoptik, wie Zonenplatte Technologie, erlaubt die Fokussierung dieser Strahlen auf Sub-Mikrometer-Spots, wenn auch eher ineffizient 3. Mit sehr hoher Intensität Strahlen, auch eine relativ kleine Menge an Licht, das konzentriert sein kann, ist ausreichend, um die endogenen Metallen in Zellen anzuregen, wodurch Signal, das mit den derzeit verfügbaren Detektortechnologie gemessen werden kann. So studieren die chemische Biologie der Metalle in der Zelle ist eine Anwendung insbesondere die Verwendung von vielen der jüngsten Entwicklungen in dieser Technik 4-10 macht.

Es gibt viele wichtige Faktoren, die in Betracht gezogen werden, während AppLiegen XFM, um die Elementverteilung und Quantifizierung von kultivierten Säugerzellen oder anderen biologischen Proben zu untersuchen. Erstens muss die Probe intakt gehalten werden soll, sowohl strukturell als auch in bezug auf die elementare Zusammensetzung, damit die Messung aussagekräftig zu sein. Zweitens muss die Probe auch in irgendeiner Weise gespeichert, dass sie hart zur Strahlungsschäden, die durch einen fokussierten Röntgenstrahl verursacht werden kann, ist. Eine Möglichkeit, dass eine Probe nur eines dieser Kriterien auf einmal zu erfüllen ist es, sich schnell zu einem glasartigen, amorphen Eis 11,12 eingefroren werden. Schockgefrieren wird oft durch verschiedene Kryokonservierung Techniken wie Tauch Einfrieren oder Hochdruckgefrier 13-16 erreicht. Es ist allgemein anerkannt, dass die Kryokonservierung bewahrt Gesamtzellarchitektur und chemischen Zusammensetzungen in biologischen Proben so nahe nativen Zustand möglich. Chemische Fixierung, auf der anderen Seite, aufgrund der langsamen und selektive Durchdringung von Fixiermittel in Zellen und Geweben als well als nachträgliche Veränderungen in der Membrandurchlässigkeit, können verschiedene zelluläre Ionen besonders die diffundierbare Ionen wie Cl, Ca und K, um ausgelaugt werden, verloren oder verlegt werden, so machen Untersuchung dieser Elemente suboptimal 17-19 ermöglichen. Trotz der klaren Vorteile der Kryo-Fixierung über chemische Fixierung im Allgemeinen, für adhärente Säugetierzellen hat insbesondere die Kryokonservierung verschiedenen Einschränkungen 20-23. Der offensichtlichste ist, dass nicht jede Forschungslabor hat leichten Zugang zu Kryokonservierung Instrumente. Für aktuelle Hochdruckgefriergeräte oder sogar stürzen Gefriergeräte sind teuer und gehören, nur eine Teilmenge der Kryo Einrichtungen, die weit von dem Zellen inkubiert werden kann. Der Vorteil der Kryokonservierung könnte zum Nachteil des Reise Stress auf die Zellen gegeben gehandelt werden. Während also die Kryokonservierung ist sicherlich die härteste Weg, um Proben für die Röntgenfluoreszenzanalyse zu erhalten, ist es sicherlich nicht die zugänglich für alle Forscher, unter allen Umständen;es ist auch nicht immer erforderlich - wenn die Metalle von Interesse sind eng fixierbar Makromoleküle gebunden sind, und die Auflösung, mit der die Probe abgebildet wird größer als die Beschädigung der ultraMikroStruktur, die während der Trocknung auftreten könnte, ist. Eingedenk der Vorbehalte 24 kann chemische Fixierung und Trocknung eine geeignete Wahl sein.

