Abstract
O tacrolimus inibidor da calcineurina é a pedra angular da maioria dos protocolos de tratamento imunossupressores após transplante de órgão sólido nos Estados Unidos. Tacrolimus é uma droga estreito índice terapêutico e, como tal, exige monitorização terapêutica e ajuste de dose com base em toda a sua concentrações mínimas no sangue. Para facilitar casa droga terapêutica e monitoramento da adesão, a coleta de gotas de sangue seco é um conceito atraente. Depois de uma picada no dedo, o paciente recebe uma gota de sangue em papel de filtro em casa. Depois de o sangue é seca, que é enviado para o laboratório de análises, onde o tacrolimus é quantificada usando espectrometria de massa líquida de alta eficiência A cromatografia-tandem (HPLC-MS / MS), em combinação com um manual simples passo de precipitação de proteína e de extracção em linha da coluna.
Para a análise de tacrolimus, um disco de 6 mm é perfurado a partir do centro do local saturada de sangue. A mancha de sangue é homogeneizada utilizando um misturador de uma balaND, em seguida, as proteínas são precipitadas com metanol / 0,2 M ZnSO4 contendo o padrão interno D 2, 13 C-tacrolimus. Após agitação em vórtice e centrifugação, 100 ul de sobrenadante foi injectada numa coluna de extracção em linha e lavou-se com 5 mL / min de ácido fórmico a 0,1 / acetonitrilo (7: 3, v: v) durante 1 min. Daqui por diante, a válvula de comutação é activada e os analitos são back-lavada na coluna analítica (e separados utilizando um gradiente de ácido fórmico / acetonitrilo a 0,1%). O tacrolimus é quantificada no modo positivo de multi reacção (MRM) usando um espectrómetro de massa em tandem.
O ensaio é linear de 1 a 50 ng / ml. A variabilidade inter-ensaio (3,6% -6,1%) e precisão (91,7% -101,6%), avaliada durante 20 dias satisfazer os critérios de aceitação. A recuperação média de extração é de 95,5%. Não há carry-over, interferências de matriz e efeitos de matriz relevante. O tacrolimus é estável em manchas de sangue seco em temperatura ambiente e a +4 ° C durante 1 semana. Amostras extraídas doamostrador automático são estáveis a 4 ° C durante pelo menos 72 h.
Introduction
O tacrolimus é um potente immonosuppressant 1-7 que tem uma estrutura de macrólido 8 (Figura 1). Devido a cis - isomerismo trans das ligações NC que forma dois rotâmeros em solução 9 que podem ser separados por cromatografia líquida de alta eficiência de fase inversa (HPLC) Tacrolimus é lipofilico e solúvel em álcoois (metanol: 653 g / L, etanol: 355 g / L), hidrocarbonetos halogenados (clorofórmio: 573 g / L) e éter. É moderadamente solúvel em hidrocarbonetos alifáticos (hexano: 0,1 g / L e de água (pH 3:. 0,0047 g / L) 9 A molécula não contém quaisquer cromóforo e o seu máximo de absorção de UV de 192 nm tacrolimus actua através da inibição da calcineurina. . O seu mecanismo de acção foi revisto em referências 10,11. Ele é actualmente utilizado em mais de 80% dos pacientes de transplante de órgãos sólidos nos Estados Unidos 12.
O índice terapêutico de tacrolimus é considerád para ser estreita 13. Além disso, a correlação entre doses de tacrolimus e as concentrações sanguíneas é pobre e farmacocinética é variável 14,15. A monitorização terapêutica para orientar a dosagem tacrolimus em doentes transplantados é a prática clínica, pois, em geral 16-20. O objectivo é manter as concentrações sanguíneas de tacrolimus dentro de uma gama terapêutica pré-definido. Concentrações sanguíneas Tacrolimus abaixo da gama terapêutica pode resultar numa actividade aumentada de reacções alo-imune crónica ou aguda, enquanto que as concentrações acima da janela terapêutica aumentar o risco de sobre-imunossupressão, cancro e toxicidade, como nefrotoxicidade, neurotoxicidade, hipertensão, e diabetes. A alta variabilidade intra-individual de farmacocinética de tacrolimus pode ser prejudicial tanto para órgãos transplantados e sobrevida do paciente 21,22. Enquanto a variabilidade inter-individual na farmacocinética do tacrolimus é causada principalmente por polimorfismos CYP3A5, razões para intra-individualvariabilidade incluem, mas não estão limitados a, fármaco-fármaco, com a doença da droga e droga-alimento interacções 14,15. Também a falta de adesão ao regime de imunossupressão terapêutica medicamentosa é um fator contribuinte e uma das principais razões para a perda do enxerto 23,24.
Estas considerações sugerem que casa freqüente de drogas terapêuticas e monitoramento da adesão de concentrações de tacrolimus no sangue total pode ser benéfica para garantir que os pacientes têm uma exposição de tacrolímus dentro da janela terapêutica desejada em todos os momentos. No entanto, a logística e os custos de monitorização mais frequente da terapêutica medicamentosa, pois é atual prática clínica 15 é proibitivo. Uma das razões é que o paciente tem de ver uma flebotomia para ter a amostra de sangue venoso necessária desenhada. Manchas de sangue seco surgiram recentemente como um conceito atraente 25-28. Depois de um dedo simples furar o paciente coleta uma gota de sangue em um cartão de papel de filtro especial e após o ponto de sangue tem dRied, pode ser enviado para um laboratório central para análise de tacrolimus e qualquer outro imunossupressor que o paciente possa estar a tomar actualmente. Isto tornou-se possível devido ao desenvolvimento de ensaios de LC-MS / MS altamente sensíveis e específicos para a quantificação de tacrolimus e outros imunossupressores no sangue em volumes muito pequenos, tais como manchas de sangue seco (tipicamente 20 ul de sangue 25,29-43). Outra vantagem é que os baixos estratégias de cobrança minimamente invasivas, amostra de volume, tais como manchas de sangue seco facilitar muito monitorização terapêutica e estudos farmacocinéticos em crianças pequenas 28.
Tacrolimus geralmente é medido em toda EDTA sangue venoso 15. As razões são que o tacrolimus é extensamente distribuída a células do sangue e que os estudos clínicos relataram melhor correlação entre as concentrações de tacrolimus calha no sangue do que em plasma com eventos clínicos 15,18. Em comparação, a análise de TAcrolimus em manchas de sangue seco é baseado no sangue capilar que é misturado com a matriz de papel de filtro. Isso apresenta desafios em termos de solubilização de tacrolimus e potenciais interferências com a análise LC-MS / MS. Aqui apresenta-se um ensaio estabelecido e validado com base na homogeneização da mancha de sangue seco usando um misturador de bala em combinação com um alto fluxo de amostra de coluna em linha limpar procedimento e análise por LC-MS / MS. Até hoje, este ensaio tem sido usado com sucesso para a quantificação de mais de cinco mil amostras de sangue para monitorização de tacrolimus seca aderência em ensaios clínicos.
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Protocol
Amostras de sangue identificadas-de de indivíduos saudáveis eram do Hospital da Universidade de Colorado (Aurora, Colorado). O uso de amostras de banco de sangue identificou-de para estudos de validação, bem como para a preparação dos calibradores e amostras de controle de qualidade foi considerada "isentos" pelo Conselho Colorado Multi-institucional Análises (COMIRB, Aurora, Colorado).
1. Preparação de Referências e Soluções
- Tacrolimus compra e do padrão interno D 2, 13 C-tacrolimus a partir dos fornecedores listados na Lista de Materiais.
