Protocol
Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud (NIH) Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el animal de Atención Institucional y el empleo Comisión de la Universidad de Yale (IACUC).
Preparativos 1) Pre-quirúrgicos
- Preparación de la solución oral
- Crear soluciones de 10% de sacarosa y 0,005% de L-mentol en agua desionizada (pH 7,4). Guarde estas soluciones en envases cerrados, a temperatura ambiente, y rehacer cada 2 semanas, para evitar la degradación.
- Soluciones de calibración del electrodo
- Hacer tampón Tris (pH 7,4) en cualquier momento antes de la calibración. La solución consiste en 12,0 mM Tris-HCl, NaCl 140 mM, 3,25 mM KCl, 1,20 mM de CaCl2, 1,25 mM NaH2PO4, 1,20 mM de MgCl 2, y 2,00 mM Na 2 SO 4.
- Crear una solución madre de 10 mM de dopamina (DA; clorhidrato de dopamina) en ácido perclórico 0,1 M. El ácido perclórico ayuda a prevenir la oxidación de la dopaminae. Guarde esta solución madre a -20 ° C y utilizar durante un máximo de 6 meses. Haga varias alícuotas de la solución madre DA para el almacenamiento de usar cada alícuota sólo una vez.
- De la población de 10 mM DA, soluciones diluidas en tampón Tris a concentraciones de 1 M, 500 nM, 250 nM, 125 nM, 62,5 nM, y 31,25 nM.
- Para la calibración de pH, se preparan soluciones de tampón Tris con el pH de 7,2, 7,3, 7,5, y 7,6. Esto proporcionará soluciones que imitan los cambios de pH que pueden ocurrir durante el experimento in vivo.
- La fabricación de electrodos
- Por succión al vacío, aspirar una fibra de carbono T-650 (7 m de diámetro) en un capilar de vidrio de borosilicato (longitud 10 mm, de diámetro exterior de 0,6 mm, 0,4 mm de diámetro interior).
- Coloque capilar de vidrio lleno de fibra de carbono en un extractor de electrodos vertical. Para los parámetros iniciales, establezca el calentador a 55,0 y apague el imán. Sin embargo, una optimización adicional puede ser necesario ya que tanto el calentador y los ajustes magnéticos varían frlaboratorio om al laboratorio.
Nota: El electrodo debe ser al menos 5,5 cm de largo (incluyendo conicidad) de manera que puede encajar fácilmente en el micromanipulador y ser insertado al menos 6,9 mm por debajo de la duramadre en el cerebro de rata. Si el electrodo es demasiado corto, las grabaciones de la porción ventral del núcleo accumbens no serán alcanzables. Por otro lado, la longitud total del electrodo no debe exceder de 6,5 cm de lo contrario será demasiado largo para encajar en el micromanipulador. - El uso de un microscopio de luz, cortar la fibra de carbono expuesta de modo que se extiende 75-100 micras más allá del final de la copa. Verificar que el electrodo tiene un muy estrecho, apenas discernible, sello entre el electrodo de vidrio y fibra de carbono, que producirá un mínimo de ruido durante la grabación posterior. Deseche el electrodo si hay grietas visibles en el vidrio o si el sello está floja, lo cual es indicativo de un sello pobre. Para obtener instrucciones más detalladas, consulte [12] y [13].
- Montaje del electrodo en el micrófonoromanipulator
- Obtener un 3 en, alambre 30G que está aislado a lo largo de la mitad de la longitud del alambre y utilizar un pequeño cepillo para aplicar una fina capa de pintura de plata directamente al cable. Inmediatamente después de aplicar la pintura de plata, insertar el cable en el orificio en la parte superior del electrodo para proporcionar una conexión física y eléctrica a la fibra de carbono. Bajo el microscopio, asegúrese de que el hilo de plata entra en contacto con la fibra de carbono.
- Asegure el alambre de plata y el electrodo a la micromanipulador usando encogimiento del calor.
- Coloque el electrodo de fibra de carbono preparado en alcohol isopropílico purificado (IPA) durante al menos 10 min para limpiar la superficie del electrodo y para aumentar la posterior sensibilidad a la dopamina. Después de remojar en IPA, enjuagar la fibra de carbono con el agua del grifo para eliminar el IPA.
- Referencia fabricación de electrodos
- Tome un alambre de 13 mm de plata que contiene una malla de aproximadamente 6 mm de Ag / Ag Cl (alambre de plata 7 mm solos, malla de 6 mm, 0.4 mm de diámetro),cortar la parte de plata hasta aproximadamente la mitad de su longitud original y soldar la porción de plata del alambre a un alfiler de oro.
- Aplicar epoxi sobre la soldadura en el pasador.