Andere Faktoren, die zu einer erfolgreichen Röntgenfluoreszenz-Bildgebung Test einbezogen korrekte Analyse. Röntgen-Fluoreszenz-Bildgebung ist grundsätzlich Röntgenfluoreszenzemissionsspektroskopie kombiniert mit Rasterabtastformat die räumliche Auflösung zu liefern. Die gesammelten Röntgenfluoreszenzemissionsspektren enthalten eine Kombination von überlappenden Emissionsspitzen, den Hintergrund und die elastischen und inelastischen Streuungspeaks des einfallenden Strahls. Software, die die Entfaltungs dieser Beiträge und der Anpassung der Emissionsspitzen ermöglicht, hat zu diesem Bereich 25 schon eine kritische Entwicklung. Auch die Entwicklung und kommerzielle distribution Dünnschicht Standards bekannter Zusammensetzung verwendet, um die Fluoreszenzintensität relativ zur Materialmenge zu kalibrieren, wurde auch sehr wichtig.

Dieses Protokoll stellt eine Beschreibung der Herstellung der haftenden Zellen durch chemische Fixierung und Lufttrocknung. Ein wichtiger Schritt in diesem Prozess ist das Wachstum der Zellen auf den Siliziumnitrid-Fenster, die oft nicht gut an, so dass sanfte Spülung in einer bestimmten Art und Weise der Schlüssel zum Erfolg.

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Protocol

1. Herstellung des Instruments, Substrate, Kultur, Medien und Gerichte

  1. Handhabung von Siliciumnitrid (Si 3 N 4) Fenster.
    1. Öffnen der Kapsel leicht durch Zusammendrücken eines Endes, die das Fenster in solcher Weise, dass das Fenster sich nicht einklemmen, während sich das andere Ende der Kapsel mit der anderen Hand.
    2. Überprüfen Sie ein Paar umgekehrt zu spitzen Pinzette unter Stereomikroskop stellen Sie sicher, gibt es keine Haft, Lücken oder Kurven an der Spitze. Andernfalls können die Fenster durch die Pinzette oder gebrochen werden wegfliegen von ihnen während der nachfolgenden Schritte.
    3. Entfernen Sie das Fenster aus der Kapsel durch vorsichtiges Greifen der Rahmen des Fensters mit einer Pinzette unter leichtem Zusammendrücken der Kapsel in der Nähe des offenen Endes Anlegen von Druck in einer Richtung, so daß die Kapsel breiter zu machen, wo die Ränder des Fensters müssen kommen.
  2. Fenster Vorwäsche (optional).
    1. Wenn gewünscht, Vorwäsche Fenster durch leichtes Eintauchenin destilliertes Wasser für 5 Sekunden, gefolgt von 2 min waschen in 70% Ethanol und 2 min waschen in 100% Ethanol.
  3. Das Anbringen und Sterilisieren Fenster auf der Kulturschale.
    1. Um die Fenster angebracht werden kann, stellen Sie das Fenster mit der flachen Seite nach oben auf den Boden der Kulturschale, legen Sie ein Stück Klebeband auf einer sauberen Glasobjektträger. Schneiden Sie etwa ein Viertel Zoll-Streifen aus den langen Seite des Bandes. Nehmen Sie ein Stück Klebeband an der kurzen Seite (auf ⅛ "durch ¾") mit einer sauberen Rasierklinge.
    2. Verwenden einer Pinzette, um die Scheibe der Band an den Rand des Gitters oder Fenster gelten. Verwenden Sie genug, um sicher zu halten ist, ohne dabei die Fensteröffnung selbst. Manipulation der halten Band mit einer Pinzette, setzen Sie das Fenster nach unten auf den Boden der Kulturschale. Verwenden Sie die Spitze der Pinzette auf Band auf den Boden der Kulturschale fest haften.
    3. Übernehmen Sie ein anderes Band Streifen zu dem anderen Rand und halten diese auf den Boden fest mit der Spitze der Pinzette.
    4. Nachdem alle FensterKlebeband, sterilisieren Fenster in Kulturschalen mit ultraviolettem (UV) Strahlung. Erreichen dies, indem Sie das Gericht unter der UV-Lampe in einer Steril etwa 1 Stunde.
    5. (Optional) Wenn Fenster mit Poly-Lysin vorbeschichtet werden sollen, müssen so folgende Fenster Sterilisation. Bestreichen Sie die Fenster mit 10 ul sterilem 0,01% Poly-L-Lysin-Lösung für 1 h in einem 37 ° C Inkubator und dann spülen Sie die verbleibende Lösung mit dem Kulturmedium.
  4. Bereiten Puffer für letzten Waschen vor XFM.
    1. Bereiten entweder ein Tris-Glucose oder Piperazin- N, saccharose N '-bis (ethansulfonsäure) (PIPES) Puffer frei von Spurenmetallen mit Osmolalität und pH äquivalent Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (D-PBS) ohne Calcium und Magnesium. Verwenden Sie eine dieser Puffer Zellen spülen, nachdem die Zellen chemisch fixiert.
      1. Um die Tris-Glucoselösung (10 mM Tris, 260 mM Glucose, 9 mM Essigsäure) machen hinzuzufügen 1,4 g Glucose, 36 mg Tris-Base und16 ul Essigsäure und 20 ml Reinstwasser. Dann endgültige Lautstärke auf 30 ml mit Reinstwasser. Keine pH Einstellung erforderlich ist. Lagern Sie bei RT bis zu einer Woche.
      2. Um die Rohre-Saccharose (20 mM PIPES, 200 mM Saccharose) hinzufügen 0,18 g PIPES und 2,0 g Saccharose in 20 ml Reinstwasser und der pH-Wert auf 7,4 mit kleinen Mengen von konzentrierter Essigsäure. Dann endgültige Lautstärke auf 30 ml mit Reinstwasser. Lagern Sie bei RT bis zu einer Woche.
        HINWEIS: Der Grund, zu vermeiden, mit PBS in der letzten Spülung ist, dass die Konzentration von Phosphat, Chlorid und Kalium in PBS so hoch, daß sie mit XFM stören, wenn sie nicht vollständig vor dem Trocknen an der Luft entfernt werden.
  5. Bereiten Puffer für Zell Beschichtung.
    1. Bereiten Sie oder nehmen Sie alle Medien, wie RPMI-Medium 1640, 1x Trypsin-EDTA-Lösung, D-PBS, und andere Reagenzien, wie für die jeweilige adhärenten Zelllinie benötigt, wie sie normalerweise für die Passage der adhärenten o Zellen durchgeführt werdenf Interesse, und wärmen Sie sie auf 37 ° C.