- Preparar soluções de reserva em metanol puro a uma concentração de 1 mg / ml para o tacrolimus e uma concentração de 10 ug / ml de D 2, 13 C-tacrolimus. Faça soluções de estoque de materiais de referência com base em três ponderações independentes. Soluções de banco de alíquotas e armazenar a -70 ° C ou abaixo.
- Solução para precipitar proteínas Preparee extrair o tacrolimus usando metanol / 0,2 M ZnSO 4 em água (7: 3, v: v). Esta solução também contém o padrão interno D 2, 13 C-tacrolimus, a uma concentração de 2,5 ng / ml e foi utilizado para a extracção de todas as amostras, excepto para a extracção de amostras em branco (por favor ver 1.3.3).
- Prepara-se esta solução a precipitação da proteína de fresco em cada dia de extracção e definir a expiração da solução a 12 h.
- Preparação da curva de calibração e de controlo de qualidade (QC) amostras
- Preparar soluções estoque de tacrolimus através da realização de diluições apropriadas da solução utilizando metanol puro.
- Para preparar os calibradores e as amostras de controlo de qualidade, pico de 20 ul de solução de reserva apropriadamente diluídas em EDTA sangue total, incuba-se a 37 ° C sob agitação suave num banho de água para permitir uma distribuição homogénea do tacrolimus para os componentes celulares do sangue durante 20 min e alíquota em 1,5 ml de pólipotubos ropylene com fundo cônico e snap-on tampas. Assegure-se que o volume relativo de solvente orgânico não exceda 5%.
- Mancha 50 ul de sangue inteiro cravado no meio de cada círculo sobre os cartões de filtro, utilizando uma pipeta.
- Secam-se as manchas de sangue em placas de filtro, à TA durante 3 h.
- Preparar padrões de calibração de tacrolimus no sangue humano total com EDTA, em concentrações de tacrolimus de 1, 2,5, 5, 10, 25, e 50 ng / ml. Prepare uma amostra em branco para a extração de como os padrões de calibração com a solução de precipitação de proteínas contendo o padrão interno D 2, 13 C-tacrolimus ("amostra zero").
- Preparar amostras QC em sangue humano total com EDTA, em concentrações de 0, 2, 4, 20, 40 ng / ml. Prepare uma amostra em branco. Em contraste com as amostras de CQ que são extraídos com precipitação contendo o padrão interno D 2, 13 C-tacrolimus, extrair esta amostra em branco com uma solução de precipitação de proteínas que faznão contêm o padrão D interno 2, 13 C-tacrolimus ("amostra em branco").
- Recolha de amostras clínicas
- Recolha manchas de sangue seco como descrito no 43,44.
2. Extração de Tacrolimus secas amostras de sangue
- Inspecione visualmente a mancha de sangue seco para garantir a qualidade da amostra aceitável eo volume 45.
- Soco centro da mancha de sangue no cartão de filtro com uma perfuração de 6 mm.
Nota: A qualidade dos perfuradores pode ser monitorizada por pesagem. Um disco de filtro saturado perfurado pesa em média 5,02 mg ± 0,09 mg (intervalo: 4.83- 5,14 mg, n = 12). - Coloque os discos em tubos de 1,5 ml de polipropileno com cônico fundo e tampas snap-on.
- Adicionar 20-30 balas para cada tubo.
- Adicionar 500 ul da solução de precipitação de proteína (metanol: 0,2 M ZnSO4, 7: 3, v: v, com 2,5 ng / ml como padrão interno) para cada tubo. Para o extração de amostras em branco, usar a solução de precipitação de proteínas sem a referência interna.
- Homogeneizar os discos no liquidificador bala por 1 min (velocidade máxima, a configuração "10").
- Agitar à TA amostras em vórtex multi-tubos (velocidade máxima, a configuração "10") durante 10 min.
- Centrifugar as amostras a 16.000 xg e 4 ° C durante 10 min.
- Transfira os sobrenadantes para frascos de HPLC de vidro equipado com uma inserção de 300 ul. Utilizar vedações teflon pré-fenda.
Nota: Extraiu-se as amostras podem ser armazenadas a -20 ° C ou abaixo até a análise por LC-MS / MS.
3. LC-MS / MS Análise
- Carga de 100 ul do sobrenadante da amostra extraída para a coluna de extracção de cartucho C8 e lava-se com uma proporção de 7: 3 de ácido fórmico a 0,1% em água: acetonitrilo a um caudal de 5 ml / min durante 1 min. As ligações da válvula de comutação são apresentados na Figura 2 e o gradiente executado pela bomba de extracção na Tabela 1
- A partir de agora, ativar a válvula de comutação resultando em back-resplendor dos analitos da pré-coluna para a coluna analítica.
- Regule o termostato de coluna a 65 ° C.
- Eluir os analitos a partir da coluna analítica utilizando as taxas de fluxo e o gradiente mostrados na Tabela 1.
- Ligue a coluna analítica a um espectrômetro de massa em tandem através da fonte de ionização electrospray turbo. Ajustar os parâmetros-chave do espectrômetro de massa de acordo com a Tabela 2.
- Detectar iões positivos ([M + Na] +) no modo de reacção múltipla (MRM). Use as seguintes transições íon para quantificação: tacrolimus: m / z (massa / carga) = 826,6 → 616,2 e D 2, 13 C-tacrolimus: m / z = 829,6 → 619,2.
Nota: O tempo total de execução é de 4,6 min.
4. Quantificação
- Para cada prazo, gerar uma curva de calibração com base nos calibradores preparados em 1.3.5 eincluir em cada corrida analítica.
- Gerar uma curva de calibração locando as concentrações nominais contra o factor de resposta de analito (Peak Área [Analyte] / Área de Pico [padrão interno]) usando o software espectrômetro de massa.
- Encaixe os calibradores usando um ajuste quadrático em combinação com 1 / X ponderação.
- Para tacrolimus quantidade nas manchas de sangue seco integrar o tacrolimus e picos do padrão interno nos cromatogramas MRM extraídos. Calcular o factor de resposta para o tacrolimus (área do pico [Analito] / área de pico [padrão interno]) e comparar com a curva de calibração utilizando o software de espectrometria de massa.
Procedimentos de validação 5.
- Lower limite de detecção (LLOD) e limite inferior de quantificação (LIQ).
- Considere o menor concentração de tacrolimus com uma relação de pico-para-ruído de 4: 1, como o limite inferior de detecção (LLOD). Definir o limite inferior de quantificação (LIQ) como oconcentração mais baixa da curva de calibração com uma precisão igual ou melhor do que ± 20% de desvio a partir da concentração nominal e precisão igual ou melhor do que 20% (coeficiente de variação).
- Precisões intra e inter-dia e precisões.
- Teste a exatidão e precisão em quatro níveis de concentração de 2 ng / ml (QC1), 4 ng / ml (QC2), 20 ng / ml (QC3) e 40 ng / ml (QC4).
- Preparar as amostras de QC em cada dia de validação em sangue humano total com EDTA, em placas de filtro seco, extrair e analisar tal como descrito acima.
- Determinar exatidão e precisão intra-dia com 6 amostras por nível de concentração QC.
- Avaliar exatidão e precisão inter-dia ao longo de 20 dias. Meça cada nível QC com 4 amostras por dia.
- Analise duas curvas de calibração, juntamente com as amostras QC em cada dia.
- Calcule precisão intra-dia como a% da concentração nominal (seis amostras por nível de concentração, por favor, consulte o item 5.2.2). CalcUlate precisão como o coeficiente de variação (CV%).
- Considere exactidão intra-diária aceitável se cai na aceitação limita 85% a 115% da concentração nominal. Considere precisão intra-dia aceitável se é igual ou melhor do que um CV (coeficiente de variação) de 15%.
