Цель этого методы работы является описать использование микрофлюидном системы для развития биопленок многовидовых, которые содержат виды, как правило, выявленных в человеческой наддесневого зубного налета. Методы описания биопленки архитектуры, биопленки жизнеспособность, и подход к уборочной биопленки для культурно-зависимой или культурно-независимые анализы будут выделены.
Есть несколько высокой пропускной в пробирке систем, которые способствуют развитию биопленки многовидовых, которые содержат многочисленные виды обычно обнаруженные в в естественных условиях устных биопленок. Кроме того, система, которая использует природный человеческой слюны в качестве питательной источника, вместо искусственных средах, особенно желательно, чтобы поддержать экспрессию клеточных и биопленки конкретных свойств, которые имитируют в естественных сообществ. Мы опишем метод для развития многопрофильных видов устных биопленок, которые сопоставимы по отношению к видовому составу, в наддесневые зубной налет, в условиях, аналогичных полости рта человека. В частности, это методы статья будет описывать, как в продаже Микрожидкостных система может быть адаптирована для облегчения разработки многовидовых устных биопленок, полученных из и вырос в объединенной слюны. Кроме того, описание того, как система может быть использована в сочетании с confocaл лазерный сканирующий микроскоп для получения 3-D биопленки реконструкции для архитектурных и жизнеспособности анализа будут представлены. Учитывая широкое разнообразие микроорганизмов, которые растут в пределах биопленки в микрожидкостных системы (в том числе стрептококков, Neisseria, Veillonella, Gemella и Porphyromonas), протокол также будут представлены описания того, как собрать биопленки клеток для дальнейшего субкультуры или экстракции ДНК и анализа. Пределы как микрожидкостных системы биопленки и текущее состояние в самых современных анализов данных будут устранены. В конечном счете, предполагается, что эта статья даст базовый метод, который позволит улучшить изучение устных биопленок и помочь в разработке дополнительных технологий, которые могут быть интегрированы с микрожидкостных платформы.
Биопленки архитектурно сложные сообщества бактерий, которые агрегируются на поверхности 1. Эти общины, как правило, содержат многочисленные виды, которые взаимодействуют друг с другом в рамках биопленки 2. Устные биопленки, наиболее визуально заметным является зубной налет, являются постоянной проблемой в людях и их бесконтрольное результаты развития в поколение таксономически различных общин многовидовых 3. Компонент бактерии этих различных групп может быть до 1000 раз более устойчивы к противомикробным препаратам, чем их свободно плавающих (планктонных) экземплярах 4-6. Отказ от лечения эти устные биопленки сообщества, которые могут вызвать кариес и пародонтоз, привело к значительному бремени государственного медицинского: более 500 миллионов посещений в офисе дантиста годовых в США, и примерно 108 000 000 000 $ для лечения или профилактики пародонта болезни и кариес 7.
Содержание ">" В то время как многие микробиологи выступают изучения микробного поведения в естественных условиях, лишь немногие из них сделать. Это потому, что их боевой дух для преодоления трудностей постоянно подрывается в привлекательной простоты работы с лабораторными культурами ». -Smith 8.В настоящее время, оральный исследования биопленки проводится с использованием различных, в естественных условиях и в пробирке подходов, каждый со своими преимуществами и недостатками 9,10. В пробирке подходы часто используют модельные системы биопленки, которые являются относительно легко создать, но может не хватать клинические / в реальном мире актуальность 10,11. В естественных условиях подходы, как правило, полагаются на животных моделях, которые могут воспроизводить определенные аспекты среды полости рта человека, но опять же страдают от ограничений в связи с различиями в анатомии, физиологии, микробиологии и иммунологии между людьми и животными 12, 13. Следует отметить, что оральные биопленкитакже могут быть разработаны на поверхности эмали, проводимых в стента в устьях добровольцах, но этот подход в настоящее время относительно дорогостоящим и трудоемким 14,15. В конечном счете, новые препараты или технологии, чтобы улучшить полостью рта являются испытания на людях в контролируемых клинических условиях судебного разбирательства 11. В настоящее время часто используются методы работы по выявлению и оценке новых пероральных препаратов Здравоохранение сначала выполнить лабораторные исследования, чтобы выявить потенциальную эффективность, а затем выполните исследований на животных и "полевые испытания", которые используют врачам оценить успешность технологии 9, 16,17. К сожалению, лабораторные исследования, как правило, зависят от модельных систем, которые занимают большой след, технологически сложным в