Introduction
Le cancer colorectal (CRC) est le 4 ème cause la plus fréquente de tumeur maligne dans le monde entier 1. Malgré les progrès significatifs dans notre compréhension de la base familiale de cette maladie, la prédisposition génétique ne contribue à ~ 20% des cas de CCR 2. Le reste est attribuable à de nombreux facteurs extrinsèques et environnementaux, y compris l'inflammation chronique. Chez les humains, le lien entre l'inflammation chronique et le cancer du côlon est évident dans la colite ulcéreuse (CU) patients, qui ont un plus grand risque de développer un cancer du côlon de la colite associée (CAC), en fonction de la durée, l'étendue et la gravité de la maladie inflammatoire 3 -5. Par conséquent, de nouvelles thérapies sont en développement pour contrôler la réponse immunitaire et la production associée de facteurs de croissance par la promotion de la micro-environnement de la tumeur inflammatoire 6-8. Il existe une demande croissante pour des modèles animaux précliniques appropriées pour caractériser l'efficacité thérapeutique deces médicaments contre le développement et la progression de la maladie.
Des modèles murins ont démontré sans équivoque que le microenvironnement inflammatoire contribue à la progression CRC, même en l'absence d'inflammation manifeste 9,10. Ces modèles comprennent l'utilisation du sulfate de polysaccharide dextrane sodique (DSS), prévue dans l'eau de boisson des souris, pour modéliser des blessures épithéliales de l'intestin et des maladies inflammatoires aiguës et chroniques (IBD) 11,12. Bien que le mécanisme par lequel DSS induit des lésions de la muqueuse et colite est pas complètement compris, certaines études suggèrent que le MAS inhibe les activités de la transcriptase et ribonucléase inverse cellulaires dans les cellules, ou favorise la formation de complexes de nano-lipide qui fusionnent avec la membrane du colon conduisant à dommages épithéliaux 13,14. Les modifications apportées au modèle de la norme DSS ont également permis de mieux comprendre les mécanismes par lesquels les cellules épithéliales du côlon maintien de l'homéostasie tissulaire et réglefin muqueuses réponses immunitaires 15.
L'administration intrapéritonéale de azoxyméthane (AOM) seul ou en combinaison avec le DSS, fournit un modèle pour examiner l'interaction entre les mutations somatiques dans la muqueuse épithéliale et le microenvironnement inflammatoire et stromale 16,17. AOM est un métabolite de l'agent cancérigène 1,2-diméthylhydrazine (DMH) qui ne entraîne pas directement mutations de l'ADN. Au lieu de cela, AOM est hydrolysé pour méthylazoxyméthanol (MAM) par le cytochrome isoforme CYP2E1 dans le foie, où MAM est conjugué avec l'acide glucuronique et ensuite transporté à travers l'intestin 18 sécrétions biliaires. On pense que la β-glucuronidase bactérienne contribue à la dégradation de l'ADN résultant en MAM alkylation et l'accumulation de mutations dans les cellules epitheliales 19. La plupart des tumeurs du côlon induite AOM-hébergent des mutations faux-sens dans le gène codant la β-caténine, ce qui rend la protéine résistante à la degradati de protéasomesur, ce qui entraîne une activation aberrante de la voie Wnt canonique de signalisation 20. Lorsque l'activité de l'OMA est combiné avec lésions de la muqueuse induite par DSS, la plaie qui a suivi la guérison réponse crée un micro-environnement qui soit propice à la croissance et à l'expansion de l'épithélium mutagénisé. Dans une variante de ce modèle, l'administration répétitive de AOM seul sur une période de plusieurs semaines peut être utilisé pour modéliser le cancer colorectal sporadique, en l'absence de la colite induite par DSS-10,17. Ces deux modèles gratuits fournissent des paramètres expérimentaux pour étudier CAC et sporadique CRC, respectivement, qui sont tous deux associés à un microenvironnement tumoral pro-inflammatoire 10.
L'utilisation d'endoscopie en série chez des souris a été lancée par Becker et al 21, et permet de surveiller longitudinal de la colite et la progression tumorale. Ici nous fournissons trois protocoles pré-cliniques sur la base de lésions de la muqueuse induite DSS et / ou AOM-tu médiationmor induction pour induire de manière reproductible pathologies du côlon spécifiques. Le premier protocole décrit induire lésions de la muqueuse aiguë en réponse à l'administration DSS pour susciter de nombreuses caractéristiques histopathologiques associés aux MII. Le deuxième protocole est basé sur trois cycles consécutifs d'administration DSS pour imiter les fusées de l'inflammation fréquemment observée chez les patients atteints de MII et peut être réalisé en collaboration avec des mutations induites AOM. Le protocole final est basé sur les mutations épithéliales sporadiques induite AOM. Pour chacun de ces protocoles, nous étendons sur les procédures standard en matière d'inclure les méthodes d'intervention prophylactiques et thérapeutiques que nous avons développés pour contrôler l'efficacité de nouveaux médicaments.