- Sumergir el Ag / Ag Cl malla extremo en un copolímero de 5% politetrafluoroetileno y perfluoro-3,6-dioxa-4-metil-7octene-sulfónico ácido 5 veces, con periodos de secado al aire 30 min entre cada inmersión.
- Deje que el recubierto de Ag / Ag Cl malla se seque al aire O / N.
- Curar en el horno a 120 ºC durante 1 hora.
2) Cirugía Combinada intraoral y Cirugía intracraneal Canulación (aproximadamente 75 min)
- Fabricación Oral catéter
- Hacer que el catéter oral, y esterilizar por esterilización con óxido de etileno, al menos 10 días antes de la cirugía.
- Cortar PE 100 tubo en 6 cm segmentos largos.
- El uso de un soldador, fundir un extremo de la tubería de PE e inmediatamente presionar contra una superficie sólida para enfriar el tubo de PE. El resultado debe crearun disco pequeño, plano en un extremo de la tubería de PE y no debe ser embridado. Use una aguja (18 G) o contacto del empuje para crear un agujero en el centro de este disco.
- En el otro extremo de la tubería de PE, perfectamente insertar el extremo romo de una aguja G 18 en el tubo.
- Usando una perforadora de papel estándar, perforar varias piezas circulares de una hoja de politetrafluoroetileno (3,18 mm de espesor, 6 mm de diámetro) para crear arandelas politetrafluoroetileno.
- Crear un agujero en el centro de la lavadora. Tome la aguja unida a la tubería de PE y empujarla completamente a través de la lavadora. Una vez que la aguja es a través de, deslice la lavadora a la parte inferior de la tubería de PE de modo que quede al ras contra la arandela.
- Cirugía Oral
- Después de la esterilización de la herramientas quirúrgicas, cánula (recortado a 2,5 mm por debajo del pedestal antes de la esterilización), y el electrodo de referencia, anestesiar la rata con una inyección intraperitoneal de ketamina (100 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg).
- After 5 min, se aplica una prueba de estímulo nocivo (pie o pellizcar la cola) para evaluar el nivel de la anestesia. Si el sujeto muestra ninguna reacción física a la prueba de estímulo nocivo (estremecerse respuesta, aumento en la frecuencia respiratoria o del corazón), administrar un impulso ketamina de 10% a 15% de la dosis original y repetir el protocolo de estímulo nocivo anteriormente.
- Después de la rata es totalmente anestesiado y no muestra ninguna reacción a la prueba de estímulo nocivo, utilice cortar el pelo de animales para afeitar la piel de la rata de los ojos de unos 2 mm detrás de las orejas. A continuación, coloque la rata en una recirculación de agua almohadilla eléctrica delgada para mantener la temperatura corporal durante la cirugía. Aplicar lubricante ocular. Administrar el fármaco no esteroide anti-inflamatorio (NSAID), carprofeno (5 mg / kg), por inyección intraperitoneal antes de realizar ninguna incisión y antes de la inserción de cánulas intraorales. Utilice una técnica aséptica en todo momento.
- Aplicar betadine seguido por etanol al 70% para limpiar la piel. Repita 3 veces.
- Place la rata en su parte posterior, y abra la boca con un hisopo de algodón estéril. Encuentra el primer molar superior.
- Inserte la aguja en el tejido entre la mejilla y el primer molar superior hasta que la aguja sale justo detrás y medial a los oídos.
- Pierce la aguja a través de la piel hasta que el tubo PE sale de la piel y es accesible.
- Tire hacia arriba de la cánula (agarre por la propia cánula y no la aguja) y asegure la arandela politetrafluoroetileno en los molares para que el catéter permanece en su lugar.
Nota: Cortar la lavadora en una forma trapezoidal y asegurar contra los molares con el lado plano hacia la mejilla hace que este paso sea más fácil. - Tome otra arandela de politetrafluoroetileno y deslícela sobre la aguja expuesta, abajo el tubo de plástico, y se apoyan contra la incisión.
- Para asegurar la arandela de politetrafluoroetileno, utilice cinta esterilizada para crear una "bandera" triangular de manera que la lavadora no se desliza hacia arriba. Asegure el lavadoer contra la piel de la rata y la cinta esterilizada.
- Cortar el catéter expuesto para permitir 2-4 cm de tubo que se expone sobre la cabeza de la rata.
- Repita los pasos 2.2.1 a 2.2.10 para el otro lado de la boca.
- Después de la esterilización de la herramientas quirúrgicas, cánula (recortado a 2,5 mm por debajo del pedestal antes de la esterilización), y el electrodo de referencia, anestesiar la rata con una inyección intraperitoneal de ketamina (100 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg).