использовании, и часто содержат упрощена сообщества один или самое большее несколько видов, чтобы получить потенциальную реального мира означает 10,18. Учитывая, что зубной налет биопленки содержать несколько видов и формы в комплэкс течет слюны среду, развитие биопленки, которые содержат один или несколько видов в искусственных средах вряд ли генерировать общин, которые ведут себя подобным образом, как и в реальной ситуации 10,19. Для решения время, стоимость, требования к профессиональной подготовке, а бедные представительный характер лаборатория модельных систем биопленки по сравнению с реальной среде, мы недавно разработали высокую пропускную способность и экологически уместны систему биопленки 20 (рисунок 1). Система выгоды от использования бесклеточной объединенной человеческой слюны (КПБ) как средний и лечить объединяются человек бактериальная клетка, содержащие слюны (CCS) в качестве посевного материала. Уникально, система также объединяет микрофлюидальный технологии, конфокальной лазерной сканирующей микроскопии и культуры независимой технологии анализа бактериальной разнообразия. Таким образом, модель системы является экологически уместны (с помощью слюны, как посевной расти биопленки Многовидовые на 37 ° С в фильтр-стерилизовать течетслюна) и устные биопленки содержат виды (включая Streptococcus, Neisseria, Veillonella и видов Porphyromonas) в численности, представитель те, что в начале наддесневого налета 20.
Если учесть, что эта работа описывает использование недавно разработанной модельной системы, особое внимание должно быть уделено объединения конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) микрофлюидики и технологий анализа разнообразие культурно-независимыми. Объединение этих технологий нашей исследовательской группы было преднамеренным, а не только добавляет возможность с высокой пропускной во вновь разработанной модельной системы, но также позволяет задаваемых вопросов, которые не могут быть легко решены до с другими системами. Во-первых, CLSM имеет явные преимущества по сравнению с традиционными микроскопии, так как позволяет для трехмерного анализа биопленок. Часто недооценивают, это очень важно, так как биопленки являются гетерогенными остроумиеч относительно видового состава и пространственного положения, а также физиологические условия быть введены в различных пространственных местах в пределах биопленки 6,21. В концерте с трехмерной программного обеспечения визуализации и программного обеспечения для анализа изображений, архитектуры биопленки, пространственных отношений между составляющих его видов и степени антибактериальной убийства могут быть проанализированы 22-24. Такие способности невозможно с использованием стандартного проходящего света или эпифлуоресцентной микроскопии. Далее, микрофлюидики собрал особое внимание в области микробиологии, так как позволяет изучение биопленок в тщательно контролируемых условиях (расход, температура, рН и т.д.) и требует только небольших объемов жидкости 25-27. В качестве отправной точки для сравнения, рост устный биопленки в слюне человека в рамках модели проточной ячейки системы (система, которая, возможно, считается основой образцом для многих оральных исследований биопленки) в течение 20 ч при аналогичной скорости потока и сдвига, как достичьв микрожидкостных системы требует, по крайней мере, 200 мл, в противоположность 800 мкл в микрожидкостных устройств 28-31. Таким образом, Микрожидкостных модель системы биопленки позволяет исследовать количество ограниченных материала при определенных условиях. Наконец, пиросеквенирования технология была оптимизирована в последнее десятилетие требуют лишь небольшое количество материала для выполнения анализа сообщество и достаточно универсален, чтобы контролировать глубину последовательности, чтобы получить идентичность даже редких видов биопленки. Использование этой технологии, такие как бактериальный тегом в кодировке FLX ампликон пиросеквенирования (bTEFAP), позволило актуальных вопросов, касающихся экологии биопленок решать 32,33. Такие вопросы проникнуты трудности в прошлом, когда пиросеквенирования не были доступны из-за времени и затрат, необходимых для создания плазмиды библиотеки и сложные технологические и аналитические шаги, необходимые для получения данных 33,34. Конечно, большое преимущество с культурно-независимый APжается, такие как Пиросеквенирование, является то, что виды бактерий, которые не могут быть выращены в изоляции в обычных лабораторных средах (т.е. жизнеспособные, но не культивируемой видов) могут быть выращены и определены в модельной системе, и их относительное содержание в сообществе количественно 35, 36 , Чтобы добавить перспективу, а уже в 1963 году, в конце Зигмунд Socransky, что приблизительно 50% бактерий в материале, выделенных из полости рта человека десны щель не может быть культивировать, используя условия роста лаборатория 37.