Protocol
L'Institut Walter et Eliza Hall of Medical Research comité d'éthique des animaux a approuvé chacune des procédures décrites dans ces protocoles.
1. Préparation des souris expérimentales
- Composez cohortes expérimentales d'au moins 4 semaines entre les sexes appariés 6-8 vieilles souris C57BL / 6 (M. musculus) qui sont élevés et logés dans le même agent pathogène spécifique (SPF) animalerie / chambre et fournis avec de la nourriture et de l'eau autoclave. L'utilisation de souris femelles permettra co-logement de souris à partir de différentes lignes, numéros de case limite, et réduire la variation cage à cage.
- Veiller à ce que les souris sont au moins 6 semaines d'âge pour permettre des procédures d'endoscopie utilisant la gaine diamètre de 3,0 mm endoscopie.
- Utilisation des souris de la même origine génétique et, si possible, de cages stockés sur le même rack pour réduire les variations associées à la microflore intestinale. Variations de la microflore entre les installations d'animaux devraient être prises en considération when déterminer les souris et les génotypes de contrôle appropriées pour chaque expérience 22.
- Mark souris par des coupures oreille / d'orteil, tatouages, ou similaires pour permettre une identification facile.
- Peser souris au jour 0, pour déterminer les poids de référence expérimentaux.
- Effectuer endoscopie (voir la section 5) de souris au jour 0 pour enregistrer phénotypes coliques base.
2. instance pré-clinique dans une altération de l'épithélium et la colite aiguë Modèle
- Préparer une solution de l'agent thérapeutique à tester. Pour thérapeutiques délivrés par gavage oral (po), préparer des solutions à un volume maximal de 100 ul. Pour thérapeutiques délivrés par voie intrapéritonéale (ip) injection, préparer des solutions à un volume maximal de 200 ul.
REMARQUE: répétée ip ou po administration du médicament sur des périodes de temps prolongées peut entraîner un comportement de la souris modifiée. Alternez le site d'injection ip pour éviter le malaise prolongée. Pour l'administration orale, fournir les souris avec Autocbaigné graines de tournesol en tant que «traiter» pour minimiser l'association indésirable avec la procédure de gavage. - Le Jour 1, administrer le thérapeutique d'intérêt (préparé à l'étape 2.1) et les contrôles de véhicules appropriés. Dans l'exemple fourni (figure 6A), 5 ug de recombinant humain (rh) iInterleukin (IL) -11 protéine a été dissous dans 200 ul de tampon phosphate salin (PBS) et administré ip
- Déterminer le moment et la fréquence des administrations, qui sera dépendant du profil pharmacocinétique établi pour le réactif thérapeutique qui est testée. Figure 1 illustre un traitement prophylactique en utilisant des injections deux fois par jour ip au cours de l'expérience.
- Surveiller, notamment la consistance des selles et la présence de sang, et peser chaque souris quotidienne. Sur les jours de traitement, d'un poids devrait coïncider avec l'administration du médicament thérapeutique pour minimiser le stress aux souris provoquées par des manipulations répétées. Le jour 3, préparer 2,5% (2,5 g / 100 ml) de solution DSS dans l'eau de boisson fournie régulièrement à la souris par l'animalerie. Environ 5 ml / souris / jour de solution DSS est requis pour l'expérience. La consommation de l'eau DSS peut changer si la température ambiante de l'animalerie fluctue.
REMARQUE: DSS est un irritant et doit être manipulé conformément aux instructions des fiches signalétiques. - Fournir DSS frais aux souris ad libitum dans des bouteilles d'eau potable pour cinq jours consécutifs. Dans la soirée du Jour 5, fournir de l'eau potable normale, en plus de boulettes de nourriture en purée et un supplément de protéines fournie dans les petites boîtes de Pétri (100 g granulés alimentaires / 10 g de protéines de bougé / 10 ml d'eau). Cela empêche la déshydratation et aide à réduire au minimum la perte de poids sévère.
