Abstract
Følgende protokol er brug for at evaluere nedsat hjertefunktion eller myokardielammelse følgende moderate iskæmiske fornærmelser. Teknikken er nyttig til modellering iskæmisk skade i forbindelse med talrige klinisk relevant fænomen herunder hjertekirurgi med cardioplegisk arrestation og kardiopulmonal bypass, off-pumpe CABG, transplantation, angina, korte iskæmi, osv. Protokollen indeholder en generel metode til at modellere hypotermisk hyperkalemic cardioplegisk anholdelse og reperfusion i gnavere hjerter med fokus på måling af myocardial kontraktile funktion. Kort fortalt er en mus hjerte perfunderet i Langendorff tilstand, instrumenteret med en intraventrikulære ballon, og baseline kardiale funktionelle parametre registreres. Efter stabilisering, hjertet er så underlagt orientere infusion af en hjertebeskyttende hypotermisk kardioplegi løsning til at indlede diastoliske anholdelse. Kardioplegi leveres med mellemrum i løbet af 2 timer. Hjertet bliver derefter reperfunderes og Warmed til normotermiske temperaturer og genvinding af myokardie funktion overvåges. Brug af denne protokol resulterer i pålidelige deprimeret hjertefunktion kontraktile funktion fri fra brutto myocardial vævsskader hos gnavere.
Introduction
Myokardielammelse defineres som reversibel nedsat kontraktile aktivitet trods restaurering af tilstrækkelig blodgennemstrømning efter en kort periode med iskæmi eller længere perioder af iskæmiske fornærmelser med kardiobeskyttelse 1,2,3,4,5. Den præsenterede metode anvendes til at modellere klinisk relevante iskæmiske fornærmelser som kan resultere i reversibel svækkelser i kontraktil funktion (dvs. iskæmiske fornærmelser forbundet med hjertekirurgi udnytte kardioplegisk standsning, korte perioder med iskæmi, angina, etc.). I modsætning til alvorlige iskæmi undersøgelser (myokardieinfarkt, nekrose) Denne protokol blev udviklet til evaluering myokardie funktionel genopretning og kardiobeskyttelse uden vævsskade, remodeling, og celledød. Størstedelen af artikel diskuterer en standard cardioplegisk anholdelse protokol med elementer svarende til en hjerteoperation hjælp hypotermi og intermitterende kardioplegi levering.
Myocardial protfdeling under størstedelen af hjertekirurgi afhængig kardioplegi og kardiopulmonal bypass. Selvom kardioplegi (CP) løsninger og strategier varierer meget (blod, krystalloid, kulde, varme etc.) de mest almindelige elementer er 1) hyperkaliæmi og / eller andre strategier for at anholde hjertet i diastole, hvilket begrænser energiudnyttelse følge af myokardie sammentrækning, og 2) hypotermi til langsom metabolisme og hjælpe med at opretholde ATP og andre energireserver mens arresteret. Aktuelle kardioplegi løsninger giver beskyttelse til hjertet mod iskæmiske fornærmelser, der ellers ville vise sig letal. Imidlertid hjertebeskyttende strategier under kirurgisk iskæmiske fornærmelser er ikke perfekte, og den resulterende mild iskæmisk skade kan resultere i reversibel kardial kontraktil dysfunktion trods tilstrækkelig blodgennemstrømning (myokardielammelse), acidose, cardiomyocythypertrofi skader, og vaskulære virkninger, herunder reduceret koronar perfusion og vasospasme.