- Calcule exatidão e precisão inter-dia como a média para cada nível de concentração QC analisados ao longo dos 20 dias de validação.
- Considere precisão média inter-dia aceitável se cai na aceitação limita 85% a 115% da concentração nominal. Considere precisão inter-dia aceitável se é igual ou melhor do que um CV (coeficiente de variação) de 15%.
- Exclusão de interferências da matriz.
- Para a exclusão das interferências que podem ser provocadas pelos sinais de matriz, analisar manchas de sangue seco em branco (8 indivíduos diferentes, de preferência 4 homens e 4 mulheres).
- Inspecione visualmente cromatogramas iónicos. Se picos dentro do tempo de retençãojanela de tacrolimus são detectados, integrar e comparar as suas áreas sob a curva com os de picos de tacrolimus em amostras em branco enriquecida com tacrolimus no LLOQ. A área de picos nas amostras em branco não devem exceder 15% das pessoas de tacrolimus no LLOQ.
- Ion supressão / aprimoramento de íons.
- Use um protocolo de infusão pós-coluna, conforme descrito 45 para avaliar a possibilidade de interferências de realce ion supressão / ion causada por componentes da matriz de co-eluição.
- Infundir o tacrolimus numa concentração de 10 ug / ml dissolvido em ácido fórmico a 0,1%: metanol (30:70, v / v) de pós-coluna a uma taxa de 10 ul / min.
- Conectar uma bomba de seringa através de peça em T entre a coluna analítica e a fonte de electropulverização do espectrómetro de massa.
- Monitorizar a intensidade do sinal de MS / MS das transições MRM de tacrolimus e do seu padrão interno (m / z = 826,6 → 616,2 e m / z = 829,6 → 619,2) após a injecção de extracAs amostras em branco ted (n = 8 amostras de indivíduos diferentes).
Nota: Na ausência de melhoria de supressão de iões / o ião de sinal causada por infusão contínua dos analitos não deve ser afectado por injecção da matriz em branco, enquanto a supressão de iões provoca uma queda do sinal e um pico de iões de reforço.
- Transferir.
- Avaliar o potencial de carry-over Ao analisar amostras extraídas em branco após os mais altos calibradores (50 ng / ml, n = 6).
- Inspecione visualmente cromatogramas iónicos. Se forem detectados picos dentro da janela de tempo de retenção do tacrolimus, integrar e comparar as suas áreas sob a curva com os picos de tacrolimus em amostras em branco enriquecida com tacrolimus no LLOQ. A área de picos nas amostras em branco não devem exceder 15% das pessoas de tacrolimus no LLOQ.
- Recuperações de extração.
- Determinar recuperações por comparação dos sinais dos analitos após extracção de QC sampios em todos os quatro níveis de concentração (n = 6 por concentração) com os de branco manchas de sangue seco enriquecida com os correspondentes montantes das tacrolimus após a extração.
- Prepare quatro conjuntos de CQ (níveis de concentração: 2, 4, 20, 40 ng / mL).
- Preparar outro 4 conjuntos de amostras de ensaio correspondente "recuperação" através da identificação de 50 ul de sangue total com EDTA em branco para os cartões de papel de filtro e secagem durante 2 horas.
- A partir de agora, tanto para o QC e em branco "amostras de teste de recuperação", cortar toda a mancha de sangue no cartão de filtro com uma tesoura e coloque os discos resultantes em um tubo cônico de polipropileno com fundo e snap-on tampa.
- Extraia todas as amostras.
- Transfira os sobrenadantes (400 uL) para frascos de vidro de HPLC.
- Adicionar solução estoque tacrolimus aos "corpos de prova de recuperação extraído em branco" para atingir concentrações de 2, 4, 20 e 40 ng / ml (4 ul de 200, 400, 2.000, 4.000 ng ml sol / estoque tacrolimusdoras de 400 ul de sobrenadante).
- Após análise por LC-MS / MS, comparar os sinais em ambas as amostras de QC e amostras de teste "recuperação" de a concentração correspondente (% de recuperação = amostras de sinal cravado antes das amostras de extracção / sinal cravado após extracção x 100).
- Diluição integridade.
- Estabelecer integridade diluição com amostras fortificadas com os analitos em 500, 250 e 100 ng / ml.
- Após a extração, diluir as amostras usando solução de precipitação de proteínas (1:10, n = 3 por nível de concentração).
- Calcular desvios em relação às concentrações nominais. Considere resultados que caem dentro de 85% -115% do valor nominal aceitável.
- Estabilidades.
- Investigar estabilidades, utilizando as amostras de CQ em todos os quatro níveis de concentração (n = 4 para cada concentração) analisada em diferentes pontos de tempo e sob as diferentes condições de armazenagem.
- Compare os resultados após a armazenagem, com os valores nominais. Considere resultados que caem dentro de 85% -115% do valor nominal aceitável.
- Estabelecer estabilidade da amostra durante 1 semana à temperatura ambiente, 1 semana a 4 ° C, 1 mês a -20 ° C e 1 mês à temperatura de -80 ° C.
- Teste de estabilidade congelamento-descongelamento durante três ciclos (-20 ° C). Teste amostra extraída e a estabilidade do amostrador automático por colocar as amostras no amostrador automático com termostato ajustado para 4 ° C. Injectar as amostras depois de 72 horas.
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Representative Results
Cromatogramas iónicos representativos de uma amostra em branco, uma amostra enriquecida para o limite inferior de quantificação e uma amostra do paciente são apresentados na Figura 3.
As curvas de calibração
O limite inferior de detecção foi de 0,5 ng / ml e o limite inferior de quantificação foi de 1,0 ng / ml. Cinquenta ng / ml foi escolhido como o mais alto calibrador como concentrações mais elevadas não são susceptíveis de ser alcançado na clínica em circunstâncias normais.
As curvas de calibração foram preparados na hora em cada dia de validação no sangue humano total com EDTA, secou-se sobre placas de filtro e extraída com metanol / 0,2 M ZnSO4 (70:30 v / v) + padrão interno (concentração final de padrão interno: 2,5 ng / mL ). Para a validação dia 1 (n = 6 para os calibradores e n = 6 para o nível QC) e para os dias 2 - 20 (N = 2 para os calibradores e n = 4 para cada nível de CQ) foram analisados com concentrações de 1, 2,5, 5, 10, 25, 50 ng / ml para calibradores. Uma curva de calibração típica é mostrada na Figura 4. A média de precisões de 85% a 115% do valor nominal, dentro da gama de funcionamento para 2/3 dos calibradores (com um mínimo de 6 calibradores diferentes de zero) foram considerados aceitáveis. O coeficiente de correlação foi significativo (r) = 0,999 (n = 40 curvas de calibração).
Precisões e precisões
Os resultados são apresentados em detalhe na Tabela 3.
Recuperação Extracção
A recuperação média de extracção foram 98,2% (2 ng / ml), 92,2 (4 ng / mL), 95,5 (20 ng / mL), 96,2 (40 ng / mL).
Matrix Interferências, Ion Supressão / Ion Testing Enhancement Usando Infusão Contínua Pós-Column e Siga-over
Análise das amostras de branco a partir de oito indivíduos diferentes (n = 4 do sexo feminino e masculino n = 4) mostraram sinais de menos do que 15% da LLOQ (1 ng / ml) no tempo de retenção correspondentes aotacrolimus pico indicando que o tacrolimus pico detectado pode ser considerado específico. Um exemplo representativo é mostrado na Figura 3. Os potenciais interferências por aperfeiçoamento de supressão / ião de iões em branco foram testados usando amostras de sangue seco de oito indivíduos saudáveis diferentes. Uma experiência representativa é mostrada na Figura 5. Não foram observados indícios de melhoria significativa supressão / ião de iões. Sem carry-over relevante resultando em picos superiores a 15% do sinal no LLOQ foram detectados.