- Cirugía intracraneal por voltamperometría
- Coloque la rata en el marco estereotáxico y limpiar el cuero cabelludo del animal usando un exfoliante dos etapas (un exfoliante betadine seguido por un lavado de etanol al 70%, lleve a cabo con una repetición 3 ciclo).
- Utilice unas pinzas esterilizadas de punta fina y tijeras quirúrgicas para cortar una sección de 15 x 15 mm de tejido del cuero cabelludo.
- Limpie suavemente la superficie del cráneo usando aplicadores con punta de algodón esterilizados. Además limpiar el cráneo mediante la aplicación de 2 a 3 gotas de peróxido de hidrógeno al 3%.
- Use un taladro estereotáxica para hacer 3 pequeños (1 mm de diámetro) agujeros en el cráneo para la posterior inserción de tornillos, 1 orificio para la cánula guía, 1 orificio para el electrodo de estimulación y 1 orificio para los elegidos de referenciamontó.
- Para grabaciones en el núcleo NAC, coloque la cánula guía en 1,2 mm anterior y 1,4 mm lateral al bregma. Baje el aparato cánula hasta que la base de plástico esté al nivel del cráneo.
- Coloque el electrodo de referencia esterilizada en el hemisferio contralateral a la cánula guía. Baje la referencia aproximadamente 2 mm por debajo de la duramadre.
- Coloque el electrodo de estimulación en 5,2 mm posterior y 1,0 mm lateral al bregma y bajado 8,0 mm por debajo de la duramadre para dirigir el área tegmental ventral (VTA).
- Use un destornillador pequeño quirúrgico esterilizado para asegurar los tornillos en el cráneo. Luego, inserte el electrodo de referencia, estimulando el electrodo, y guiar la cánula. Por último, asegurar que todos los componentes utilizando cemento Cranioplastic.
- Durante las primeras 48 horas de cuidado post-operatorio, para administrar el fármaco no esteroide anti-inflamatorio (NSAID) Carprofeno por inyección subcutánea (5 mg / kg). Deje por lo menos 1 semana para la recuperación quirúrgica completa antes de realizar voltamgrabación metría.
- Durante la atención post-operatoria, catéteres orales ras diaria con agua. Proporcionar alimentos saturado en agua durante 2 días para ayudar al animal en la masticación y de comer. Proporcionar un seguimiento diario en busca de signos de estrés potenciales de dolor (debido a la infección leve o deshidratación) y proporcionar intervenciones apropiadas según sea necesario (incluida la administración de fluidos, la administración tópica de antisépticos, o la administración de AINE y carprofeno a 5 mg / kg).
3) Voltamperometría Grabaciones en Despierta, Rata con libertad de movimientos
- Bajar el electrodo y la adquisición de un conjunto de entrenamiento DA.
- En el día del experimento, comprobar la permeabilidad de la cánula por vía oral mediante la infusión de 200 l de agua y observar las respuestas orofaciales (para verificar que la rata está probando el agua).
- Conecte el cabezal de la platina FSCV a la rata mediante la inserción del electrodo de estimulación (en el cabezal de la platina) en el electrodo de estimulación bipolar cannula (en la rata). Por lo tanto, el cabezal de la platina (miniaturizado convertidor de corriente a voltaje) se conecta directamente al electrodo bipolar estimulante.
- Retire la cánula maniquí desde el aparato de cánula y aplicar dos gotas de solución de heparina 50% en la cánula. A continuación, inserte suavemente una cánula ficticia (ligeramente más largo que la cánula ficticia que se ha eliminado previamente) para borrar cualquier coágulo de sangre o cicatrización glial que pueda haber ocurrido, que rompa electrodos de fibra de carbono que se insertarán posteriormente durante el experimento. Extender la cánula utilizada para despejar los coágulos de 3-4 mm por debajo del cráneo (al menos 2 mm por encima del sitio de la grabación).
- Inserte el micromanipulador, con electrodo, en la cánula guía y coloque el anillo de omega en una posición "cerrada".
- Conecte el cable de electrodo de referencia del cabezal de la platina al pin apropiado. A continuación, conecte el cable de electrodo de trabajo desde el micromanipulador para el cable apropiado en el cabezal de la platina.
- Baje las elecatropelló a aproximadamente 4-4,5 mm por debajo del cráneo.
- Utilice un potenciostato para aplicar una forma de onda triangular (400 V / s, -0,4 a 1,3 V). Aplicar la forma de onda al electrodo a 60 Hz por lo menos durante 10 minutos, a continuación, cambiar la frecuencia de aplicación de forma de onda de 10 Hz para las grabaciones experimentales posteriores.