Denne protokol adskillerfra standard isolerede hjerte iskæmimodeller evaluering myokardieinfarkt og alvorlig iskæmi, idet den vurderer mildere iskæmiske fornærmelser, som kan resultere i nedsat hjertefunktion følgende korte iskæmi eller iskæmiske fornærmelser forbundet med cardioplegisk anholdelse. (Til gennemgang på Langendorff perfusion teknikker og I / R undersøgelser se 6 - 8). For generelle retningslinjer og en grundig analyse af eksperimentelle parametre forbundet med musen isolerede perfunderede hjerter se Sutherland e t al. 2003 9 Teknikken præsenteres her beskriver den nødvendige udstyr, reagenser, trin, strategier og tips til pålideligt fremkalde bedøvelse i mus hjerter. Mindre ændringer er nødvendige for at anvende teknikken til rotter.
Kort fortalt isoleret muse hjerter Langendorff perfunderes i ca. 30 min med fysiologisk Krebs-Henseleit puffer (KHB) efterfulgt af koldt beskyttet hjertestop via levering af et hyperkalemic hypothermic kardioplegi opløsning. Efter anholdelse, er hjerte-funktionel genopretning overvåges under genopvarmning og reperfusion af hjertet med KHB. Ændringer i graden af genvinding af hjertefunktion kontraktile funktion kan evalueres for at vurdere cardioprotektive agenter og forskellige hjertebeskyttelsesassays strategier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Alle procedurer blev godkendt af Levetid Institutional Animal Care og brug Udvalg og alle dyr og procedurer i henhold til National Research Council Guide for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr 10.
1. Ballon Fabrikation og venstre ventrikel tryk Overvågning Circuit
- Konstruere LV balloner ifølge Miller et al. 11 I et bægerglas med en omrører, blandes 9,5 ml destilleret vand, 14,2 ml af lys majssirup og 33,8 g saccharose, og der opvarmes på varmeplade, bland indtil sukkeret opløses . Fortsæt varmeløsning indtil den når ca. 150 ºC.
BEMÆRK: Talrige metoder eksisterer for at konstruere LV balloner herunder ændring af kondom tips og plastfolie konstruktion 9,12. Vi finder den ovennævnte metode til at være relativt let at konstruere lækage-fri balloner, men en fordel af plastfolie balloner inkluderer tidligere karakterisering for passende frecy-respons relationer 9. - Bryde tørre spaghetti tråde i stykker omkring 5 cm i længden og dyppe den ene side af hvert stykke omkring 1 cm dybt ind i sukkeropløsning og langsomt fjerne.
- Placer den tørre ende af pastastrengen i en polystyrenskum blok og suspendere så sukker mix drypper ned og danner en dråbeform støbeform. Lad O / N i en ekssikkator, så formen hærder.
- Den følgende dag, dyppe formene i silikone spredning gel. Placer pasta tråde tilbage i polystyrenskum blok og plads i en en 37 ºC ovn i 2 timer, eller indtil tør. Gentag dette trin en gang mere, så to lag silicone anvendes.
- Efter tørring til sted i vand i flere timer bistå med fjernelse af ballonen fra formen. Store balloner i 0,02% natriumazid-opløsning.
- Brug en 23 G blodtapning indstillet til at give en tilpasset ballon kanyle ved at skære en nål for at skabe en stump spids og placere indhak i nålen.
- Slut slangen til et tryk transducent og skylles med vand og samtidig holde slanger og kanyle helt neddykket at forhindre luft i at trænge ind i systemet. Placer en ballon, der er blevet fyldt med vand på kanylen og bruge 2-0 silkesuturer at binde på kanylen. Test ballon ved evne til at opretholde tryk (~ 100 mmHg i mindst 1 time)
2. Fremstilling af det isolerede hjerte Perfusion System
- Indledningsvis, vaske og opvarme systemet. Tænde en 37 ºC varmt vandbad cirkulationspumpe, der er blevet tilsluttet Langendorff apparat, og fyld pufferreservoir med destilleret vand. Tilslut en ny glasfiber filter til at slanger strømmer ind apparat og tænd pumpen til at skylle ud i systemet. Under prep tid, overvåge temperaturen af vandet uddrives fra Langendorff blokken under anvendelse af en temperaturprobe, at sikre, at vandbad indstilles nøjagtigt. Også tænde en nedkølet cirkulationspumpe og indstillet til 20 ºC, som vil blive brugt under cardioplegisk anholdelse af hjertet.