Diluição Integrity
Diluição integridade foi investigada por análise de amostras preparadas em concentrações acima do calibrador mais elevado (100, 250 e 500 ng / ml) e diluído 1:10 em solução após a precipitação da proteína de extracção para atingir as concentrações alvo de: 10, 25, e 50 ng / ml. Precisões médias tive que cair dentro dos critérios de aceitação de 85% a 115% das concentrações nominais. Todas as diluições TESted preencheram os critérios de aceitação (Tabela 4).
Estabilidades
Estabilidade do tacrolimus em manchas de sangue seco foi investigada por análise de amostras de CQ em todos os quatro níveis (n = 4 / nível de concentração), que foram armazenados em diferentes condições.
Precisões médias tive que cair dentro dos critérios de aceitação de 85% a 115% das concentrações nominais. Os resultados são apresentados em detalhe na Tabela 5. Nenhum perdas após 1 semana de armazenagem à TA, após 1 semana de armazenamento a 4 ° C, após 1 mês de armazenamento à temperatura de -20 ° C, após 1 mês de armazenagem a -80 ° C, após 3 ciclos de congelamento e descongelamento, e após 72 h de amostras extraídas em automático de amostras a 4 ° C eram evidentes.
| Uma bomba de sucção | Analytical Bomba (eluição) | ||||||
| Água + 0,1% de ácido fórmico | Acetonitrilo | Caudal [l / min] | Time [min] | Água + 0,1% de ácido fórmico | Acetonitrilo | Caudal [l / min] | |
| 0 | 70 | 30 | 5000 | 0 | 13 | 87 | 1000 |
| 1 | 70 | 30 | 5000 | 2 | 2 | 98 | 1200 |
| 1.1 | 2 | 98 | 100 | 3,5 | 2 | 98 | 1200 |
| 3 | 2 | 98 | 100 | 3.6 | 13 | 87 | 1000 |
| 3.1 | 20 | 80 | 2000 | 4.6 | 13 | 87 | 1000 |
| 4 | 70 | 30 | 5000 | ||||
| 4.6 | 70 | 30 | 5000 | ||||
Tabela 1. Programa Gradiente para a Extração e HPLC Analítica Bombas.
| Parâmetro | Cenário |
| Gás de colisão (CAD) | 10 |
| Gás de cortina (CUR) (psi) | 30 |
| Ion Fonte gás 1 (GS1) (psi) | 50 |
| Ion gás fonte 2 (GS2) (psi) | 30 |
| Corrente Nebulizador (NC) (V) | 1 |
| Temperatura (MET) (° C) 600 | |
| IonSpray Tensão (IS) (V) | 5500 |
| Aquecedor Interface (IES) | Ligar |
| Declustering potencial (DP) (V) | 136 |
| Potencial de entrada (PE) (V) | 10 |
| Energia de colisão (CE) (V) | 47 |
| Colisão potencial saída da célula (CXP) (V) | 16 |
Tabela 2. Turbo electropulveriza�o Interface e massa parâmetros do espectrómetro. A nomenclatura corresponde à utilizada no software de espectrometria de massa (para detalhes fabricante, consulte Lista de Materiais).
| Dia Validação | QC Nível [% da concentração nominal] | |||
| 2 | 4 | 20 | 40 | |
| Dia 1 | 93,0 | 86,3 | 88,9 | 93,4 |
| 101 | 90,4 | 95,3 | 100 | |
| 85,6 | 95,9 | 99,0 | 97,5 | |
| 88,6 | 93,6 | 105 | 103 | |
| 85,0 | 97,4 | 97,2 | 109 | |
| 89,1 | 96,7 | 100 | 101 | |
| A precisão intra-dia [%] | 90,4 | 93,4 | 97,6 | 100.7 |
| Intra-dia Imprecisão [CV%] | 6.6 | 4.6 | 5.5 | 5.2 |
| Dia 2 | 92,8 | 86,0 | 103 | |
| 91,1 | 88,8 | 94,7 | 87,0 | |
| 88,6 | 90,9 | 92,8 | 94,2 | |
| 97,2 | 93,7 | 94,2 | 115 | |
| A precisão intra-dia [%] | 92,4 | 89,9 | 96,2 | 97,9 |
| Intra-dia Imprecisão [CV%] | 3.9 | 3.6 | 4.8 | 12.2 |
| Dia 3 | 97,6 | 101 | 98,4 | 112 |
| 104 | 85,6 | 102 | 110 | |
| 99,2 | 88,4 | 99,4 | 105 | |
| 96,3 | 87,2 | 108 | 117 | |
| A precisão intra-dia [%] | 99,3 | 90,6 102.0 | 111,0 | |
| Intra-dia Imprecisão [CV%] | 3.4 | 7.8 | 4.2 | 4,5 |
| Dia 4 | 95,2 | 88,6 | 112 | 94,5 |
| 105 | 87,3 | 93,2 | 116 | |
| 99,8 | 96,2 | 103 | 103 | |
| 100 | 104 | 97,2 | 99,4 | |
| A precisão intra-dia [%] | 100.0 | 94,0 | 101.4 | 103.2 |
| Intra-dia Imprecisão [CV%] | 4 | 8.2 | 8.1 | 8.9 |
| Dia 5 | 106 | 90,4 | 101 | 106 |
| 108 | 89,0 | <td> 106100 | ||
| 102 | 101 | 96,6 | 128 | |
| 105 | 88,8 | 105 | 107 | |
| A precisão intra-dia [%] | 105.3 | 92,3 | 102.2 | 110.3 |
| Intra-dia Imprecisão [CV%] | 2.4 | 6.3 | 4.2 | 11.1 |
| Dia 6 | 90,9 | 93,7 | 119 | 106 |
| 98,8 | 88,1 | 96,4 | 110 | |
| 94,6 | 96,3 | 99,1 | 108 | |
| 108 | 100 | 102 | 102 | |
| A precisão intra-dia [%] | 98,1 | 94,5 | 104.1 | 106.5 |
| 7,5 | 5.3 | 9.8 | 3.2 | |
| Dia 7 | 85,1 | 87,5 | 99,5 | 95,4 |
| 86,4 | 85,4 | 94,7 | 101 | |
| 94,5 | 87,3 | 98,9 | 94,6 | |
| 85,5 | 97,0 | 101 | 99,6 | |
| A precisão intra-dia [%] | 87,9 | 89,3 | 98,5 | 97,7 |
| Intra-dia Imprecisão [CV%] | 5.1 | 5.8 | 2.7 | 3.2 |