- Euthanasier les souris par l'intoxication CO 2 et de recueillir des tissus pour l'analyse histologique ultérieure le matin du Jour 8, ou lorsque les souris vivent ≥15% de perte de poids de plus de trois consecutive jours, selon la première éventualité.
REMARQUE: Réglez la dose DSS entre 1-4% (p / v) en fonction de la microflore de l'animalerie et le lot de DSS. Effectuer, les tests de routine des lots pour établir la dose appropriée de DSS et la variation contourner lot à lot. Le dosage approprié doit être basée sur la perte de poids (pas plus de 15% du poids initial) et confirmé la colite histopathologie.
3. instance pré-clinique dans une colite chronique ou modèle de cancer colite associée
- Pour le modèle de colite chronique commencer à l'étape 3.7.
- Pour le modèle cancer de la colite associée (CAC), le Jour 1, injecter chaque souris avec 10 mg / kg (p / p) azoxyméthane (AOM, 250 pi, ip).
REMARQUE: AOM est un cancérogène et doit être manipulé conformément aux instructions des fiches signalétiques. - Les solutions mères d'OMA sont préparés comme 10 mg / ml aliquotes et stockés à -20 ° C. Le jour de l'injection, la solution mère de l'OMA est décongelé et dilué à 1 mg / ml dans du PBS. Congélation et la décongélation de la solution mère AOM répétée doivent être évités.
- La dose peut être ajustée AOM entre 8-12 mg / kg. Les tests de routine des lots est nécessaire pour établir la dose appropriée AOM afin de contourner la toxicité à des souris dues aux variations de lot à lot.
- Lors des Journées 1-7 suivants poids de l'administration de l'OMA seront stables et pour cette raison la surveillance de poids peut être omis lors des Journées 1-7 pour éviter la manutention des animaux qui excréter métabolites cytotoxiques dans leurs excréments.
- Le jour 7 toute la literie doit être changée suivant les procédures cytotoxiques. Une fois le changement de literie est complète, les animaux ne ont plus besoin des procédures de manipulation cytotoxiques, car ils ne seront plus excréter métabolites cytotoxiques.
- Au jour 8, préparer 2,5% (2,5 g / 100 ml) solution DSS (comme décrit à l'étape 2.5) et fournir à la souris ad libitum.
- Peser souris quotidiennement tout au long de l'expérience et de surveiller les signes de la maladie, y compris fu volantsr, se courber, selles sanglantes et le mouvement réduite.
- Le Jour 13, retirez la solution DSS et fournir les souris avec de l'eau potable normale jusqu'au jour 28. Jours 8-28 constituent l'un «cycle» du protocole colite / CAC chronique.
- Les jours de 13 à 28, lorsque les souris reçoivent de l'eau potable normale, fournir les souris avec des boulettes de nourriture en purée et un supplément de protéines fournie dans les petites boîtes de Pétri (100 g boulettes de nourriture / 10 g Protein Shake / 10 ml d'eau). Cela empêche la déshydratation et aide à réduire au minimum la perte de poids sévère.
REMARQUE: Les suppléments de protéines dans la purée ne doivent pas être fournis lorsque les souris reçoivent DSS-contenant de l'eau potable afin d'assurer la cohérence de la consommation DSS. - Le Jour 20 effectuer le second examen endoscopique pour surveiller la santé individuelle de la souris (voir la section 5).
- Le jour 29 répéter le cycle DSS (Cycle 2: 2,5% (p / v) du SSD lors des Journées 29-33 et de l'eau potable normale lors des Journées 34-50).
- Le jour 40 effectuer la third examen endoscopique pour surveiller la santé individuelle de la souris et de déterminer la charge tumorale (voir la section 5).
- Si aucune tumeurs sont visibles par endoscopie le jour 40, commencer un troisième cycle de DSS Days 50-72 (Cycle 3: 2,5% (p / v) du SSD lors des Journées 50-55 et de l'eau potable normale lors des Journées 56-72). En général, les tumeurs peuvent être consultées par jour 40 et par conséquent le troisième cycle de DSS peut être omis.
- Une fois les tumeurs deviennent visibles par l'examen endoscopique, attribuer à chaque souris un score endoscopique de la tumeur (voir la section 5) et attribuer souris individuelles à des cohortes avec charges similaires tumorales base.
- Le jour 42 (ou lorsque les tumeurs sont visibles), administrer le composé thérapeutique ou le contrôle du véhicule concerné (voir section 2.2). Le calendrier des doses dépendra le profil pharmacocinétique de l'agent thérapeutique. Un exemple d'un traitement d'intervention injecté ip trois fois par semaine chez des souris avec des tumeurs établies est prévu (figure 2).