- Jegn mellemtiden forberede følgende løsninger. Forbered 1 L kardioplegi opløsning (110 mM NaCl, 16 mM KCI, 16 mM MgCl2, 1,5 mM CaCl2, 10 mM NaHCO3) og filtreres. Også forberede 2 liter KHB (118 mM NaCl, 4,8 mM KCI, 1,2 mM KH 2 PO 4, 1,7 mM MgSO4, 2 mM Na-pyruvat, 6 mM dextrose, 24,9 mM NaHCO3 (præ-beluftet med CO 2) , 1,4 mM CaCl2 (tilsat sidst). Efter opløsning fjerne præcipitater ved filtrering i en kolbe under anvendelse af en 5 um glas frittet tragt. Sted nogle i en lille skål på is, der skal anvendes under kirurgi og isolation.
- Ilte perfusatet (KHB) med 95% O2 / 5% CO2 i mindst 30 min før anvendelse. Perfundere Langendorff-system med KHB at fjerne eventuelt resterende vand fra systemet og buffer reservoir. For mus, sætte det oprindelige pumpehastighed til ~ 2,0 ml / min. Placer 2-0 og 4-0 silkesuturer nær perfusion kanyle. Køre pumpen indtil slangen og apparatet er fyldt with perfusat og sikre boblen strup er fyldt med perfusat.
BEMÆRK: lange perioder med perfusion og stabil funktion er det stærkt anbefales at installere en in-line glasfiberfilter (~ 1 um) i perfusionskredsløbet at indsamle eventuelle bundfald, som kunne danne blodpropper i hjertet
3. Mus Surgery
3.1) Mus Anæstesi og håndtering
- Forbered sprøjte med bedøvelse dosis på 80 mg / kg ketamin og 5 mg / ml xylazin blanding, og tilsæt sterilt 0,9% saltvand for at få volumen til 0,2 ml. Injicer Heparin IP (50 pi af opløsning 1,000 U / ml).
- Placer musen tilbage i transport container (~ 10-20 min) og vente på, at miste bevidstheden som heparin får virkning. Periodisk gøre en tå knivspids til at overvåge smerte refleks.
3.2) Tag Heart
- Når musen er fuldt bevidstløs og ikke reagerer på tå knibe, fastgøre den til et passende operationsbord hjælp stifter eller 25 G syringe tip gennem ekstremiteterne. Udfør en torakotomi at eksponere hjertet. Skær et lille hul lige under brystbenet og udvide snittet til siderne af musen undgå membranen.
- Hurtigt klippe membranen og derefter hurtigt skåret op i siderne af brystkassen. Flip tilbage brystkassen som en muslingeskal at blotlægge brysthulen. Forsigtigt tage fat i hjertet, placere saks nedenunder og tag hjerte.
BEMÆRK: Det er vigtigt at hurtigt at fjerne hjertet, når det udsættes i brysthulen og lungerne er ikke-funktionelle.
3.3) Rengør Heart
- Placer hjerte i fadet, som indeholder iskold KHB og trim off eventuelle store stykker af lungevæv vedlagt. Brug pincet til at afhente hjerte og find aorta. Tryk forsigtigt på hjertet og se efter noget blod, der vises, da dette bør være den åbne ende af aorta. Anvendes der fine spids pincet til at holde hjertet ved den åbne ende af aorta.
4.1) Montering og kanylering hjertet
- Før transport hjertet til Langendorff apparat, tænd pumpen sikrer, at perfusionstryk er lav (~ 20 mmHg). Hold hjertet ved aorta lige under kanylen. Brug en anden sæt fine spids pincet forsigtigt åbne aorta og skub hjerte op på kanylen. Holde den på plads med et sæt pincet og derefter bruge en blød kant klip midlertidigt fastgøre den til kanylen.