Nota: La etapa de aplicación de forma de onda de 60 Hz produce una superficie de fibra de carbono estable y le ayudará a prevenir la deriva eléctrica - Aplicar la estimulación eléctrica a la VTA usando varias frecuencias (de 10 a 60 Hz) impulsos (10 a 30 pulsos) y las corrientes (50 a 150 mu), todas con un ancho de pulso de 2 ms / fase, para evocar diferentes concentraciones de pH y la liberación de DA turnos. Adquirir al menos 5 concentraciones diferentes de liberación de DA y 5 cambios de pH diferentes. Espere (2 - 3 minutos mínimo) entre estimulaciones para permitir la recarga vesicular [14].
Nota: Es importante obtener estímulos que producen concentraciones de DA en toda la gama que se recogerán durante el posteriorexperimento, ya que se utilizarán como un conjunto de entrenamiento para el Análisis de Componentes Principales (ver sección 5.1). - Baje el electrodo en el núcleo NAC (6,3 mm ventral a Durá). Posteriormente bajar el electrodo en incrementos de 100 micras dentro del núcleo NAc hasta que se observaron eventos transitorios liberación de DA en las frecuencias de al menos 1 por min.
- Conectar el tubo (diámetro interior de 1/32 ", diámetro exterior 3/32") a una jeringa de 20 ml, unido a una bomba de jeringa. En el otro extremo del tubo, utilizar una aguja 23 G biselado para conectar la tubería a la cánula de la rata. Asegúrese de que el tubo se llena completamente con el saborizante deseada y compruebe que no existen burbujas en el tubo.
Nota: Por lo general, administrar una pequeña cantidad de saborizante en la boca de la rata antes de grabar para asegurar que la primera infusión para la grabación entrega la cantidad completa de infusión y no cualquier agua residual o de aire en el tubo. Además, esto permite que el animal pueda tener algo de ingenio experiencia previah el saborizante ya nuevos estimulantes del gusto, incluso los apetitiva, puede ser aversivo inicialmente debido a su novedad. - Para la recolección de datos, infundir 200 l de saborizante (6,5 seg usando una bomba y tubos descrito anteriormente). Infundir el saborizante cada 1-3 min. Infundir un total de 25 veces por saborizante. Cada infusión entrega 200 l de solución.
- Si varios estimulantes del gusto se están entregando en un solo experimento, lave el catéter oral con agua después de la recolección de datos para un saborizante y espere al menos 20 minutos antes de la infusión de la nueva saborizante.
- Después de la sesión de grabación DA, prepararse para la verificación histológica mediante la creación de una pequeña lesión en el lugar de grabación. Para preservar el electrodo de fibra de carbono para la posterior calibración, primero retraer el electrodo y eliminar el micromanipulador. A continuación, utilice una nueva micromanipulador con un microelectrodo de vidrio y un alambre de tungsteno (que se extiende 100 m más allá de la punta de vidrio) a la misma profundidad (por debajo de la duramadre) como el f de carbono original,microelectrodos iber.
- Para la verificación histológica, crear una pequeña lesión mediante la aplicación de 3 V en el alambre de tungsteno y el aumento de la tensión en incrementos de 1 V, cada 10 seg, hasta que se alcanza el ajuste de 10 V.
- Si una curva de concentración estándar que ya ha sido creado usando múltiples electrodos de fibra de carbono, realice el paso por encima de la lesión (3.1.14) aplicando el potencial directamente el electrodo de fibra de carbono.
Nota: Este método lesión dañará la fibra de carbono y prevenir la posterior calibración con ese electrodo específico. - La eutanasia del animal usando una inyección letal de pentobarbital (150 mg / kg, ip).
- Desalojar el casquete con las cánulas con unos alicates tirando directamente hacia arriba en el casquete. No tuerza el casquete ya que esto puede causar daños innecesarios al cerebro y hacer que sea difícil de identificar la localización del electrodo durante la histología.
- Retire el cerebro y colocar en formalina al 4% durante 3 días seguidos en un 30% suCrose durante 1 semana. Crear 30 micras rodajas usando un criostato, montar en cubreobjetos y examinar rebanadas bajo un microscopio de luz para identificar la ubicación de la fibra de carbono o lesión de tungsteno.
Nota: La perfusión es opcional para 3.1.17.
- Retire el cerebro y colocar en formalina al 4% durante 3 días seguidos en un 30% suCrose durante 1 semana. Crear 30 micras rodajas usando un criostato, montar en cubreobjetos y examinar rebanadas bajo un microscopio de luz para identificar la ubicación de la fibra de carbono o lesión de tungsteno.
4) calibración del electrodo
- El uso de la celda de flujo para crear un factor de conversión de corriente de la concentración.