- Effectuer eexamens ndoscopic une fois par semaine pendant la durée du traitement thérapeutique pour surveiller la charge tumorale. Généralement, quatre semaines d'un traitement thérapeutique est suffisante pour observer une réponse au traitement objectif. Après l'arrêt du traitement, une cohorte de souris peut également être contrôlé par endoscopie de rechute de la tumeur.
- Euthanasier les souris par l'intoxication CO 2 et de recueillir des tissus pour l'analyse biochimique et / ou histologique le matin du jour 72 ou lorsque les souris vivent ≥15% de perte de poids de plus de trois jours consécutifs, selon la première éventualité.
4. instance pré-clinique dans un cancer colorectal sporadique Modèle
- Le Jour 1, injecter chaque ip de la souris avec 10 mg / kg AOM (voir l'étape 3.2). La dose peut être ajustée AOM entre 8-12 mg / kg. Les tests de routine des lots est nécessaire pour établir la dose appropriée AOM afin de contourner la toxicité à des souris dues aux variations de lot à lot.
- Répéter l'injection, le premier jour de chaque semainepour les cinq semaines suivantes (figure 3). Les souris doivent être traités conformément à des procédures de sécurité cytotoxique pour l'ensemble des 6 semaines.
- Peser chaque souris sur le jour de l'injection d'AOM minimiser la détresse des souris provoquées par des manipulations répétées.
REMARQUE: AOM est un cancérogène et doit être manipulé conformément aux instructions des fiches signalétiques. - Tous les animaux doivent être traités conformément aux procédures de sécurité cytotoxiques pour les six semaines de AOM injections ip requises pour ce protocole.
- Pendant huit semaines effectuer un examen endoscopique pour surveiller les tumeurs émergents (voir la section 5). L'examen endoscopique doit être effectuée toutes les deux semaines jusqu'à ce que les tumeurs deviennent visibles. Généralement, de type sauvage C57BL / 6 animaux commencent à développer des tumeurs d'environ 40 semaines après l'administration initiale de l'OMA.
- Une fois les tumeurs deviennent visibles par l'examen endoscopique, assigner chaque souris un score endoscopique de la tumeur (voir la section 5) et attribuer souris individuelles à une cohorte similaire charges tumorales avant le début du traitement thérapeutique.
- Cours de la semaine 40 (ou lorsque les tumeurs sont d'abord visibles), administrer le composé thérapeutique ou le contrôle du véhicule concerné.
- Le calendrier des doses dépendra le profil pharmacocinétique de l'agent thérapeutique (voir étape 2.1). Un exemple d'un traitement d'intervention injecté ip 3 fois par semaine chez des souris avec des tumeurs établies est prévu (figure 3).
- Effectuer hebdomadaire d'examen endoscopique de la durée des périodes de traitement thérapeutique pour contrôler la charge tumorale. Généralement, quatre semaines d'un traitement thérapeutique est suffisante pour une réponse au traitement objectif. Après l'arrêt du traitement, une cohorte de souris peut également être contrôlé par endoscopie de rechute de la tumeur.
- Euthanasier les souris par l'intoxication CO 2 et de recueillir des tissus pour l'analyse biochimique et / ou histologique du colon et de tumeurs au cours de la semaine 45, ou après 4 semaines de traitement.
- Le matériel d'endoscopie doit être assemblé selon des procédures standard 16.
- Stériliser et nettoyer la sonde de l'endoscope avec 70% d'éthanol ou un lubrifiant anti-bactérienne.
- Les vidéos peuvent être enregistrées en utilisant un ordinateur portable ou de bureau et des logiciels de support standard, comme iMovie. Un moniteur d'ordinateur standard, plutôt que d'un moniteur de qualité médicale, est suffisante pour visualiser le côlon au cours de la procédure d'endoscopie (figure 4).
- Anesthésier des groupes de 5-6 souris simultanément dans une chambre avec 3% d'isoflurane dans 100% de O 2 à un débit de 0,2 à 0,4 L / min. Une fois que la souris sont anesthésiés, ce qui est confirmé par pincement de l'orteil; les niveaux de l'isoflurane devraient être modifiés pour 0,5 à 2% pour l'entretien.
- Supprimer une souris individuelle de la chambre, et le placer face ventrale avec sa tête fixée dans un embout conique. Anesthésie complets doivent être surveillés et les pattes de derrière doivent être ajustés de sorte qu'ils sont stretched derrière la souris.