BEMÆRK: Hurtigt montere hjertet til perfusion kanylen er kritisk for en god forberedelse. Med erfaring, bør procedurerne fra åbne brysthulen indtil montering hjertet tager mellem 1 og 2 minutter. - Bind og initiere perfusion som følger, ved hjælp af 4-0 silke sutur sikker aorta til kanylen direkte under klippet. Sørg for, slips er også rundt om metallet aorta kanyle, så aorta ikke bliver bundet af, når stramningknude. Når man tie er fast placeret, fjerne klippet.
- Bruge ekstra silkesuturer at fastgøre aorta sikkert til kanylen og sørg for at binde off under eventuelle fartøj grene, der kan kommer fra aorta. Disse kan ofte være plettet af perfusatet utæt eller skyde ud fra aorta.
BEMÆRK: Under de indledende faser af perfusion af blod skal vaske fra hjertet og hele hjertet skal vises en blød lyserød farve. Mørke misfarvninger som ikke vasker ud indikerer iskæmiske områder sandsynligt skyldes luft emboli eller klumper og hjertet bør ikke anvendes.
4.2) Etablering Perfusion og LVP Måling
- Langsomt øge perfusion tryk og øge pumpens hastighed, indtil perfusion trykket når 70 mmHg.
BEMÆRK: Standard perfusion pres for mus perfusion kan være 70-90 mmHg, men skal holdes konstant fra dyr til dyr inden et eksperiment. - Rengør resterende væv (lunge, skjoldbruskkirtel etc.), Der stadig kan være fastgjort til hjertet. Bruge en saks til at afskære de venstre atria for at skabe en åbning i den venstre ventrikel.
- Placer ballonen på holderen og tage gassen. Placere ballonen kanyle nær aorta kanyle, direkte over åbningen i den venstre ventrikel. Sæt forsigtigt ballon nedad i venstre ventrikel, mens du holder hjertet på plads, så aorta ikke rive.
- Når den er på plads langsomt begynde at puste ballonen op, indtil LVEDP når ~ 8 mmHg. Placer temperatursonde mod bunden af hjertet, så den måler temperaturen af spildevandet.
4.3) Basal Måling
- Forsegle hjerte i en vand kappe perfusion kammer. I denne periode kontinuerligt perfundere hjertet med KHB, og sikre, at temperaturen fortsætter med at stige. Overvåge temperaturen og juster vandbad i overensstemmelse hermed, indtil den når ca ~ 37 ºC.
BEMÆRK: Overvågning Temperature i de indledende faser af perfusion er kritisk, da koronare strømme og efterfølgende temperaturen kan variere fra hjerte til hjerte. Afløbsvandets temperatur perfusatet overvåges for ønsket myocardial temperatur via en temperatursonde placeret ved spidsen af hjertet. Hertil kommer, i forhold til andre Langendorff perfusion protokoller, hjertet ikke nedsænket i CP eller KHB under perfusion eller arrest, dette primært gjort for hurtigt at justere temperaturen samt give effektiv CP levering uden diffusion. - Begynd at løbende registrere funktionel måling med et dataopsamlingssystem knyttet til de relevante følere, herunder perfusionstryk, venstre ventrikel tryk (tryktransducer tilknyttet LVP ballon), temperatur og elektrofysiologiske parametre (EKG, MAP hvis monteret) (vedhæftet fil vil være ifølge fabrikanterne og specifik for de enkelte sensorer og dataopsamling systemet). Når spildevandet KHB når ~ 37 ºC i mindst 15 min og hjerte-funktionelle parametre er stabile, bemærk tiden for baseline-målinger.