2. Überzug von Zellen

  1. Zu dem sterilisierten Kulturschale gegeben, die Fenster in der Haube mit laminarer Strömung, sanft hinzuzufügen Medien (10 ml für eine 100 mm-Kulturschale), entlang der Seite der Kulturschale in einem Winkel geneigt ist. Vermeiden Sie unnötige Oberflächenspannung oder Fallenmedien direkt auf Oberfläche des Siliziumnitrid-Fenster. Als Medium wird hinzugefügt, langsam entlasten den Neigungswinkel zu beschichten das Gitter und Fenster mit Medien.
  2. Bereiten Sie die adhärenten Zelllinie von Interesse angemessen, Trypsinierung oder Abkratzen der Zellen aus der Platten wie gewohnt für Passagieren des Zelllinie. Führen Sie alle Zellzählung oder andere Vorbereitung notwendig, bevor die Zellen an der frischen Platte.
  3. Hinzufügen von Zellen in die Kulturschale mit Fenstern mit einer Zelldichte, die benötigt wird, um normalerweise zu erreichen 50% -70% Konfluenz innerhalb 24-72 Stunden, und bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% Kohlendioxid. Wachstum der Zellen zu beobachten gelegentlich unter Verwendung eines invertierten Lichtmikroskops, bis die gewünschte Zelldichte (in der Regel 50% bis 70% Konfluenz) erreicht wird.