- Placez une pommade vétérinaire sur les yeux des souris pour prévenir la sécheresse.
- Maintenir la queue de la souris où il rencontre la colonne vertébrale inférieure de révéler clairement l'anus. Insérer la gaine de l'endoscope rigide dans un bécher d'eau et ajuster le débit d'air pour permettre la libération d'une petite bulle à la fois.
- Le flux d'air permettra de gonfler le côlon. Si le flux d'air est trop fort, l'air est pompé dans l'estomac de la souris. Aucune lubrification supplémentaire ne est nécessaire.
- Insérez délicatement la gaine de l'endoscope rigide dans le rectum. Généralement, l'endoscope peut être inséré jusqu'à 3 cm, à quel point le côlon dans les courbes de souris et ne est pas accessible à l'endoscope rigide.
- Une difficulté commune au cours des procédures d'endoscopie est le blocage de l'accès à la lumière du côlon du fait de la matière fécale. Évitez cela en massant doucement du ventre des souris avant la procédure d'encourager la défécation ou attentivement la manœuvre de l'endoscope dans le fecal question au cours de la procédure. Péristaltisme peut également se produire, au cours de laquelle l'endoscope doit être maintenu en position jusqu'à ce que la musculature du côlon détend.
- Lancer l'enregistrement vidéo à ne importe quel stade de la procédure d'endoscopie. Maladie notation peut être enregistrée par un assistant expérimenté lors de la procédure, ou à un moment ultérieur à partir des fichiers vidéo.
- Suite à l'examen endoscopique, retourner les souris de leur cage et les surveiller lors de la récupération de l'anesthésie. Les animaux sont généralement éveillé et mobile à l'intérieur 2 min après le retrait de l'isoflurane administration cône de nez.
- Veiller à ce que ces procédures sont effectuées par un scientifique expérimenté. Chaque procédure d'endoscopie prendra environ 2 min par souris.
6. Maladie de notation
- Pour surveiller la colite, marquer vidéos pour l'indice murin endoscopique de sévérité de la colite (MEICS) 16, qui documente les changements dans (i) l'épaisseur de la paroi du côlon indiqué par la transparence, (Ii) la consistance des selles, (iii) l'intégrité du vaisseau sanguin et de la présence, (iv) les ulcères et les zones de régénération qui présentent de façon granulaire, (v) le saignement indiqués par des dépôts de fibrine (figure 5a).
- Pour surveiller la charge tumorale, marquer vidéos pour l'incidence des tumeurs et la taille. La taille des tumeurs est déterminée par le diamètre de la lumière colique occupées par la tumeur 16 (figure 5b). Il est courant d'utiliser les deux paramètres de colite et de notation de la tumeur pour une seule souris. Par endoscopie, tumeurs individuelles et la santé de la muqueuse du côlon peut être suivie dans le temps, offrant une lecture-out pour le succès de nouveaux traitements chez un seul animal.
- (Facultatif) Les images fixes peuvent être extraites des vidéos pour la génération de figures représentatives (figure 6).
Representative Results
Perte de poids est utilisé comme paramètre standard pour surveiller une maladie associée à la colite, qui est couramment utilisé pour surveiller l'état de santé général des souris. Animaux conservent en général leur poids tandis DSS-contenant de l'eau est administré, et ne commencent à perdre du poids quand ils sont retournés à l'eau potable normale. Paramètres de perte de poids acceptables devraient être établis en conformité avec le comité d'éthique des animaux de l'institution. Afin d'éviter la déshydratation associée à la diarrhée prolongée, utilisez la fourniture de routine de purée (boulettes de nourriture en purée et mélangé avec de l'eau potable) supplémenté avec un shake de protéines, en plus de l'eau potable normale.
Comme solution de rechange l'anesthésie, la kétamine / xylazine ou des agents similaires peuvent être utilisés, si l'équipement isoflurane ne est pas disponible. En raison de la nature rigide de l'endoscope, ces procédés permettent uniquement de visualisation les plus distales 3 cm du côlon de la souris. Endoscopes récents avec capacités complémentaires (y compris la flexibilité et la fluorescence) sont disponibles en fonction des besoins de l'expérience. Toutefois, étant donné les effets délétères du DSS sont principalement limités à le côlon distal de souris, avec une pathologie bénigne observée dans le côlon milieu, l'endoscope rigide ne entrave pas le suivi de la santé de la muqueuse des souris individuelles. Bien que nous décrivons un protocole pour le traitement prophylactique de la colite induite par DSS-aiguë, ce protocole peut être facilement modifié pour tester les stratégies d'intervention de traitement. L'efficacité d'un médicament destiné à soulager les lésions épithéliales et la colite peut être surveillée chez les souris individuelles longitudinalement et quantifiée sur la base des paramètres de cotation décrites (figure 5). Ceci est avantageux par rapport aux modèles expérimentaux classiques, qui nécessitent l'abattage des souris à des moments spécifiques au cours du protocole expérimental, et ne permet pas de caractérisation de la réponse de la maladie à un traitement au cours du temps.