BEMÆRK: Inklusion / eksklusion kriterier anvendes til hvert hjerte. En LVDP på <60 mmHg ved baseline indikerer et hjerte, der bør fjernes fra analysen. Desuden koronar flow> 4.5 ml / min, eller manglende evne til at opretholde perfusionstryk ved baseline sandsynligvis indikerer en utæt eller revet aorta. Også eventuelle hjerter, der har klare iskæmiske områder, som kan bekræftes visuelt (dvs. blodprop) eller udviser iskæmi-associerede reduktioner i hjertefunktion (dvs. stigende LVEDP, ekstremt arytmiske) fjernes fra analysen. - Måle koronar flow via indsamling af koronar spildevand i en gradueret cylinder til 1 min. Kammeret lukkes og tillade temperatur og fungerer til at vende tilbage til basisværdier. Alternativt måler koronarstrømning kontinuerligt i perfusionsledning via en strømningssonde placeret efter overtryksventilen kredsløb.
- Placer 100 ml kold kardioplegi puffer ind i en anden beholder og. overføre KHB reservoir kanyle til kardioplegi reservoiret.
- Tag vand kappe boliger og perfusionen opvarmning kredsløb fra den varme vandbad og oprette forbindelse til det afkølede cirkulationspumpe bruger slanger quick afbryder. Brug separate opvarmning og køling cirkulationspumper at tillade hurtige temperaturændringer i hjertet og perfusatet.
- Følg luftboblen, der bliver indført i rørledningen under kontakten, og når den når nær det isolerede hjerte start timingen for kardioplegi. Levere kardioplegi i 2 min. Efter den første dosis stoppe pumpen. Sørg for at arrestere hjertet i diastole og være tæt på den ønskede CP temperatur.
BEMÆRK: En tilstrækkelig boble fælde er nødvendigt at undgå luft emboli i hjertet. Alternativt et leveringssystem for begge reservoirer kobles af en stophane kan let konstrueres, men vi finder følgeing den lille luftboble, der indføres, når bytte kanylen mellem reservoirer, en let metode til timing CP levering givet potentielt forskellige pumpe hastigheder mellem eksperimenter (dvs., på grund af mus / rotte, perfusionstryk, filter modstand, osv.) - Holde hjertet i kardioplegi i 2 timer ved ~ 20 ºC. Hver halve time under CP vende pumpen igen i 1 min, så en anden dosis indgives.
BEMÆRK: Periodiske doser af CP hver 30 min resulterer i funktionel svækkelse af hjertet uden nekrose af vævet. Længere perioder mellem doser af CP (dvs.> 45 min) kan resultere i nekrose og iskæmisk kontraktur og ville være mere passende for en model af nekrotisk skade forbundet med ubeskyttet iskæmi.
6. Reperfusion
- Ved udgangen af CP, overføre reservoiret kanylen tilbage til iltet KHB. Forbind temperaturen styrekredsløb til varmesystemet cirkulationspumpe og drej pumpenpå at starte reperfusion. På dette tidspunkt kardioplegi udvasker, observere temperaturstigningen og hjertet begynder at slå igen efter 2-4 minutters reperfusion. Når hjertet starter hjerteslag er langsom og ofte arytmiske.
BEMÆRK: Der er normalt ikke en stor stigning i diastolisk LVP (dvs. ≤10 mmHg stigning) som ofte karakteristisk i ren iskæmimodeller. Arytmier kan vare langt ind reperfusion og lejlighedsvis hjertet vil skulle defibrillated. Dette kan opnås ved anvendelse af en stimulator sæt til højere spændinger (~ 10-50 V) og elektroder placeret på basen og hjertespidsen. - Tillad hjertet til reperfundere i 30 minutter, og i denne periode tage koronare flowmålinger som nødvendigt. Mål koronar flow ved opsamling af spildevand med en gradueret cylinder til 30-60 sek.
7. Indsamling af Tissue
- Punktere ballonen og fjerne den fra den venstre ventrikel. Tag hjertet offkanyle og vejes. I indledende forsøg, skal mindst én tværgående skive af hjertet skal træffes, og TTC farves at evaluere nekrose at sikre, at hjertet er fri for nekrotisk skade.