Цель этого методы работы является описать подход для разработки устные биопленки Многовидовые в коммерчески доступных микрожидкостных (Bioflux) системы: (I) условий представителя полости рта человека и (II) с видового состава и численности, что сравнима с наддесневого налета. Кроме того, как с помощью бесплатных и коммерческих программ мы выделяем как основной биопленкиархитектура меры могут быть получены из данных CLSM, с акцентом на подходы к количественной оценке биопленки биомассы, шероховатости и жизнеспособность (на основе Live / Dead окрашивания). Наконец, шаги, необходимые для сбора биопленки материал для анализа разнообразии bTEFAP описаны.
Это методы документе освещаются основные шаги, необходимые для установки и запуска микрофлюидальный систему таким образом, чтобы обеспечить развитие устного биопленки многовидовых, полученных из пула человеческой слюны и выращенных в фильтр-стерилизовать 25% объединенной человеческ…
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарят Уильям ОБСЛУЖИВАНИЕ (Университет Мичигана) за помощью в разработке протоколов роста биопленки и Джон Баттиста (Прибоя, Сан-Франциско, Калифорния) за советом по поводу технологических вопросов, связанных с системой Bioflux. Эта работа была поддержана Национальным институтом здоровья (NIH: R21DE018820 в AHR) и Мичиганского университета первоначальных средств на AHR
SUPPLIES AND EQUIPMENT | AVAILABLE FROM COMPANY | CATALOG NUMBER |
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 |
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49D |
Dithiothreitol (White Crystals or Powder/Electrophoresis), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP172-5 |
Sorval ultracentrifuge (SS-34 compatible) | Thermoscientific | Unit-dependent |
Thermo Scientific SS-34 Rotor | Thermoscientific | 28-020 |
Thermo Scientific Type 1 Reagent Grade Deionized Water | Thermo Scientific Inc | 23-290-065 |
Nalgene Rapid-Flow Filter Units and Bottle Top Filters, PES Membrane, Sterile. | VWR | 73520-986 |
Glycerol | Thermo Fisher Scientific Inc | NC0542269 |
BioFlux microfluidic system | Fluxion | Bioflux 200 system |
Bioflux 24-channel plate | Fluxion | 910-0004 |
PBS (Gibco) | Thermo Fisher Scientific Inc | 10010023 |
LIVE/DEAD stain (Invitrogen) | Invitrogen | L7012 |
Confocal Laser Scanning Microscope | Lecia | SPE or eqivalent system |
Epifluorescence Microscope | Multiple choices | Multiple choices |
Pyrosequencing facilities | Multiple choices | Multiple choices |
Decon SaniHol 70 Ethanol Solution | Fisher Scientific | 04-355-122 |
Ultra Low Temperature Freezer -80°C | Multiple choices | Multiple choices |
Tips (20, 200, and 1000uL) | Multiple choices | Multiple choices |
Single Channel Variable Volume Pipettors (20, 200, 1000uL) | Multiple choices | Multiple choices |
SOFTWARE | ||
Bioflux dedicated software | Bioflux | |
Imaris | Bitplane | |
Leica SPE | Leica | |
ImageJ | Freeware (http://imagej.nih.gov/ij/) | |
COMSTAT/COMSTAT 2 | Freeware (http://www.comstat.dk/) |