t "> Les études cliniques chez l'homme ont mis en évidence une variabilité considérable dans la façon dont différentes tumeurs chez un patient de répondre aux traitements. Les procédures décrites ici fournissent un moyen de surveiller la charge tumorale globale, ainsi que la réponse au traitement de tumeurs individuelles au cours d'une expérience. Il est important de considérer que les protocoles d'intervention qui sont décrites pour les modèles de cancer ne prennent pas en compte les effets d'une thérapie sur l'initiation de la tumeur. protocoles prophylactiques, avec le traitement prévu avant lorsque les tumeurs deviennent visibles par endoscopie, sont nécessaires pour obtenir ces informations. Les protocoles décrits ici fournissent des informations sur les effets thérapeutiques sur le sur la progression (mesurées par la taille de la tumeur) des tumeurs individuelles. La régression tumorale peut également être indiquée par une réduction du nombre de tumeurs visibles.g "/>
Figure 1:. Suivi de l'efficacité d'une thérapie de traitement prophylactique dans un modèle de dommages colique aiguë Le protocole expérimental (a) nécessite huit jours du début à la fin. Therapeutics sont administrés (b) de 1 jour pour des traitements prophylactiques. DSS est fourni dans l'eau de boisson (c) à partir de 3 jours du protocole expérimental. L'endoscopie est réalisée (d) surveiller la progression de la maladie chez les animaux. Timepoints suggérées comprennent Jour 0 (non traité) et Jour 2 (surveillance de la santé), Jour 5 et 8 (pour déterminer la charge de morbidité). L'expérience est terminé (e) le matin du Jour 8. Dans une souris de type sauvage (f) la progression de la maladie augmente au fil du temps.
Figure 2: Suivi de l'efficacité de la thérapie d'intervention dans un modèle of colite associée cancer. Le protocole expérimental (a) nécessite 72 jours du début à la fin. Therapeutics (b) sont administrés à des souris avec des tumeurs établies à partir de 46 jours pour les traitements d'intervention. AOM (c) est injecté le jour 1, et SSD est assuré dans l'eau potable au cours des trois cycles du protocole expérimental, commençant le Jour 8. endoscopie (d) est effectuée pour surveiller la progression de la maladie chez les animaux. Timepoints suggérées comprennent Jour 0 (non traité), Jour 20 (surveillance de la santé), et la Journée 40 (pour les animaux du groupe selon la charge tumorale). L'endoscopie est effectuée chaque semaine au cours du traitement thérapeutique pour surveiller les résultats de la maladie. L'expérience (e) se termine le matin du Jour 72. Dans une charge tumorale-souris de type sauvage (f) augmente de jour 40 partir.
Figure 3:. Suivi de l'efficacité de la thérapie d'intervention dans un modèle de cancer colorectal spontanée Le protocole expérimental (a) nécessite> 50 semaines du début à la fin. Therapeutics (b) sont administrés à des souris avec des tumeurs établies pour les traitements d'intervention. AOM (c) est injecté le jour 1, et toutes les semaines par la suite pour six injections consécutives au cours du protocole expérimental. L'endoscopie (d) est réalisée pour surveiller la progression de la maladie chez les animaux. Timepoints suggérées comprennent Jour 0 (non traité) et la semaine 8 (surveillance de la tumeur) et toutes les deux semaines là-bas après (pour établir la charge tumorale). Endoscopie est réalisée toutes les semaines au cours du traitement pour surveiller les résultats thérapeutiques. L'expérience (e) est mis fin à la semaine 50. Dans une charge tumorale-souris de type sauvage (f) augmente partir de la semaine 40 partir. p>
Figure 4:. Équipement set-up Le dispositif expérimental (a) pour l'unité endoscopique, avec des morceaux individuels de l'équipement indiqué. Endoscope rigide (B), avec différents composants indiqués. Barre d'échelle = 2,5 cm. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5:. Maladies notation paramètres par endoscopie Un aperçu (a) de l'indice endoscopique murin de sévérité de la colite (MEICS). Un aperçu (b) des paramètres individuels de notation de la tumeur.es / ftp_upload / 52383 / 52383fig5highres.jpg "target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6: traitements thérapeutiques représentatifs Représentant de perte de poids, des images endoscopiques et scores pour:. (A) aiguë induite par DSS lésions des muqueuses (b) Tumeurs qui se sont développées suite à l'AOM protocole / DSS (c) Les tumeurs qui se sont développées après la séquentiel.. AOM protocole. N = 3 souris par groupe. * P <0,05, *** P <0,001 (T-test de Student). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Discussion
Les trois protocoles qui sont décrits méthodes d'induction fiable et reproductible de la pathologie de la maladie du côlon chez les souris contour. Lorsqu'il est combiné avec la surveillance endoscopique de routine et les stratégies d'intervention décrites ici, ces protocoles fourniront puissante aperçu pré-clinique sur l'efficacité de la thérapeutique. Nos laboratoires utilisent couramment toutes ces protocoles pour surveiller le succès de nouveaux produits thérapeutiques 10,23,24.