3. Fixierung von Zellen

  1. Ansetzen 4% Paraformaldehyd in D-PBS durch Verdünnen eines gekauft Lager (wie 25% Paraformaldehyd) und Einstellen des pH auf 7,4 mit Essigsäure (Zugabe von überschüssigem Natriumhydroxid zu der Probe zu vermeiden).
  2. Wenn Zellen erzeugt worden sind, wie gewünscht, und alle Vitalfarbstoffe (wie Hoechst) zur Anwendung, und abgebildet wird, entfernen Sie die Medien durch leichtes Ansaugen, Kippen der Schale in einem Winkel von 45 ° mit einer Hand, und Absaugen von Hand Pipette mit der anderen .
    Hinweis: Alternativ zum Pipettieren verbrauchte Medien, ist eine Alternative zu dem Fenster abholen, tauchen Sie das Fenster in Mikrozentrifugenröhrchen mit D-PBS zweimal und dann legen Sie sie in ein neues Kulturgefäß mit Fixiermittel-Lösungen für 20 Minuten, gefolgt von 2-mal PBS waschen die Rest Fixiermittel zu entfernen. Wenn dies gewählt wird, gehen direkt zu Schritt 3.5.
  3. Spülen Sie die Schale vorsichtig mit D-PBS und sofort zu ersetzen, die entfernte Flüssigkeit durch vorsichtiges Hinzufügen der frischen 4% PFA / PBS, während das Gericht in einem Winkel von 45 ° in Richtung der Seite der Schale halten, Pipettieren, und langsam entspannen den Neigungswinkel zu ermöglichen die Fixierungslösung, um die Fenster zu decken. Halten der Zellen mit dem Fixiermittel für 20 min bei RT überzogen.
  4. Entfernen Sie die Flüssigkeit durch leichtes Ansaugen, wieder wie oben, Kippen der Schale leicht und Absaugen von Hand.
  5. Bringen Sie die Flüssigkeit entfernt durch leichtes Hinzufügen von einigen der Leitungen / Saccharose-Lösung unter Verwendung der in Schritt 3.3 beschrieben Kipp- und Pipettierverfahren.
  6. Wiederholen Sie die Schritte 3.4 und 3.5.
  7. Vorbereitung der Materialien für das Trocknen.
    1. Sammeln fusselfreien Tücher wie Kimwipes, und ziehen Sie eine aus der Box, so ist es praktisch, sehr schnell und einfach.
    2. Bereiten Sie eine saubere, nicht-Ebene stelle das Fenster, um zu trocknen. Set aus einer Kautschukgittermatte der Art, in der Elektronenmikroskopie eingesetzt, die Rippen hat, sokann das Fenster an einem Ende gestützt werden, während es trocknet. Das Fenster aus immer auf die Trockenoberfläche geklebt zu halten, während er trocknet und Drain verbleibende Puffer zu der Kante der Probe.
  8. Sorgfältig tweeze das Band, um das Fenster, um das Fenster aus der Flüssigkeit halten angebracht. Rufen Sie Fenster, die aus der Band kommen, indem eine kleine Menge von Leitungen / Saccharose zu erhalten, um zu schwimmen und dann abholen mit den Reverse-Pinzette.
  9. Vorsichtig (ohne Berührung der Fenster selbst) und gründlich beschmieren überschüssige Leitungen / Saccharose aus dem Rand des Fensters mit einem Kimwipe. Auch beschmieren die Rückseite eingekerbten Bereich mit einem abgerundeten Falte eines Kimwipe.
    ANMERKUNG: Das Ziel ist es, so wenig Kristallisation von Salzen oder Puffern auf der Oberfläche des Fensters wie möglich haben.
  10. Stellen Sie das Fenster auf die Gittermatte. Stellen Sie sicher, dass das Fenster nicht auf dem Gittermatte flach, aber aufgestützt auf einer Kante (über die Kämme der Gittermatte) und berühren so wenig des Rastersmat wie möglich. Lassen Sie das Fenster trocken.