- Con el fin de determinar la sensibilidad del electrodo, calibrar los electrodos después de cada experimento utilizando un aparato de flujo "de células t". Bajar el electrodo en la "células T", mientras tampón Tris, soluciones de pH, o soluciones DA se lavan sobre la superficie del electrodo (a una velocidad de 2 ml / min). Use un actuador solenoide de aire de seis posiciones para alternar entre la memoria y el pH o solución DA.
- Para cada calibración, recoger datos voltamétricos durante 5 seg aplicación de tampón Tris (línea de base), seguido de 5 seg aplicación del pH o solución DA, seguido de 20 segundos de unplicación de tampón Tris (total del archivo 30 seg). Repita cada carrera 3 veces para cada concentración del patrón de calibración, de contrapeso entre las diferentes concentraciones de cada norma.
- Para cada toma de muestras, medir el pico DA o corriente pH-evocado. Un promedio de la corriente de pico a través de cada ensayo para obtener una concentración frente a la relación de corriente de pico. Para obtener instrucciones más detalladas, consulte [12] y [13].
5) Análisis de Datos
- El uso de un conjunto de entrenamiento en el análisis de componentes principales (PCA)
Nota: Durante un experimento de voltametría, la salida se produce como corriente, que es el resultado de la oxidación y la reducción de la dopamina, los cambios de pH, y el ruido electroquímico. PCA permite la separación de estos factores para que se pueda aislar los componentes deseados (DA y pH) y quitar componentes adicionales que podrían distorsionar las señales deseadas (para una descripción más detallada, véase 15, 16).- Asignar un factor de calibración a thactual e salida (aproximadamente 5.10 nA / M) después de PCA para permitir que los valores de concentración de los analitos a determinar.
- Utilice el conjunto de entrenamiento obtenida durante un experimento para "entrenar" el modelo PCA para separar a cabo DA, pH y otros factores. PCA toma el conjunto de entrenamiento voltamogramas cíclicos (recogidos en la sección 3.1.8) y determina qué características esenciales de la voltamograma pueden ser utilizados para identificar cada analito recogida durante grabaciones en vivo de voltametría.
- Para determinar el número de componentes principales para mantener, utilizar una prueba F Malinowski. Por lo general, mantener sólo 2 o 3 componentes principales que normalmente explican sobre 95-99% de la varianza en los datos. Para más discusión sobre la aplicación de la prueba F Malinowski, ver 17.
Nota: Una vez que se determina el número de componentes, el análisis PCA efectivamente proyectará los voltamogramas medidas a partir de DA y la formación pH establece en los principales componentes que han sido retenidas.El resultado es un conjunto de datos que ha sido filtrada de manera que sólo los datos de DA (o pH) se mantiene y se elimina los datos residuales que no se parece DA o pH (Ver representativos Resultados para salida esperada). Para una explicación más detallada y paso a paso las instrucciones para el uso de la ACP para el análisis voltamétrica ver hoja Materiales y 16, 17.
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Representative Results
FSCV combinada con la implantación del catéter intraoral se utilizó para examinar cómo sacarosa, un saborizante apetitiva, modula fásica la liberación de DA en el núcleo NAc. Antes de la infusión saborizante, la estimulación eléctrica (150 mu, 60 Hz, 24 pulsos, indicada por la barra roja) de la VTA produce aumentos sólidos en fásica liberación de DA en el NAc (Figura 1) Figura 1 muestra un gráfico de color con potencial sobre. el eje y, el tiempo en el eje x, y la corriente (representado como falso color) en el eje z. Por debajo de la trama de color es la concentración de DA frente rastro tiempo. Concentración en función del tiempo se determinó usando la traza corriente en función del tiempo en el potencial de oxidación de la dopamina (indicado por la línea discontinua blanco) que se convirtió en la concentración, la siguiente post-calibración del electrodo. Esta concentración DA frente rastro tiempo fue utilizado como parte de la formación establecida para PCA.
Después de que el conjunto de entrenamiento se adquirió, 25 infusiones de sacarosa(10%, 200 l por infusión) se les dio cada 1-3 min. Los ejemplos de modulación de la liberación de sacarosa fásica DA se muestran en las Figuras 2 y 3. En la Figura 2, la infusión de 6,5 seg (indicado por la barra roja) produce una elevación en la corriente (indicado por el blanco, flecha hacia abajo) en el potencial de oxidación de DA (indicado por la línea discontinua blanco). La transformación de los datos en una concentración frente al tiempo después de trama PCA se verifica que el aumento de la corriente en las respuestas a la saborizante es el resultado de un aumento en la concentración de DA. Otra saborizante, mentol (0,005%, 200 l por infusión) también se infundió durante las grabaciones FSCV en el núcleo NAC. La Figura 3 muestra la concentración de DA frente ejemplo tiempo traza para intraoral-sacarosa y mentol, revelando una mayor concentración de DA después de la infusión de cualquiera de saborizante . Hay que esperar a ver un poco de ensayo a la variabilidad del ensayo en la liberación fásica DA de estimulantes del gusto (Figura 2 y 3A). Sin embargo, no nos vemos normalmente cualquier tendencia no específicos hacia un aumento o disminución en fásica liberación de DA en múltiples ensayos. Rangos de 10-100 nM DA se puede esperar en un experimento típico en un solo animal.