- Saml hjerte skiver til mikroskopi studier, våd / tør vægte etc. Resten eller hele hjerte skal fryses hurtigt ved at placere ind i flydende nitrogen. Opbevar frosne hjerter i en -80 ºC fryser.
BEMÆRK: Til måling af høje energipriser fosfat forbindelser (dvs. ATP, kreatin fosfat), hjerter skal indefryses straks.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser typiske resultater fra en mus eksperiment. LVP (rød linje), blev dP / dt (grøn linje), og temperatur (lilla linje) continusouly optaget over ~ 3 timer. Bogstaver angiver en - baseline måling, b, c, d, e - levering af kardioplegi løsning, f - start på reperfusion, g, h, i, j - måling af cornary flow under reperfusion. Bemærk, deprimeret LVDP og dP / dt ved reperfusion sammenlignet med baseline. Figur 1B omfatter data fra en optaget over ~ 2 sek. Bemærk, faldet i LVP og dP / dt svarende til A, mindre reduktioner i HR og mindre stigninger i LVEDP. Normalt efter 30 minutters reperfusion er der en ~ 40% fald i hjertefunktion som det fremgår af den venstre ventrikel udviklede tryk LVDP afbildet i figur 1C.
Figur 1. Repræsentativ resultats af en hel eksperiment. (A) optagelse venstre ventrikel tryk (øverst), første afledte af LV-tryk og temperatur. (B) kort interval optagelser for at se spor detaljer og (C) Kvantificering af venstre ventrikel udviklede tryk (LVDP) til flere eksperimenter (n = 6). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De foregående protokol detaljer metoder til at evaluere myokardielammelse sekundært til global iskæmi forbundet med cardioplegisk anholdelse. I vore hænder denne protokol giver en omtrentlig ~ reduktion i hjertefunktion 40% (LVDP, +/- dP / dt) med minimale ændringer i hjertefrekvensen på 30 minutter efter reperfusion tidspunkt. Som hjertet er reperfusionerede og rewarmed alle parametre for hjertefunktion reduceres ved initiale tidspunkter med et stærkt reduceret hjertefrekvens før stabilisering mellem 20 og 30 minutter. Koronar flow er generelt stærkt forøget i løbet af tidlig reperfusion grund hyperæmi, og derefter falder til ~ 20-30% mindre end kontrolniveauer efter 30 min reperfusion.
Det er vigtigt at huske, at myokardielammelse per definition skal forlade hjertet fri for celledød og nekrose som er karakteristisk for ren iskæmi / MI modeller (dvs.> 20 min ingen strømning regional iskæmi). Indledende undersøgelser bør evaluere væv Histolgien at sikre en mangel på nekrotisk skade. Hertil kommer, selv om myokardielammelse per definition bør resultere i normal funktion efter langvarig reperfusion (time til dage), er det sandsynligt, denne protokol vil ikke demonstrere fuldt tilbagebetalt funktion på grund af den ex vivo Langendorff perfusion som er forbundet med reductons i hjertefunktion i kontrol perfusionerede hjerter over tid. Alligevel ændringer i den akutte genvinding af hjertefunktionen i fravær af celledød / nekrose kan anvendes som indekser for sværhedsgraden af bedøvelse Den største forskel i denne protokol vs. klassiske no-flow iskæmi protokoller er anvendelsen af en kardiobeskyttelse strategi, i dette tilfælde bliver hyperkalemic kardioplegi. Hyperkalemic kardioplegi løsninger giver beskyttelse mod nekrotisk skade og celledød ved at forårsage diastolisk hjertestop. Diastoliske anholdelse af hjertet fremmer bevarelse af energireserver. Desuden mest klinisk anvendte hjertebeskyttelsesassays protokoller anvender hypotermi til yderligere limit myocardial skade ved at reducere metabolisk behov. Andre faktorer, der kan moduleres under ovennævnte protokol omfatter forskellige formuleringer af kardioplegi løsninger (hyperpolarisering formuleringer, Mg ++, K + niveauer, etc.), strategier (varm vs. kold, "hot shot", etc.), og forskellige lægemidler (kinase hæmmere, ion-kanal modulatorer, hjertebeskyttende agenter etc.).