4. Proben Montage und Imaging

  1. Sobald die Probe getrocknet, überprüfen Sie die Anwesenheit von Zellen an den Fenstern mit einem Lichtmikroskop. Führen Sie diese Prüfung, bevor die Vorbereitung der Proben für den Transport in einem Synchrotron.
  2. Verpacken Sie die Fenster für den Transport zum Synchrotron-Beamline-Hosting-Experiments. Sanft Anbringung der Fenster mit Klebeband auf beiden Seiten auf einem Glasobjektträger, dann bringt die Glasträger mit Klebeband an der Unterseite eines Kunststoff-Petrischale. Kleben Sie die Petrischale geschlossen.
    HINWEIS: Vor diesem Zeitpunkt können diese Schritte in einer beliebigen typischen Labor durchgeführt werden. Die folgenden Schritte am besten an einem Synchrotron-Beamline erfolgen.
  3. Entfernen Sie das Klebeband vom Fenster vorsichtig mit einer Pinzette. Verwenden Sie Nagellack, in einer dünnen gleichmäßige Beschichtung auf dem Rand des Fensters, um die Fenster zu einem Aluminiumhalter durch die Beamline Mitarbeiter an der Synchrotron vorgesehen sichern.
  4. Legen Sie die Aluminiumhalter ineine kinematische montieren, und dann legen Sie sie in die richtige Position in der Röntgenmikroskop. Montieren Sie die Probe auf einer Konsole den Anschluss an Motortische, innerhalb der Probenkammer an der Beamline.
  5. Nach dem Verlassen der Probe Röntgenmikroskop Instrument Bereich (einen Stall von Blei gefüllten Wänden), Einrichtung der Scan. Verwendung Strahlrohr spezifische Software, wählen die entsprechende Fläche der Probe zu scannen, während der Anzeige der Position des Röntgenstrahls auf der Probe unter Verwendung einer Kamera mit einer Videofadenkreuz und ausgestattet vororientierte mit nachgeschaltetem Szintillator Kamera.
  6. Wählen Sie die geeignete Auflösung für die Probe, auf der Grundlage einer Schätzung der Größe des kleinsten interessierenden Merkmals. Zur Abbildung einzelner Säugetierzellen (~ 20-40 & mgr; m in der Größe), verwenden Sie eine Auflösung von 0,25 bis 0,5 & mgr; m. Zum Abbilden Bereiche von Geweben und Unterscheidung von Zellschichten voneinander Verwenden einer Auflösung von 2-20 um.
  7. Wählen Sie die passende Verweilzeit für die Probe, auf der Grundlage einer Schätzung der Menge des metal von Interesse vorhanden. Für einen schnellen Überblick Scan, oder wenn große Mengen an Metallen vorhanden sind, verwenden fly Scans mit Verweilzeiten von 30 bis 300 ms pro Pixel. Wenn wenig Material vorhanden ist, oder Metalle der niedrigen relativen Häufigkeit zu messen, verwenden Schritt Scans mit Haltezeiten von 1-2 Sekunden pro Pixel.
  8. Programmieren Sie die Scans in die Strahllinie spezifische Software. Erwerben Sie ein Raster-Scan-Bild. Arbeiten Sie zusammen mit den Beamline Mitarbeiter, um die Daten mit einer Software, die die charakteristischen Energiespitzen für jedes Element zu identifizieren analysieren.