Figura 1. Representante trama de color (arriba) y concentración frente al gráfico de tiempo (abajo) de eléctricamente evocado la liberación de DA en el núcleo NAC. Barra de color rojo indica tiempo de estimulación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Representante trama de color (parte superior) y la concentración de DA frente rastro tiempo (abajo) durante una sola infusión de sacarosa. Red bar indica 6,5 seg infusión. Blanca flecha hacia abajo indica en la elevación de la corriente (representada en falso color) en el potencial de oxidación del DA. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Concentración Representante DA frente rastros de tiempo durante (A) 10% de sacarosa y (B) 0,005% de mentol por vía intraoral. Barra roja indica 6,5 seg infusión intraoral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Entrega saborizante intraoral combinada con FSCV permite el análisis del "tiempo real" respuestas DA a saborizantes orales. Hay tres pasos críticos en el protocolo que se requieren para mediciones exitosas DA. En primer lugar, la implantación adecuada del catéter oral es crítico para la entrega de saborizantes. Asegurarse de que el catéter se inserta detrás de la primera molar y encajada en su lugar evita que el catéter de la pérdida de permeabilidad y evita la extracción accidental por el animal. Lavado del catéter durante los primeros días después de la recuperación es también importante, ya que la comida suave dado al animal durante los primeros 2 o 3 días después de la cirugía podría obstruir el catéter. En segundo lugar, la calidad del electrodo es crítico para la relación señal a ruido creciente en una rata que se mueve libremente. En algunos casos, los electrodos que aparecen visualmente sean de alta calidad y buen estado todavía puede dar señales ruidosas. Una forma de solucionar este problema es tomar las grabaciones de referencia en el dOrsal cuerpo estriado (4 mm por debajo de la duramadre). Si el electrodo produce demasiado ruido, el electrodo puede ser eliminado y reemplazado con un nuevo electrodo antes de realizar el experimento en el sitio de grabación núcleo NAc (6-7 mm por debajo de la duramadre). Un tercer paso crítico es encontrar un lugar de grabación adecuado en la región cerebral específica, donde se observan eventos de liberación de DA espontáneas ("transitorios") a una frecuencia suficiente (al menos 1 por minuto) con incrementos suficientes en la concentración de DA (al menos 20 nM a 40 nM). Esta optimización se asegurará de que los eventos de la liberación de DA fásica espontáneos pueden ser detectados en la ubicación específica, antes de la administración aromatizante. Bajando el electrodo en incrementos equivalentes al tamaño de la fibra de carbono expuesta (50-100 micras) maximiza las posibilidades de encontrar un sitio de grabación con transitorios detectables.
Una advertencia importante de FSCV es la incapacidad para determinar la concentración de analito absoluta en un punto en el tiempo, ya que es un FSCV DIFrencial técnica que mide los cambios de concentración relativas (en comparación con una línea de base estable) durante cada archivo de grabación voltametría. Sin embargo, la técnica diferencial también permite la cuantificación de las fluctuaciones de sub-segundo en la concentración de dopamina en respuesta a ambas estimulantes del gusto gratificantes y aversivos 5. En el contexto de la adicción a la nicotina, los aditivos de productos de tabaco, como el mentol y orales edulcorantes, se ha demostrado que influyen en la conducta de fumar 18 y han sido recientemente prohibido en los cigarrillos (a excepción de mentol) por la Familia fumadores Ley de Control del Tabaco y Prevención. Por lo tanto, la entrega intraoral en combinación con FSCV proporciona una importante herramienta metodológica que se puede utilizar para examinar cómo aromatizantes de productos de tabaco pueden alterar la señalización de DA, y potencialmente las propiedades reforzantes de la nicotina.