| Dia 8 | 86,1 | 92,5 | 91,9 | 102 |
| 87,5 | 91,5 | 95,2 | 88,5 | |
| 115 | 85,6 | 92,1 | 102 | |
| 85,8 | 85,9 | 95,4 | 108 | |
| A precisão intra-dia [%] | 93,6 | 88,9 | 93,7 | 100.1 |
| Intra-dia Imprecisão [CV%] | 15,3 | 4.1 | 2.0 | 8.2 |
| Dia 9 | 88,9 | 91,4 | 96,9 | 100 |
| 90,0 | 89,8 | 95,0 | 100 | |
| 69,7 | 85,9 | 95,8 | 109 | |
| 91,9 | 87,0 | 105 | 101 | |
| A precisão intra-dia [%] | 85,1 | 88,5 | 98,2 | 102.5 |
| Intra-dia Imprecisão [CV%] | 12.2 | 2.9 | 4.7 | 4.3 |
| Dia 10 | 90,9 | 91,3 | 96,2 | 100 |
| 97,7 | 89,5 | 94,4 | 100 | |
| 99,9 | 109 | 98,7 | 96,8 | |
| 99,1 | 90,0 | 95,7 | 96,1 | |
| A precisão intra-dia [%] | 96,9 | 95,0 | 96,3 | 98,2 |
| Intra-dia Imprecisão [CV%] | 4.2 | 9.9 | 1.9 | 2.1 |
| Dia 11 | 92,7 | 91,9 | 88,2 | 104 |
| 96,6 | 91,2 | 97,0 | 110 | |
| 109,0 | 92,8 | 970,6 | 102 | |
| 98,3 | 107 | 93,7 | 111 | |
| A precisão intra-dia [%] | 99,2 | 95,7 | 94,1 | 106,8 |
| Intra-dia Imprecisão [CV%] | 7 | 7.9 | 4.6 | 4.1 |
| Dia 12 | 87,7 | 85,5 | 105 | 95,3 |
| 112 | 88,1 | 101 | 96,1 | |
| 102 | 89,1 | 89,7 | 97,5 | |
| 106 | 92,5 | 102 | 104 | |
| A precisão intra-dia [%] | 101.9 | 88,8 | 99,4 | 98,2 |
| Intra-dia Imprecisão [CV%] | 10.1 | 3.3 | 6.7 | 4 |
| Dia 13 | Fracassado | 85,7 | 93,3 | 102 |
| 101 | 105 | 88,0 | 93,9 | |
| 112 | 98,0 | 91,4 | 102 | |
| 104 | 113 | 104 | 101 | |
| A precisão intra-dia [%] | 105.7 | 100.4 | 94,2 | 99,7 |
| Intra-dia Imprecisão [CV%] | 5.4 | 11,5 | 7.3 | 3.9 |
| Dia 14 | 91,5 | 89,1 | 97,4 | 93,1 |
| 90,4 | 87,1 | 93,9 | 99,8 | |
| 89,7 | 97,0 | 94,8 | 106 | |
| 97,4 | 86,8 | 89,9 | Fracassado | |
| A precisão intra-dia [%] | 92,3 | 90,0 | 94,0 | 99,6 |
| Intra-dia Imprecisão [CV%] | 3.8 | 5.3 | 3.3 | 6.5 |
| Dia 15 | 92,8 | 92,8 | 92,5 | 95,4 |
| 97,5 | 96,3 | 96,2 | 95,5 | |
| 95,5 | 108 | 97,3 | 99,3 | |
| 110 | 109 | 115 | 113 | |
| A precisão intra-dia [%] | 99,0 | 101.5 | 100.3 | 100.8 |
| Intra-dia Imprecisão [CV%] | 7.7 | 8.1 | 10,0 | 8.3 |
| Dia 16 | 93,7 | 97,8 | 90,7 | 112 |
| 90,3 | 87,1 | Fracassado | 101 | |
| 97,9 | 88,3 | 95,5 | 107 | |
| 91,4 | 85,7 | 89,3 | 96,7 | |
| A precisão intra-dia [%] | 93,3 | 89,7 | 91,8 | 104.2 |
| Intra-dia Imprecisão [CV%] | 3.6 | 6.1 | 3,5 | 6.4 |
| Dia 17 | 88,0 | 86,0 | 93,7 | 103 |
| 89,8 | 90,8 | 94,8 | 93,2 | |
| 85,9 | 91,1 | 99,7 | 94,8 | |
| 86,7 | 88,1 | 95,6 | 91,7 | |
| A precisão intra-dia [%] | 87,6 | 89,0 | 96,0 | 95,7 |
| Intra-dia Imprecisão [CV%] | 1.9 | 2.7 | 2.7 | 5.3 |
| Dia 18 | 89,6 | 85,8 | 91,0 | 98,3 |
| 89,6 | 86,2 | 88,3 | 93,6 | |
| Fracassado | 86,7 | 96,8 | 104 | |
| 88,1 | 85,8 | 95,2 | 111 | |
| A precisão intra-dia [%] | 89,1 | 86,1 | 92,8 | 101.7 |
| Intra-dia Imprecisão [CV%] | 1.0 | 0,5 | 4.2 | 7,4 |
| Dia 19 | 98,0 </ td> | 89,7 | 94,2 | 102 |
| 88,3 | 86,0 | 97,6 | 102 | |
| 91,6 | 88,1 | 95,8 | 97,5 | |
| 90,7 | 90,1 | 92,8 | 88,3 | |
| A precisão intra-dia [%] | 92,2 | 88,5 | 95,1 | 97,5 |
| Intra-dia Imprecisão [CV%] | 4,5 | 2.1 | 2.2 | 6.6 |
| Dia 20 | 93,0 | 87,0 | 99,4 | 101 |
| 97,3 | 87,6 | 95,5 | 91,9 | |
| 89,0 | 88,4 | 91,2 | 93,5 | |
| 104 | 90,7 | 97,7 | 115 | |
| A precisão intra-dia[%] | 95,8 | 88,4 | 96,0 | 100.4 |
| Intra-dia Imprecisão [CV%] | 6,7 | 1.8 | 3.7 | 10,5 |
Inter-dia e Precisão Imprecisão | ||||
| Inter-dia Precisão | 95,2 | 91,7 | 97,2 | 101.6 |
| Inter-Day Imprecisão | 6.1 | 4,5 | 3.6 | 4.2 |
Tabela 3. Os resultados das amostras de controlo de qualidade mais de 20 dias. Os dados são apresentados como% do valor nominal. Amostras listados como "falhou" são amostras que foram perdidos para erros de laboratório / instrumentos. Na maioria dos CASES, sem picos foram detectados em todos ou o pico do padrão interno foi ausente.
| Diluição | 01:10 |
| Concentração alvo nominal após diluição | 50 ng / mL |
| 98,6 | |
| 94,5 | |
| 91,4 | |
| Precisão [%] | 94,8 |
| A imprecisão [CV%] | 3.6 |
| Diluição | 01:10 |
| Concentração alvo nominal após diluição | 10 ng / mL |
| 103 | |
| 99,5 | |
| 101 | |
| Precisão [%] | 101.2 |
| A imprecisão [CV%] | 1.8 |
| Diluição | 01:10 |
| Concentração alvo nominal após diluição | 25 ng / mL |
| 91,7 | |
| 98,2 | |
| 103 | |
| Precisão [%] | 97,6 |
| A imprecisão [CV%] | 5,7 |
Tabela 4. Resultados da diluição Teste de integridade. Os dados são apresentados como% do valor nominal.