Il ya un certain nombre de considérations lors du choix d'un modèle animal pré-clinique pour tester de nouvelles thérapies. Il se agit notamment pertinence du modèle à la maladie humaine, et la contribution du microenvironnement de la tumeur à l'action proposée de l'objectif thérapeutique. Ici nous fournissons trois protocoles d'intervention thérapeutique dans des modèles de maladies intestinales établies. Ces modèles sont reproductibles et la livraison de réactifs pour provoquer la maladie est facile à gérer. Surtout, les modèles sont très pertinentsà multiples facettes et étapes de la colite apparition, et de l'initiation et la progression tumorale. Les chercheurs devraient prendre en considération le contexte génétique des souches de souris utilisées lors de la conception des expériences, que la susceptibilité à la maladie induite par DSS et / ou AOM 25 peuvent varier considérablement. En outre, les communautés microbiennes différentes peuvent avoir différentes capacités métaboliques dans le cadre de l'OMA, qui est métabolisé par les bactéries. Nous avertissons contre l'utilisation de différentes cohortes de souris qui sont nés en différentes installations pour les animaux (y compris les fournisseurs commerciaux) en une seule expérience. De même, les différents microflore souris utilisées de différentes installations peut susciter différentes réactions de l'hôte au MAS-dégâts de barrière épithéliale 11. En outre, l'analyse appropriée de tissu (par exemple pour la purification d'ARN) devrait également être envisagée, étant donné que la capacité de DSS pour inhiber la transcriptase inverse aura une incidence sur l'analyse moléculaire ultérieur 26,27.
Comme notre compréhension de la maladie inflammatoire de l'intestin et le cancer colorectal avance, de nouvelles cibles pour la thérapie seront identifiés. Des modèles animaux appropriés feront partie intégrante de veiller à ce que les nouvelles thérapies plus prometteuses sont déplacés vers les essais cliniques.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran sulfate sodium (MW 36,000-50,000) | MP Biochemicals | 160110 | Requires batch testing. |
| Azoxymethane | Sigma | A5486-100MG | Requires batch testing. |
| Vanilla protein shake | N/A | N/A | Available from hospital pharmacies. |
| Isoflurane | PPC | M60303 | This is a restricted reagent, which should be stored under lock and key. |
| 70% ethanol | N/A | N/A | Standard lab reagent. |
| Coloview miniendoscopic system | |||
| Endovision Tricam | Karl Storz | 20212001-020 | |
| Xenon 175 light source with anti-fog pump | Karl Storz | 20134001 | |
| HOPKINS straight Forward Telescope | Karl Storz | 64301AA | |
| Endoscopic sheath (total diameter 3 mm) | Kalr Stroz | 61029C | |
| Fiber optic light cable | Kalr Stroz | 69495ND | |
| Computer and media player software | Apple | iMovie | |
| Scale | Any | Any scale suitable for weighing mice. |
References
- Tenesa, A., Dunlop, M. G. New insights into the aetiology of colorectal cancer from genome-wide association studies. Nat Rev Genet. 10, 353-358 (2009).
- Rustgi, A. K. The genetics of hereditary colon cancer. Genes Dev. 21, 2525-2538 (2007).
- Rutter, M., et al. Severity of inflammation is a risk factor for colorectal neoplasia in ulcerative colitis. Gastroenterology. 126, 451-459 (2004).