Aquí, hemos descrito el método de combinación de infusión saborizante intraoral con FSCV para el propósito de medir fásica DAliberar en respuesta a estímulos saborizante primarios. Es importante señalar que mientras que nuestra técnica permite el examen de la liberación de DA fásica a estimulantes del gusto independientes de la acción o de la elección, también es posible que la naturaleza inesperada de la entrega saborizante podría influir en la liberación de DA 19 fásica. Por lo tanto, una solución de control adecuado, tal como agua o saliva artificial, puede ser utilizado en experimentos de control para comparar y examinar los efectos de una recompensa inesperada o estímulo en fásica DA liberación independiente de la saborizante de interés. Sin embargo, la técnica no se limita a cualquiera de las mediciones de la liberación de DA o recompensa. Por ejemplo, el trabajo previo ha examinado la liberación de norepinefrina durante tanto recompensa y aversión al 20. Como los animales no lo hacen fácilmente consumen estimulantes del gusto aversivos infusión saborizante intraoral con FSCV es la única técnica disponible para la medición de la liberación fásica DA de estimulantes del gusto aversivos. Sin embargo, esta técnica no determina si un saborizante es aversivo o unappetitive, más bien, simplemente mide la liberación de DA durante el consumo del saborizante. Con el fin de determinar el valor hedónico de un saborizante, pruebas de comportamiento se pueden incorporar a observar las respuestas oro-facial durante la reactividad sabor (como se describe en otros lugares 5, 21).
También hay que señalar que FSCV también es adecuado para medir otros neuroquímicos importantes, tales como la serotonina 22 y oxígeno 23, pero los métodos para la grabación de estos analitos en, los animales se mueven libremente despierto todavía no están disponibles. Además, con la voltametría combinado y el método de infusión intra-oral, las respuestas de la dopamina en el tiempo de bloqueo a la entrega saborizante pueden ser analizados en ausencia de otras conductas, como el enfoque de la conducta o la recuperación de los alimentos, que también podrían afectar la liberación de DA. Como una aplicación adicional, la entrega saborizante intraoral combinada y FSCV puede ser ideal para la medición de la señalización de DA a eventos gratificantes o aversivos durante conditioni operante o pavlovianong. De hecho, una reciente publicación JoVE por Levy y sus colegas combina la entrega saborizante intraoral con la conducta operante para determinar si estimulantes del gusto intraorales apoyan la adquisición y el mantenimiento de la conducta de autoadministración operante 24. Por lo tanto, estos métodos también se pueden combinar con FSCV para identificar fásica respuesta DA a estimulantes del gusto orales durante comportamiento.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stimulating electrode | PlasticsOne | MS303/2-A/SPC | when ordering, request a 22 mm cut below pedestal |
| Cannula for electrode | BioAnalytical Systems | MD-2251 | |
| Glass capillary | A-M systems | 624503 | |
| Carbon fiber | Thornel | T650 | |
| Electrode puller | Narishige International | PE-22 | |
| Neurolog stimulus isolator |  Digitimer Ltd. |
DS4 | |
| Heat shrink | 3M | FP-301 | |
| Insulated wires for electrodes | Squires electronics | Custom | L 3.000 x 1.000s x 1.000s UL1423 30/1 BLU |
| Micromanipulator | Univ. of Illinois at Chicago, Engineering Machine Shop | ||
| Epoxy | ITW Devcon | 14250 | "5 minute epoxy" |
| Copolymer of perfluoro-3,6-dioxa-4-methyl-7octene-sulfonic acid and tetrafluoroethylene | Ion Power | LQ-1105 | i.e., Nafion |
| Silver paint | GC Electronics | 22-023 | |
| Power supply | BK Precision | 9110 | |
| Tubing for intra-oral catheters | Intramedic | 427426 | PE 100, I.D. = 0.86 mm; O.D. = 1.52 mm |
| Tubing for intra-oral infusion | Fischer Scientific | 02-587-1A | I.D. 1/32"; O.D. 3/32" |
| Syringe pump for flow cell | Pump Systems Inc. | NE 1000 | |
| Surgical cement | Dentsply Caulk | 675571 and 675572 | |
| Air actuator | VICI | A60 | 6 position digital valve interface |
| Digital valve interface | VICI | DVI | 230 VAC |
| Quad headstage | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| UEI power supply | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| UEI breakout box | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| Power supply for tastant syringe pump | Med Associates | SG-504 | |
| Tastant syringe pump | Med Associates | PHM-107 | |
| Tungsten microelectrode | MicroProbes | WE30030.5A3 | |
| Silver wire reference with AgCl | InVivo Metric | E255A | |
| Sucrose | Sigma | 80497 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Sodium chlroide | Sigma | S7653 | |
| Perchloric acid | Sigma | 244252 | |
| Hydrochloric acid (4 M) | Sigma | 54435 | |
| Soidum hydroxide | Sigma | 306576 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | H1009 | |
| Dopamine hydrochloride | Sigma | H8502 | |
| TarHeel HDCV Software | University of North Carolina-Chapel Hill | Must request software: click here for link to software request page |
References
- Roitman, M. F., et al. Dopamine operates as a subsecond modulator of food seeking. J Neurosci. 24 (6), 1265-1271 (2004).