| UMA | ||||
| Estabilidade à TA, 1 Dia | ||||
| Nível QC [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 91,9 | 85,8 | 86,0 | 102 | |
| 86,7 | 85,7 | 88,5 | 102 | |
| 86,0 | 85,9 | 90,1 | 103 | |
| 89,2 | 98,0 | 90,8 | 112 | |
| % De concentração nominal | 88,5 | 88,9 | 88,9 | 104.8 |
| Imprecisão [% CV] | 2.7 | 6.1 | 2.1 | 4.9 |
| Estabilidade à TA, Dia 3 | ||||
| Nível QC [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 88,6 | 105 | 101 | 113 | |
| 94,1 | 100 | 98,5 | 103 | |
| 100 | 101 | 106 | 109 | |
| 99,5 | 102 | 102 | 108 | |
| % De concentração nominal | 95,6 | 102.0 | 101.9 | 108.3 |
| Imprecisão [% CV] | 5.3 | 2.2 | 3.1 | 4.1 |
| Estabilidade à TA, Dia 7 | ||||
| Nível QC [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 105 | 103 | 91,7 | 109 | |
| 101 | 107 | 100 | 110 | |
| 102 | 108 | 107 | 105 | |
| 93,8 105 | 109 | 111 | ||
| % De concentração nominal | 100.5 | 105.8 | 101.9 | 108.8 |
| Imprecisão [% CV] | 4.7 | 2.2 | 7.8 | 2.6 |
| B | ||||
| Estabilidade a + 4 ° C, Dia 1 | ||||
| Nível QC [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 101 | 89,9 | 95,8 | 100 | |
| 88,9 | 91,0 | 94,1 | 99,0 | |
| 96,2 | 100 | 102 | 96,7 | |
| 89,5 | 87,8 | 95,4 | 88,6 | |
| % De concentração nominal | 93,9 | 92,2 | 96,8 | 96,1 |
| Imprecisão [% CV] | 5.8 | 5.4 | 3,5 | 5.2 |
| Estabilidade a + 4 ° C, Dia 3 | ||||
| Nível QC [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 87,3 | 85,2 | 105 | 95,3 | |
| Fracassado | 87,8 | 101 | 96 | |
| 101 | 88,8 | 89,6 | 97,5 | |
| 106 | 92,2 | 102 | 104 | |
| % De concentração nominal | 98,1 | 88,5 | 99,4 | 98,2 |
| Imprecisão [% CV] | 9.7 | 2.9 | 6.8 | 4 |
| Estabilidade a + 4 ° C, Dia 7 | ||||
| Nível QC [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 94,0 | 98,5 | 96,1 | 110 | |
| 92,9 | 96,4 | 109 | 109 | |
| 91,7 | 96,3 | 97,9 | 115 | |
| 94,7 | 96,9 | 99,8 | 113 | |
| % De concentração nominal | 93,3 | 97,0 | 100.7 | 111,8 |
| Imprecisão[%CV] | 1.3 | 1.0 | 5,7 | 2.8 |
| C | ||||
| Estabilidade a -20 ° C, Dia 3 | ||||
| Nível QC [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 87,3 | 98,7 | 111 | 111 | |
| 93,5 | 89,6 | 108 | 105 | |
| 89,5 | 91,5 | 107 | 112 | |
| 88,2 | 99,1 | 108 | 92,4 | |
| % De concentração nominal | 89,6 | 94,7 | 108,5 | 105.1 |
| Imprecisão [% CV] | 2.7 | 4.9 | 1.7 | 9 |
| Estabilidade a -20 ° C, Dia 7 | ||||
| Nível QC [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 96,5 | 98,7 | 102 | 109 | |
| 94,8 | 94,6 | 114 | 106 | |
| 95,5 | 102 | 98,1 | 108 | |
| 107 | 99,5 | 115 | 105 | |
| % De concentração nominal | 98,5 | 98,7 | 107.3 | 107 |
| Imprecisão [% CV] | 5,7 | 3.1 | 8,5 | 1.8 |
| </ td> | ||||
| Estabilidade a -20 ° C, Dia 30 | ||||
| Nível QC [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 82,3 | 83,1 | 90,4 | 93,2 | |
| 87,9 | 85,8 | 85,3 | 97,9 | |
| 85,7 | 88,6 | 98,3 | 98,0 | |
| 92,0 | 95,6 | 110 | 103 | |
| % De concentração nominal | 87,0 | 88,3 | 96,0 | 98,0 |
| Imprecisão [% CV] | 4.1 | 5.4 | 10,8 | 4 |
| D </ td> | |||||||||
| Estabilidade a -80 ° C, Dia 3 | |||||||||
| Nível QC [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 | |||||
| 87,5 | 96,5 | 96,7 | Fracassado | ||||||
| Fracassado | 97,6 | 98,7 | 110 | ||||||
| 88,8 | 96,4 | 106 | 109 | ||||||
| 87,3 | 101 | 96,5 | 109 | ||||||
| % De concentração nominal | 87,9 | 97,9 | 99,5 | 109.3 | |||||
| Imprecisão [% CV] | 0,8 | 2.2 | 4,5 | 0,6 | |||||
| Estabilidade a -80 ° C, Dia 7 | Nível QC [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 | ||||
| Fracassado | 98,0 | 105 | 99,8 | ||||||
| 97,1 | 106 | 104 | 105 | ||||||
| 99,7 | 102 | 99,3 | 102 | ||||||
| 101 | 99,9 | 109 | 106 | ||||||
| % De concentração nominal | 99,3 | 101.5 | 104.3 | 103.2 | |||||
| Imprecisão [% CV] | 2.0 | 3.4 | 4 | 2.8 | |||||
| Estabilidade a -80 ° C, Dia 30 | |||||||||
| Nível QC [ng / ml] | 2 | | 20 | 40 | | |||||
| 88,2 | 85,3 | 89,6 | 96,7 | ||||||
| 96,2 | 92,6 | 85,8 | 94,1 | ||||||
| 83,9 | 93,7 | 91,0 | 105 | ||||||
| 95,6 | 94,0 | 98,9 | 102 | ||||||
| % De concentração nominal | 91,0 | 91,4 | 91,3 | 99,5 | |||||
| Imprecisão [% CV] | 6 | 4.1 | 5.5 | 4.9 | |||||
| E | ||||
| Estabilidade descongelamento congelamento, -20 ° C, 1 ciclo | ||||
| Nível QC [ng / ml] </ td> | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 92,5 | 86,2 | 90,2 | 94,3 | |
| 89,8 | 90,5 | 85,4 | 104 | |
| 94,7 | 88,6 | 93,4 | 104 | |
| 101 | 89,2 | 93,7 | 96,3 | |
| % De concentração nominal | 94,5 | 88,6 | 90,7 | 99,7 |
| Imprecisão [% CV] | 4.8 | 1.8 | 3.9 | 5.1 |
| Congelar descongele a estabilidade, a -20 ° C, 2 ciclos | ||||
| Nível QC [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 99,1 | 97,6 | Fracassado | 85,3 | |
| 93,1 | 88,1 | 93,4 | 92,0 | |
| 94,9 | 91,5 | 85,8 | 93,9 | |
| Fracassado | 90,5 | 86,8 | 85,4 | |
| % De concentração nominal | 95,7 | 91,9 | 88,7 | 89,2 |
| Imprecisão [% CV] | 3.1 | 4 | 4.1 | 4,5 |
| Congelar descongele a estabilidade, a -20 ° C, 3 ciclos | ||||
| Nível QC [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 95,7 | Fracassado | 86,0 | 93,3 | |
| 95,5 | 87,4 | 85,0 | 91,3 | |
| 90,5 | 89,1 | 86,0 | 86,0 | |
| 96,9 | 85,7 | 90,2 | Fracassado | |
| % De concentração nominal | 94,7 | 87,4 | 86,8 | 90,2 |
| Imprecisão [% CV] | 2.8 | 1.7 | 2.3 | 3.8 |
| F | ||||
| Estabilidade amostra extraída a + 4 ° C, 24 hr | ||||
| Nível QC [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 122 | 112 | 91,0 | 104 | |
| 93,5 | 106 | 91,8 | 96,1 | |
| 111 | 94,8 | 98,2 | 93,5 | |
| 98,4 | 97,6 | 91,3 | 89,8 | |
| % De concentração nominal | 106.2 | 102.6 | 93,1 | 95,9 |
| Imprecisão [% CV] | 12,8 | 7.9 | 3.4 | 6 |
| Estabilidade da amostra extraída a 4 ° C, 48 h | ||||
| Nível QC [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 106 | 108 | 93,7 | 110 | |
| 105 | 98,1 | 94,6 | 98,9 | |
| 103 | 98,4 | 95,0 | 92,6 | |
| 108 | 93,1 | 89,7 | 85,5 | |
| % De concentração nominal | 105.5 | 99,4 | 93,3 | 96,8 |
| Imprecisão [% CV] | 2.1 | 6.2 | 2.4 | 10,4 |
| Estabilidade da amostra extraída a 4 ° C, 72 h | ||||
| Nível QC [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 96,5 | 112 | 96,4 | 104 | |
| 101 | 95,3 | 103 | 95,2 | |
| 94,2 | 105 | 93,5 | 99,5 | |
| 100 | 96,9 | 92,6 | 89,3 | |
| % De concentração nominal | 97,9 | 102.3 | 96,4 | 97,0 |
| Imprecisão [% CV] | 3.1 | 7.7 | 4.7 | 6.3 |
Tabela 5. Resultados do Teste de estabilidade. A: Estabilidade do tacrolimus em manchas de sangue seco em temperatura ambiente por 7 dias, B: Estabilidade de tacrolimus em manchas de sangue seco no frigorífico (4 ° C) durante 7 dias, C: Estabilidade do tacrolimus em manchas de sangue seco a -20 ° C ao longo de 1 mês, D: Estabilidade do tacrolimus em manchas de sangue seco a -80 ° C durante 1 mês, E: Estabilidade do tacrolimus em manchas de sangue seco ao longo de três ciclos de congelação-descongelação (-20 ° C), M : Amostra extraída estabilidade / amostrador automático a + 4 ° C durante 72 h. Os dados são apresentados como% da concentração nominal. Amostras listados como "falhou" são amostras que foram perdidos para erros de laboratório / instrumentos. Na maioria dos casos não foram detectados picos em tudo ou o pico do padrão interno estava faltando.