Da hjertet er i en relativt godt beskyttet tilstand, for at få reproducerbare funktionsnedsættelser i denne model kræver nødvendigvis længere iskæmi gange (dvs. større end 2 timer). Vi har fundet, at gnavere hjerter er relativt resistente over for skade i denne model, især sammenlignet med større dyr (svin, mennesker), som pålideligt udviser lammet myocardium i meget kortere perioder (dvs. 30 min). Vi har også fundet, at intermitterende levering er nødvendig for at beskytte hjertet mod alvorlig iskæmisk skade som 45-60 min interval følgenfløj CP levering kan resultere i grov diastolisk dysfunktion, iskæmisk kontraktur, og vævsskade ved reperfusion. Andre let fleksible komponenter af protokol kan omfatte undersøgelser relateret til CP vælgere og den rolle, hypo / normotermisk anholdelse samt forskellige anholdelse strategier ikke afhængige af K + (Na-kanal blokkere, hyperpolarisering midler) 3.
Der er også en række vigtige begrænsninger for denne teknik, når der anvendes til at modellere bedøvelse associeret med klinisk hjertekirurgi. Først brutto størstedelen af kliniske CP løsninger blandet med blod (~ 4 blod: 1 CP-forhold). Dette er normalt ikke muligt i mus på grund af perfusion kredsløb volumen samt behovet for behandlede slanger og fiber oxygenater. Ofte for større dyr (marsvin / kaniner) donordyr vil også være påkrævet. Hertil kommer, som i alle blokerede organsystemer modeller, påvirkning af perifere faktorer (dvs. inflammatoriske signaler, blod reperfusion, etc.) er fuldstændig ignoreret. Ikke desto mindre er en praktisk, effektiv og økonomisk model for forundersøgelser at afprøve farmakologiske tilsætningsstoffer og forskellige hjertebeskyttelsesassays strategier.
Protokollen er i det væsentlige den samme i rottehjerter, med undtagelse af en større ballon og aorta kanyle 13,14. Derudover rottehjerte præparatet kræver betydeligt større strømningshastigheder (12-20 ml / min). På grund af sin størrelse, rotte hjerte forberedelse er betydeligt lettere at lære og reproducerbart udføre. For at vurdere andre typer af skader resulterer i myokardielammelse protokollen kan let ændres. At efterligne reversibel iskæmisk skade, simpelthen stoppe perfusion pumpe i korte perioder. I rotter ~ 20 min global iskæmi vil resultere i nedsat kontraktil funktion uden grove virkninger på celledød og infarkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cardioplegia Solution (St Thomas II) | Symbol / Concentrations (mM) | ||
| Sodium Chloride | NaCl; 110 | ||
| Potassium chloride | KCl; 16 | ||
| Calcium Chloride | CaCL2; 1.5 | ||
| Magnesium Chloride | MgCL2; 16 | ||
| Sodium Bicarbonate | NaHCO3; 10 | ||
| Krebs-Heinslet Buffer | |||
| Sodium Chloride | NaCl; 118 | ||
| Potassium Chloride | KCl; 4.8 | ||
| Magnesium Sulfate | MgSO4; 1.7 | ||
| Sodium Bicarbonate | NaHCO3; 24.9 | ||
| Potassium Phosphate (monobasic) | KH2PO4; 1.2 | ||
| Calcium Chloride | CaCL2; 1.4 | ||
| Sodium Pyruvate | Na pyruvate; 2 | ||
| Glucose | C6H12O6; 6 | ||
| Balloon reagents | |||
| Corn Syrup | |||
| Spaghetti | |||
| Silicon Dispersion Gel | |||
| styrofoam block | |||
| lab oven/incubator ( 50C) | |||
| Langendorff Perfusion equipment | |||
| Isolated perfused heart sytem (IH-SR (Hugo-Sachs) or equivalent) | |||