- Aragona, B. J., et al. Regional specificity in the real-time development of phasic dopamine transmission patterns during acquisition of a cue-cocaine association in rats. European Journal of Neuroscience. 30 (10), 1889-1899 (2009).
- Wheeler, R. A., et al. Cocaine cues drive opposing context-dependent shifts in reward processing and emotional state. Biol Psychiatry. 69 (11), 1067-1074 (2011).
- Wickham, R. J., et al. Advances in studying phasic dopamine signaling in brain reward mechanisms. Front Biosci (Elite Ed). 5, 982-999 (2013).
- Roitman, M. F., et al. Real-time chemical responses in the nucleus accumbens differentiate rewarding and aversive stimuli). Nature Neuroscience. 11 (12), 1376-1377 (2008).
- Cheer, J. F., et al. Phasic dopamine release evoked by abused substances requires cannabinoid receptor activation. J Neurosci. 27 (4), 791-795 (2007).
- Owesson-White, C. A., et al. Neural encoding of cocaine-seeking behavior is coincident with phasic dopamine release in the accumbens core and shell. Eur J Neurosci. 30 (6), 1117-1127 (2009).
- Phillips, P. E., et al. Subsecond dopamine release promotes cocaine seeking. Nature. 422 (6932), 614-618 (2003).
- Chen, C., et al. Levels of mint and wintergreen flavorants: smokeless tobacco products vs. confectionery products. Food Chem Toxicol. 48 (2), 755-763 (2010).
- Manning, K. C., Kelly, K. J., Comello, M. L. Flavoured cigarettes, sensation seeking and adolescents' perceptions of cigarette brands. Tob Control. 18 (6), 459-465 (2009).
- Rainey, C. L., Conder, P. A., Goodpaster, J. V. Chemical characterization of dissolvable tobacco products promoted to reduce harm. J Agric Food Chem. 59 (6), 2745-2751 (2011).
- Phillips, P. E., et al. Real-time measurements of phasic changes in extracellular dopamine concentration in freely moving rats by fast-scan cyclic voltammetry. Methods Mol Med. 79, 443-464 (2003).
- Robinson, D. L., Wightman, R. M. Rapid Dopamine Release in Freely Moving Rats. Electrochemical Methods for Neuroscience. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2007).
- Montague, P. R., et al. Dynamic gain control of dopamine delivery in freely moving animals. J Neurosci. 24 (7), 1754-1759 (2004).
- Heien, M. L., Johnson, M. A., Wightman, R. M. Resolving neurotransmitters detected by fast-scan cyclic voltammetry. Anal Chem. 76 (19), 5697-5704 (2004).
- Keithley, R. B., Heien, M. L., Wightman, R. M. Multivariate concentration determination using principal component regression with residual analysis. Trends Analyt Chem. 28 (9), 1127-1136 (2009).
- Keithley, R. B., Carelli, R. M., Wightman, R. M. Rank estimation and the multivariate analysis of in vivo fast-scan cyclic voltammetric data. Anal Chem. 82 (13), 5541-5551 (2010).
- Rising, J. P., et al. Healthy Young Adults: description and use of an innovative health insurance program. J Adolesc Health. 41 (4), 350-356 (2007).
- Day, J. J., et al. Associative learning mediates dynamic shifts in dopamine signaling in the nucleus accumbens. Nature Neuroscience. 10 (8), 1020-1028 (2007).
- Park, J., et al. Catecholamines in the bed nucleus of the stria terminalis reciprocally respond to reward and aversion. Biol Psychiatry. 71 (4), 327-334 (2012).
- Wheeler, R. A., Carelli, R. M. The neuroscience of pleasure. Focus on 'Ventral pallidum firing codes hedonic reward: when a bad taste turns good. J Neurophysiol. 96 (5), 2175-2176 (2006).
- Bunin, M. A., et al. Release and uptake rates of 5-hydroxytryptamine in the dorsal raphe and substantia nigra reticulata of the rat brain. J Neurochem. 70 (3), 1077-1087 (1998).
- Zimmerman, J. B., Wightman, R. M. Simultaneous electrochemical measurements of oxygen and dopamine in vivo. Anal Chem. 63 (1), 24-28 (1991).
- Levy, A., et al. A novel procedure for evaluating the reinforcing properties of tastants in laboratory rats: operant intraoral self-administration. J Vis Exp. (84), e50956 (2014).