Figura 1. Estrutura de numeração Atom Tacrolimus. Segue a União Internacional de Nomenclatura Química Pura e Aplicada (IUPAC). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Ligação da válvula de comutação."Target =" _ blank 424fig2large.jpg "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Cromatogramas representativos íon. (A) cromatograma de iões de representante de um amostras de sangue manchado em branco no papel de filtro (para mais detalhes fabricante, consulte Lista de Materiais) e seca. A seta marca o tempo de retenção do pico de tacrolimus, (B) cromatograma iónico representativas de um sangue branco amostras doseadas com o limite inferior de quantificação (1 ng / mL) observado para o papel de filtro e secou-se, e (C) cromatograma iónico representativas de uma amostra recolhida de um paciente de transplante em papel de filtro. Esta é uma amostra de calha e a concentração de tacrolimus medido foi de 2,1 ng / ml. Esta amostra foi coletada pelo paciente em casa e é a partir de um ensaio clínico que foi aprovado pela Universidade de Cincinnati Institutional Review Board (Cincinnati, OH). Todos os pacientes deram seu consentimento por escrito adequado. Cromatogramas iónicos são documentos impressos originais como gerado pelo software de espectrometria de massa (para detalhes fabricante, consulte Lista de Materiais). Linhas azuis e vermelhas em cromatogramas de íons representam o padrão D interno 2, 13 C-tacrolimus e tacrolimus, respectivamente. O pico de eluição na frente do tacrolimus principal e picos do padrão interno são os rotâmeros. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Curva de Calibração representativas. Mostra-se uma impressão de saída original, tal como gerada pelo software de espectrometria de massa.424 / "target =" _ blank 52424fig4large.jpg "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Representante Ion Chromatogram Medido durante a pós-Column A infusão de Tacrolimus e Injecção de uma amostra de sangue em branco extraído para avaliar um determinado efeito potencial Matrix (Ion Supressão / Ion Enhancement). A seta marca o tempo de retenção do pico de tacrolimus. Testes de efeito de matriz foi baseado no processo descrito no 46. Nenhuma matriz relevante efeito foi detectado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Embora, como acima mencionado, o conceito de fármaco terapêutico e monitorização aderência do tacrolimus com base em manchas de sangue seco é atraente, existem desafios analíticos que ultrapassam aquelas tipicamente associados com a análise por LC-MS / MS do tacrolimus em EDTA venoso amostras de sangue inteiro. Estes incluem, mas não estão limitados a, o facto de a matriz capilar é sangue completo embebido no material de fibras de algodão do material de cartão de filtro usado aqui e o baixo volume de sangue (20 ul). No entanto, a análise de alto rendimento num laboratório central requer um método de extracção rápida e fiável que resulta em amostras que não possuem as interferências da matriz e os efeitos da matriz em combinação com um ensaio de LC-MS / MS robusta, específica e altamente sensível. Fiabilidade do ensaio é crítica, dado que geralmente não é suficiente no material de cartão de filtro já perfurado esquerda para a re-análise no caso da extracção / A análise por LC-MS / MS falhar.
A fiLTER cartões utilizados no presente estudo (para detalhes fabricante, consulte Lista de Materiais) foram escolhidos como estes são um dispositivo de classe II aprovado pela FDA, estão em conformidade com as orientações NCCLS LA4-A5 44 e estão na Europa com a marca CE. Se completamente cheia, um círculo no cartão de filtro Whatman 903 detém ≈50 mL de sangue 46. No entanto, o tamanho das gotas de sangue coletadas por pacientes individuais variam e formação na técnica de amostragem adequada é essencial 46.
O primeiro passo importante da extracção de um-out perfurado secou amostra mancha de sangue é a homogeneização. Com base na nossa experiência, a utilização de um misturador de bala é mais eficiente e mais reprodutíveis do que outros métodos usados para melhorar a eficiência de extracção, tais como sonicação. O uso do misturador bala foi essencial para alcançar de forma consistente recuperações de extracção acima de 90%. Para fiabilidade do processo de extração, foi também importante assegurar que todas as centrífugas foram Temperature controlada (4 ° C) e que o passo de vórtice não foi mais curto do que 10 minutos, o que resultou na recuperação de extracção mais variáveis e menores. Além disso, é importante que a proporção de metanol / ZnSO4 não é alterada como tacrolimus recuperação é muito sensível para a composição correcta da solução de precipitação de proteína.
O desafio seguinte é obter um extracto limpo de preferência desprovida de materiais que podem causar interferências da matriz e efeitos. Assim, um simples passo de precipitação de proteína-passo como frequentemente usado para a extracção de amostras de sangue a partir de tacrolimus EDTA não foi considerado uma opção viável. Após a precipitação das proteínas usando ZnSO4 (incluindo a adição de um padrão interno marcada com isótopo), vortex e centrifugação, os sobrenadantes foram injectadas num sistema de HPLC e 2D sobre uma coluna de extracção em linha. Extração coluna on-line utilizando altas vazões de 5 ml / min em cartuchos de pré-colunas convencionais usando um simples 6-portválvula de comutação para a análise de tacrolimus tem sido descrito antes 47. A fase móvel foi escolhida de modo a que o tacrolimus e do seu padrão interno concentrados na parte da frente da coluna de extracção e não migram através da coluna durante a etapa de limpeza. A extracção em linha utilizado no presente protocolo teve diversas vantagens, incluindo a injecção de grandes volumes de amostra relativamente sem afectar negativamente a análise por HPLC. A parte traseira embutida depois de enriquecer os analitos na parte superior da coluna de extracção ("pico de focagem») resultou em picos mais nítidas que permitem a integração mais confiável pelo algoritmo de software especialmente para amostras com baixas concentrações de tacrolimus. 48 A etapa de limpeza on-line não só remover compostos potencialmente interferentes da matriz, mas também de-sal da amostra. Um problema ainda raramente discutido importante para-volume elevado, de alto rendimento ensaios de LC-MS / MS é a perda gradual da sensibilidade do sistema de LC-MS / MS, devido ao aumentocontaminação da fonte de electropulverização durante a análise de grandes lotes. Não foram observados efeitos de matriz significativos (realce supressão / ion ion). O efeito negativo dos efeitos potenciais matriciais foram reduzidos / evitada por combinação dos seguintes elementos: precipitação de proteínas eficaz utilizando metanol / ZnSO4, centrifugação após precipitação de proteínas a 16.000 xg, a extração on-line de alto fluxo, separação cromatográfica clara de tacrolimus de potenciais interferências eluição precoce a partir da coluna analítica e a utilização de tacrolimus marcada com isótopos como padrão interno, em vez de padrões internos estruturalmente relacionados, tais como ascomicina.