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Representative Results

Die Fähigkeit der Röntgenfluoreszenzabbildung, um Informationen über biologische Proben bereitzustellen ist abhängig wobei diese Proben in einer Weise, dass sie robust gegenüber Strahlungsschäden auf der Zeitskala des Experiments sind, hergestellt, und doch ihre chemischen und strukturellen Merkmale gut erhalten. Bei der Betrachtung des Ergebnisses einer Probe, die hergestellt wurde wie oben beschrieben und abgebildet wird, ist es möglich zu sehen, dass es eine Variation in der vorhandenen Elemente - was anzeigt, daß Fixierung konserviert diese Aspekte der Zelle (1).

Umgekehrt suchen anstatt in einer Probe, in der dieser Prozess nicht gut gehen, und der Puffer bei der Trocknung gegenwärtig bleibt, erstellt umfangreiche Kristallbildung von den vorhandenen Moleküle vor Schäden an den Zellen und stört die Sammlung des Röntgenfluoreszenzspektren ( Abbildung 2).

Diese Bilder werden durch die Pro-Pixel-Montage erzeugt der Röntgenfluoreszenzspektrum in jedem Punkt in dem Bild. Dies bedeutet, daß jedes Spektrum bei jedem Pixel gesammelt wurde individuell analysiert. Beim Betrachten der Platten in den Bildern aus den angepassten Daten erzeugt, ist der Wert, der jedem Bildpunkt zugeordnet ist die integrierte Summe einer Gauß für die charakteristische Emission eines gegebenen Elements (zB Eisen), wie am besten die Röntgenfluoreszenz Spektrum an diesem Punkt gesammelt. Zum Beispiel kann ein einzelnes Pixel in dem Bild hat einen Wert (Zahl) für Eisen, welches die Summe der Fläche unter einer Gauß'schen Kurve bei der charakteristischen Emissionsenergie für Eisen ist, daß Passungen und Modelle die Daten für das Emissionsspektrum dieses Punktes auf der Probe. Die Daten werden mit Schwellenwerten über jedem Bild (max und min), die die Hoch- und Nieder Enden der Farbtabelle (im unteren Bereich jedes Bildes) auf bestimmte Werte innerhalb des Bildes zuzuweisen angezeigt.

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Abbildung 1. Röntgenfluoreszenzbild eines menschlichen SH-SY5Y Zellen. Jedes Feld in diesem Bild zeigt verschiedene Informationen über den gleichen Zellen. Die erste Platte, beschriftet DIC ist das optische Differentialinterferenzkontrastmikrogramm der Zellen. Die folgenden Platten, von links nach rechts, sind Phosphor (P), Schwefel (S), Eisen (Fe), und Zink (Zn) Bilder der gleichen Zellen, die ihre Verteilung über den Bereich der Zelle. Die dargestellte Maßstab ist 20 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung zu sehen.

Abbildung 2
Abbildung 2. Röntgenfluoreszenzbild eines Ratten B103 Cell, mit schlechter oder unzureichender Entfernung der Puffer vorbereitet. Zwei Zellen in der Phosphor (P) Tafel sichtbar sind,und in der Eisen (Fe) und Zink (Zn) Platten leicht sichtbar. Jedoch ist das Vorhandensein von kristallisiertem Puffer als Abstrich von Partikeln durch die Mitte des Bildes sichtbar, verdeckt die meiste Information. Die dargestellte Maßstab ist 20 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung zu sehen.

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Discussion

Röntgenfluoreszenz-Bildgebung ist in vielen Bereichen, einschließlich der Geowissenschaften, Materialwissenschaften und der chemischen Biologie 26-34 nützlich. Fortschritte in der Synchrotron-Röntgenstrahlen und ihre Fokussierung haben sehr hoher Intensität Strahlen erzeugt. Fokussierten Röntgenstrahlen ausreichend ist, um die endogenen Metallen in Zellen existieren nun erregt, wodurch Signal, das mit den derzeit verfügbaren Silizium-Driftdetektortechnologie gemessen werden kann. Und das Studium der chemischen Biologie von Metallen in der Zelle ist eine Anwendung insbesondere die Verwendung von vielen der jüngsten Entwicklungen in diesem Bereich macht.