- Eaden, J. A., Abrams, K. R., Mayberry, J. F. The risk of colorectal cancer in ulcerative colitis: a meta-analysis. Gut. 48, 526-535 (2001).
- Lakatos, P. L., Lakatos, L. Risk for colorectal cancer in ulcerative colitis: changes, causes and management strategies. World J Gastroenterol. 14, 3937-3947 (2008).
- Xiang, B., Snook, A. E., Magee, M. S., Waldman, S. A. Colorectal cancer immunotherapy. Discov Med. 15, 301-308 (2013).
- Feng, Q. Y., et al. Anti-EGFR and anti-VEGF agents: Important targeted therapies of colorectal liver metastases. World J Gastroenterol. 20, 4263-4275 (2014).
- Dinarello, C. A. Anti-inflammatory Agents: Present and Future. Cell. 140, 935-950 (2010).
- Grivennikov, S. I., et al. Adenoma-linked barrier defects and microbial products drive IL-23/IL-17-mediated tumour growth. Nature. 491, 254-258 (2012).
- Putoczki, T., Thiem, S., Loving, A., Busuttil, R. A., Wilson, N. A., Ziegler, P., Nguyen, P., Preaudet, A., Farid, R., Edwards, K., Boglev, Y., Luwor, R. B., Jarnicki, A. J., Horst, D., Boussioutas, A., Heath, J., Sieber, O., Nash, A., Greten, F., McKenzie, B. S., Ernst, M. Interleukin-11 is the dominant IL-6 family cytokine during gastrointestinal tumorigenesis and can be targeted therapeutically. Cancer Cell. 24, 257-271 (2013).
- Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. J Biomed Biotechnol. 2012, 718617 (2012).
- Rose, W. A. 2nd, Sakamoto, K., Leifer, C. A. Multifunctional role of dextran sulfate sodium for in vivo modeling of intestinal diseases. BMC Immunol. 13, 41 (2012).
- Laroui, H., et al. Dextran sodium sulfate (DSS) induces colitis in mice by forming nano-lipocomplexes with medium-chain-length fatty acids in the colon. PLoS One. 7, e32084 (2012).
- Miyazawa, F., Olijnyk, O. R., Tilley, C. J., Tamaoki, T. Interactions between dextran sulfate and Escherichia coli ribosomes. Biochim Biophys Acta. 145, 96-104 (1967).
- Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14, 141-153 (2014).
- Neufert, C., Becker, C., Neurath, M. F. An inducible mouse model of colon carcinogenesis for the analysis of sporadic and inflammation-driven tumor progression. Nat Protoc. 2, 1998-2004 (2007).
- Schwitalla, S., et al. Loss of p53 in Enterocytes Generates an Inflammatory Microenvironment Enabling Invasion and Lymph Node Metastasis of Carcinogen-Induced Colorectal Tumors. Cancer Cell. 23, 93-106 (2013).
- Fiala, E. S. Investigations into the metabolism and mode of action of the colon carcinogens 1,2-dimethylhydrazine and azoxymethane. 40, 2436-2445 (1977).
- Chen, J., Huang, X. F. The signal pathways in azoxymethane-induced colon cancer and preventive implications. Cancer Biol Ther. 8, 1313-1317 (2009).
- Bollrath, J., et al. gp130-mediated Stat3 activation in enterocytes regulates cell survival and cell-cycle progression during colitis-associated tumorigenesis. Cancer Cell. 15, 91-102 (2009).
- Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nat Protoc. 1, 2900-2904 (2006).
- Ivanov, I. I., et al. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell. 139, 485-498 (2009).
- Thiem, S., et al. mTORC1 inhibition restricts inflammation-associated gastrointestinal tumorigenesis in mice. J Clin Invest. 123, 767-781 (2013).
- Stuart, E., et al. Therapeutic inhibition of Jak activity inhibits progression of gastrointestinal tumors in mice. Mol Cancer Ther. 13, 468-474 (2014).
- De Robertis, M., et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J Carcinog. 10, 9 (2011).
- Viennois, E., Chen, F., Laroui, H., Baker, M. T., Merlin, D. Dextran sodium sulfate inhibits the activities of both polymerase and reverse transcriptase: lithium chloride purification, a rapid and efficient technique to purify RNA. BMC Res Notes. 6, 350 (2013).
- Kerr, T. A., et al. Dextran sodium sulfate inhibition of real-time polymerase chain reaction amplification: a poly-A purification solution. Inflamm Bowel Dis. 18, 344-348 (2012).