O limite inferior de quantificação foi de 1 ng / ml, e, assim, menor do que a maioria dos imunoensaios que são actualmente frequentemente usada para monitorização terapêutica de tacrolimus em amostras de sangue com EDTA. Este limite inferior de quantificação é suficiente até mesmo para os chamados inibidores da calcineurina baixo immunosuppres longo prazoprotocolos de manutenção sive.
Em comparação com os anteriormente descritos ensaios de LC-MS / MS para quantificar tacrolimus sangues secas acaba 29-34,36,39,41,42, os presentes resultados de ensaio ou excede o seu desempenho em termos de limite inferior de quantificação, de recuperação de extracção, a precisão e precisão, evitando conceitos potencialmente de risco, como uma etapa procedimentos de precipitação de proteína e tempos de cromatografia ultra-curtos, que geralmente dão resultados aceitáveis durante a validação com base em amostras de sangue de indivíduos saudáveis. No entanto, pacientes transplantados são um grupo altamente complexo de pacientes que têm doenças que afetam a composição do sangue e que tomam vários medicamentos. Isto faz com que seja virtualmente impossível excluir todas as interferências potenciais que podem estar presentes em pacientes individuais durante a validação e a única estratégia viável é a de configurar o ensaio de uma forma que minimiza o risco de tais interferências potenciais. Seca spo sangueTs têm desafios, tais como o efeito do hematócrito da viscosidade do sangue e, assim, as propriedades de difusão do sangue aplicado sobre papel de filtro 49. Este não foi testado aqui novamente como esses efeitos já foram descritas para não afetar a análise de tacrolimus em manchas de sangue seco na hematócritos e as concentrações de tacrolimus dentro de limites razoáveis clinicamente 29,32. Além disso a estabilidade de tacrolimus em manchas de sangue seco a temperaturas elevadas já foi estudada por outros e tacrolimus em manchas de sangue seco foi encontrado para ser estável durante 5 dias a 37 ° C e mesmo 60 ° C 32, a qual é importante para o transporte de sangue seco manchas em condições não com temperatura controlada, especialmente durante o verão.
Este ensaio com base em uma combinação de bala misturador de homogeneização, de alta limpeza de coluna de fluxo em linha e análise por LC-MS / MS pode fornecer uma estratégia de plataforma para o desenvolvimento de ensaios para a quantificação bioanalíticas de outro immunosuppressants, isoladamente ou em simultâneo, assim como de outras drogas em amostras pontuais sangue seco.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tacrolimus | U.S. Pharmacopeial Convention | 1642802 | |
| D2,13C-Tacrolimus | Toronto Research Chemicals Inc. | F370002 | |
| Red blood cells | University of Colorado Hospital | W20091305500 V | |
| Plasma | University of Colorado Hospital | W2017130556300Q | |
| Acetone CHROMASOLV, HPLC, ≥99,9% | Sigma-Aldrich | 439126-4 L | |
| Acetonitrile Optima LC/MS, UHPLC-UV | Thermo Fisher Scientific | A955-4 | |
| Isopropanol 99.9%, HPLC | Fisher Scientific | BP2632-4 | |
| Methanol Optima LC/MS | Thermo Fisher Scientific | A452-4 | |
| Water Optima LC/MS, UHPLC-UV | Thermo Fisher Scientific | W6-4 | |
| Formic acid | Thermo Fisher Scientific | A118P-500 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Zinc sulfate | Thermo Fisher Scientific | Z68-500 | |
| 0.5 – 10 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008649 | |
| 1.5 ml Eppendorf tube | Thermo Fisher Scientific | 02-682-550 | |
| 10 – 100 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008651 | |
| 10 μl pipet tips with filter, sterile | Neptune | BT 10XLS3 | |
| 100 – 1,000 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008653 | |
| 100 μl pipet tips with filter, sterile | Neptune | BT 100 | |
| 1,000 μl pipet tips with filter, sterile | Multimax | 2940 | |
| 2 – 20 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008650 | |
| 2 ml Eppendorf tube | Thermo Fisher Scientific | 02-681-258 | |
| 20 – 200 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008652 | |
| 20 μl pipet tips with filter, sterile | GeneMate | P-1237-20 | |
| 200 μl pipet tips with filter | Multimax | 2938T | |
| 200 μl pipet tips with filter, sterile | Multimax | 2936J | |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
| 300 μl inserts for HPLC vials | Phenomenex | ARO-9973-13 | |
| Balance PR2002 | Mettler Toledo | 1117050723 | |
| Balances AX205 Delta Range | Mettler Toledo | 1119343379 | |
| Bullet Blender Homogenizer | Next Advance | BBX24 | |
| Centrifuge Biofuge Fresco | Heraeus | 290395 | |
| Disposable Wipes | PDI | Q55172 | |
| Glass v ials, 4 ml | Thermo Fisher Scientific | 14-955-334 | |
| Glass vials, 20 ml | Thermo Fisher Scientific | B7800-20 | |
| Gloves, nitrile | Titan Brand Gloves | 44-100S | |
| HPLC vials, 9 mm, 2 ml, clear | Phenomenex | ARO- 9921-13 | |
| Lids for HPLC vials | Phenomenex | ARO- 8952-13-B | |
| Needle, 18 G 1.5 | Precision Glide | 305196 | |
| Rack for Eppendorf tubes | Thermo Fisher Scientific | 03-448-11 | |
| Rack for HPLC Vials | Thermo Fisher Scientific | 05-541-29 | |
| Steel beads 0.9 – 2 mm | Next Advance | SSB14B | |
| Storage boxes for freezers / refrigerators | Thermo Fisher Scientific | 03-395-464 | |
| Standard multi-tube vortexer | VWR Scientific Products | 658816-115 | |
| Whatman Paper, 903 Protein Saver US 100/PK | GE Whatman | 2016-05 | |
| Autosampler | CTC PAL | PAL.HTCABIx1 | |
| Binary pump, Agilent 1260 Infinity | Agilent Technologies | 1260 G1312B | |
| Binary pump, Agilent 1290 Infinity | Agilent Technologies | 1290 G4220A | |
| Micro vacuum degasser, Agilent 1260 | Agilent Technologies | 1260 G13798 | |
| Column oven, Agilent 1290 with 2 position | Agilent Technologies | 1290 G1216C | |
| Thermostated column compartment with integrated 6 port switching valve | Agilent Technologies | 1290 G1316C | |
| HPLC pre-column cartridge, Zorbax XDB C8 (5 µm particle size), 4.6 · 12.5 mm | Phenomenex | 820950-926 | |
| HPLC analytical column, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 µm particle size), 4.6 · 150 mm | Phenomenex | 993967-906 | |
| Tandem Mass Spectrometer | |||
| API5000 MS/MS with TurboIonspray source | AB Sciex | 4364257 | |
| Mass spectrometry software | AB Sciex | Analyst 1.5.1 |
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