Dennoch stellt die Untersuchung von biologischen Materialien unter Verwendung von Röntgenfluoreszenz-Mikroskopie auch spezielle Herausforderungen, relativ zu anderen Materialien, weil sie hydratisiert werden. Um Strahlenschäden zu vermeiden, im Idealfall die Proben würden in glasigen Eis während der Messung eingefroren werden. Allerdings chemische Fixierung und Trocknen an der Luft sind viel zugänglicher für den Neuling und kann sinnvoll, wenn die Metallevon Interesse sind inert zu fixierbar Makromoleküle gebunden sind, und die Auflösung, mit der die Probe abgebildet werden, die größer als die Beschädigung der ultraMikroStruktur, die während der Trocknung auftreten könnte, ist.

Bei der Prüfung der Substrate für adhärenten Zell XFM Studien muss ein ideales Substrat, folgende Grundvoraussetzungen erfüllen: 1) unterstützt robusten Zellwachstum ohne Wechsel normale proliferative und phänotypischen Zellwachstum, müssen 2) keine Röntgenfluoreszenz, die mit denen von Elementen überlappt von Interesse, 3) optisch transparent für das Zellwachstum Beurteilung unter dem Lichtmikroskop vor XFM und 4) in der Lage, jede physikalische und chemische Manipulation während der Kultivierung und anschließende Fixierung standhalten. Historisch gesehen, unterschiedliche Substrate, von dünnen Folien aus Polycarbonat / Folien 35-37, Formvar beschichtete Goldtransmissionselektronenmikroskopie (TEM) Gitter 38-42 und Siliziumnitrid Fenstern 5,17,43-46, wurden verwendet, um Säugetierzellen wachsens und für die Röntgenfluoreszenzabbildung verwendet wird. Im Vergleich zu den bestehenden und potentielle Substrate zum Abbilden adhärenten Säugerzellen durch XFM, Siliziumnitridmembran (Si 3 N 4) Fenster sind aufgrund ihrer geringen Fluoreszenzhintergrund und relativ einfache elementare Zusammensetzung 4-6,47,48 geeignetsten. Zusätzlich Si 3 N 4 Fenstern unterstützt robuste Zellhaftung und Proliferation. Im Vergleich zu anderen üblicherweise verwendeten Substrate wie TEM Gittern, Si 3 N 4 Fenster haben auch eine viel größere ununterbrochene Bebilderungsbereich was ein besonderer Vorteil, wenn diese Fenster für die Röntgentomographie ist.

Si 3 N 4 Fenster sind im Handel von einer begrenzten Anzahl von Anbietern. Arbeiten mit Siliziumnitrid-Fenster ist eine erworbene Fähigkeit. Die Fenster sind sehr empfindlich und erfordern sehr darauf, keine Drehkräften nicht erstellt beim Umgang mit ihnen, dass sie zerbrechen könnte, oder, um sie fallen zu lassen. Handling sie an den Kanten bei Gegen Pinzette ist ein beliebter Ansatz. Die meisten Fenster haben Dicken im Bereich von 30 nm bis 500 nm und einer Breite von 1 x 1 mm bis 5 x 5 mm. Im Allgemeinen, je dicker die Membran, die robuster sind, um alle Arten von Stress umgehen. Jedoch mit einer erhöhten Dicke und weniger optische Transparenz, sie werden die Hintergrundemission von der Probe zu erhöhen. Die 200 nm dicke Membranen sind ganz ideal. Sie einen minimalen Einfluss auf die Messung, sind jedoch stabil genug, um ohne viel Bruch gehandhabt werden.