| Data acquisition system (DSI, ADinstruments or equivalent) | |||
| Heated water circulator | |||
| Cooling water circulator | |||
| Perfusion pump capable of 2-30 ml/min | |||
| Inline perfusion filters - 1 um glass fiber | |||
| Pressure sensors and amplifiers for LVP and perfusion pressure | |||
| Small graduated cylinder (~10 mL) | |||
| Small temperature probe and thermometer (Werner or equivalent) | |||
| perfusion resevoir (1L) | |||
| cardioplegia resevoir (~200 mL) | |||
| gas bubbler | |||
| 95/5 O2/CO2 mix | |||
| Surgical tools and reagents | |||
| Metzenbaum and Potz surgical scissors | |||
| two Dumont size 5 forceps | |||
| ketamine | |||
| xylazine | |||
| heparin | |||
| small clamp with soft sides to hold aorta (i.e. terminal clamp with taped ends) | |||
| Silk 2-0 and 4-0 sutures |
References
- Kloner, R. a, Jennings, R. B. Consequences of Brief Ischemia: Stunning, Preconditioning, and Their Clinical Implications: Part 1. Circulation. 104 (24), 2981-2989 (2001).
- Mentzer, R. M.
- Chambers, D. J., Fallouh, H. B. Cardioplegia and cardiac surgery: pharmacological arrest and cardioprotection during global ischemia and reperfusion. Pharmacol Ther. 127 (1), 41-52 (2010).
- Bolli, R., Marbán, E. Molecular and cellular mechanisms of myocardial stunning. Physiol Rev. 79 (2), 609-634 (1999).
- Kloner, R. a, Bolli, R., Marban, E., Reinlib, L., Braunwald, E. Medical and Cellular Implications of Stunning, Hibernation, and Preconditioning An NHLBI Workshop. Circulation. 97 (18), 1848-1867 (1998).
- Mersmann, J., Latsch, K., Habeck, K., Zacharowski, K. Measure for measure-determination of infarct size in murine models of myocardial ischemia and reperfusion: a systematic review. Shock (Augusta, Ga). 35 (5), 449-455 (2011).
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion). J Mol Cell Cardiol. 50 (6), 940-950 (2011).
- Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium. J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Sutherland, F. J., Shattock, M. J., Baker, K. E., Hearse, D. J. Mouse isolated perfused heart characteristics and cautions. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30 (11), 867-878 (2003).
- Guide for the Care and Use of Laboratory AnimalsSource. , National Research Council. Available from: http://grants.nih.gov/grants/olaw/Guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf (2011).
- Miller, A., Wright, G. L. Fabrication of Murine Ventricular Balloons for the Langendorff Heart Preparation. J Biotecnol Biomater. 1 (101), 1-4 (2011).
- Curtis, M. J. Characterisation, utilisation and clinical relevance of isolated perfused heart models of ischaemia-induced ventricular fibrillation. Cardiovasc Res. 39 (1), 194-215 (1998).
- Clements, R. T., Feng, J., Cordeiro, B., Bianchi, C., Sellke, F. W. p38 MAPK-dependent small HSP27 and αB-crystallin phosphorylation in regulation of myocardial function following cardioplegic arrest. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 300 (5), H1669-H1677 (2011).
- Clements, R. T., Cordeiro, B., Feng, J., Bianchi, C., Sellke, F. W. Rottlerin increases cardiac contractile performance and coronary perfusion through BKCa++ channel activation after cold cardioplegic arrest in isolated hearts. Circulation. 124 (11 Suppl), S55-S61 (2011).