Obwohl viele Zelltypen getestet anfänglich befestigen und robust wachsen auf den sterilen Si 3 N 4 Fenstern Zellen auf Siliziumnitrid Fenster gewachsen sind im allgemeinen viel leichter bewegt als Zellen auf traditionellen Zellkulturplatten. Sie leicht ablösen, aggregiert oder aufgerundet Selbst bei Routinemedienwechsel. Wir fanden, vorgewaschen Fenster oft zu mehreren hydrophilen, Zellen lagern besser und hatte weniger chance, gemeinsam aggregieren. Die im Protokoll beschriebenen Schritte oben beschreiben einen sanften Wasch Ansatz hält die Zellen auf dem Fenster. Einige andere Schritte, die ergriffen werden können, schließen die Fenster Beschichtung mit Poly-Lysin oder Laminin, genauso wie man Mantel ein Deckglas.

Ein weiterer Aspekt dieses Verfahrens, daß der Erfolg oder Misserfolg einer gegebenen Experiment sein kann, ist Rühren der Proben. Bei der Beobachtung Wachstum Zellen auf Kunststoff-Kulturgefäße, wird der Normalbereich der Agitation von Pipettieren und Plattentransport resultierenden nicht viel Schaden anrichten. Doch für Zellen auf den Siliziumnitrid-Fenster gewachsen, besonders vorsichtig beim Medienwechsel und Transportplatte benötigt wird. Für einige leicht geschüttelt Zellen wie Maus-Fibroblasten-Zellen NIH / 3T3, die Kulturplatten, die Fenster müssen vorsichtig behandelt werden. Sie wurden sorgfältig aus dem Inkubator genommen und sanft auf dem Mikroskoptisch oder Gehäuseoberfläche gesetzt. Nicht jede kleine physical Schock der Zellen stören, aber das Risiko von Zellablösung ohne zusätzliche Pflege erhöht. Zusätzlich können verschiedene Chargen von fetalem Rinderserum und Siliziumnitrid Fenstern bestimmter Auswirkungen auf die Bindung von Zellen auf dem Fenster zu haben. Einige Quellen von Serum oder Chargen von Fenstern scheint einfacher, mit, also arbeiten, ohne zu sehen, zu viel Störung durch ähnliche Pflege. So kann etwas Versuch und Irrtum für die Zelllinie von Interesse mitgeteilt.

Entwicklungen in kryogenen Stufen für die Röntgenfluoreszenzmikrosonden sowie die Forschung auf die Herstellung von gefrorenen hydratisierten biologischen Proben ist es wahrscheinlich, dass die Probenvorbereitung in der Zukunft sehr viel mehr schließen gefrorene hydratisierte Proben. Viele der gleichen Probleme bei der Arbeit mit den Siliziumnitrid Fenster und Beibehaltung Zelladhäsion existieren auch dort. Doch die Beherrschung dieser Technik bleibt ein sehr guter Ort, um bei der Entwicklung von Fähigkeiten zu starten, bevor die Kryokonservierung, einnd viele Male, ist eine perfekt geeignete Weg, um Bildproben.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon nitride windows Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, United Kingdom SiRN-5.0-200-2.0-200. Order by size. Membrane size: 1.5 mm x 1.5 mm. Thickness: 200 nm. Frame size: 5 mm x 5 mm. Frame thickness: 200 µm. Alternate source: SPI Supplies / Structure Probe, Inc. West Chester, PA.
Reverse tweezers Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 78520-5X EMS 5X, NC – Ultra Fine Tweezers
Rubber grid mat Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 71170 Round Grid Mat
Acetic acid Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052 338826 trace metals grade concentrated acetic acid
PIPES buffer Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052 P6757 solid PIPES buffer
Formaldehyde stock solution Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 RT 17113 10 x 10 ml ampules of 20% aqueous paraformaldehyde

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Vorbereitung adhärenter Zellen für die Röntgenfluoreszenzbildgebung durch chemische Fixierung
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Finney, L. A., Jin, Q. Preparing… More

Finney, L. A., Jin, Q. Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation. J. Vis. Exp. (97), e52370, doi:10.3791/52370 (2015).

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