Transfektion, Selection, og Colony-picking af menneskeskabte pluripotente stamceller talen målrettet med et GFP-genet i AAVS1 Safe Harbor

Introduction

Evnen til at omprogrammere humane somatiske celler i embryonale stamceller-lignende inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) blev først opdaget af Takahashi et al. I 2007 ^1. Humane dermale fibroblaster transduceret med retrovirus udtrykker fire transkriptionsfaktorer (den såkaldte døbt Yamanaka faktorer Oct3 / 4, Sox2, c-Myc og Klf4) viste sig at være meget lig humane embryonale stamceller (hESCs) baseret på morfologi, spredning, genekspression, og epigenetisk status; afgørende, iPSCs er også i stand til at differentiere til celler af alle tre kimlag ^1. Den proliferative potentiale og differentiering kapacitet iPSCs gør dem meget attraktive værktøj; ved at omprogrammere celler fra patienter, der lider af bestemte sygdomme, kan iPSCs anvendes både som in vitro sygdom modelsystemer og som potentielle terapeutiske midler.

Til det sidstnævnte formål, skal en række spørgsmål, der skal løses, før det fulde potentiale i iPSCsi et klinisk miljø kan realiseres; den tumorigent potentiale in vitro dyrkede hESCs og iPSCs, brug af xenogene derivater under omprogrammering og celle vedligeholdelse, og behovet for at spore transplanterede celler in vivo, er alle vigtige hindringer for den kliniske anvendelse af pluripotente stamceller (Anmeldt af Hentze et al. ^2). En ideel løsning på behovet for sporing differentierede celler efter transplantation ville indebære en visuelt påviselig markør, der modstår lyddæmpning og variegation uanset ansøgningen. Robust og vedholdende udtryk for integrerede transgener er lettest opnåelige når exogent DNA indføres i safe harbour loci; dvs. genomiske sites, der muliggør tilstrækkelig transskription af en integreret vektor, mens på samme tid at mindske forstyrrelser af ekspression i tilstødende gener ^3. Et sådant websted, der har været meget godt karakteriseret siden dens opdagelse er den adenoassocierede virus integration site 1 (AAVS1), i den første intron af proteinphosphatase 1 regulatoriske underenhed 12C (PPP1R12C) genet. Har vist dette locus ikke blot at tillade vedvarende og robust ekspression af integrerede transgener gennem forlænget tid i kultur og in vitro differentiering ^3, men også for at beskytte omgivende gener fra transkriptionel perturbation ^4; begge funktioner menes at være på grund af tilstedeværelsen af endogene kromatin isolerende elementer flankerer AAVS1 site ^5.

Fremskridt i genomet engineering værktøjer over blot det sidste årti har lettet den lethed og effektivitet, hvormed der kan opnås genetiske manipulationer i enhver celletype. Mens tidlige vellykkede eksperimenter påberåbte overordentlig lave niveauer af endogen homolog rekombination (HR) med et indført donor til at opnå genmålretning i økonomiske og sociale råd ^6,7, brugen af stedspecifikke nukleaser, såsom zink finger nukleaser (ZFNs), at signiligt fremkalde homolog rekombination ved produktion af en dobbeltstrenget DNA pause i høj grad har øget effektiviteten med sådanne forsøg ^8,9. Den nyorientering af både transskription aktivator-lignende effektorer (Tales) vegetabilske patogene xanthomonas slægter og de ​​prokaryote grupperet regelmæssigt spatierede korte palindromiske gentagelser (CRISPR) / Cas9 systemet til effektive stedspecifikke designer nukleaser har gjort genmålretning i pluripotente stamceller en tilgængelig og praktisk metode ^10-13.

En nylig papir beskrevet en effektiv metode til stabil integration af et grønt fluorescerende reporter kassette i AAVS1 safe harbour locus i menneskelige iPSCs hjælp af fortælling nukleaser (Talens) ^14. Disse målrettede iPSCs opretholdt deres fluorescens selv efter rettet differentiering til cardiomyocytter og transplantation i en musemodel for myokardieinfarkt (MI), som giver stærke beviser for anvendeligheden af ​​sådannestabilt fluorescerende pluripotente stamceller ^14. For at opnå målrettede kolonier blev en gen-trap metode hvor en splejsning-acceptor (SA), 2A selvspaltende peptidsekvens placerer puromycin N-acetyl-transferase (PAC) genet under kontrol af den endogene PPP1R12C promotor; Således er det kun iPSCs der har inkorporeret DNA-donoren på AAVS1 locus udtrykke PAC, gør dem valgbare baseret på puromycin-resistens; (Figur 1, ^15). Denne protokol beskriver de procedurer generere AAVS1-GFP iPSCs rapporteret i den seneste papir ^14, herunder processen med transfektion iPSCs med Talens og en 9,8 kb donor til at integrere et 4,2 kb DNA-fragment i AAVS1 safe harbour locus, vælge iPSCs baseret på puromycin-resistens, og plukke kolonier for klonal ekspansion. De heri beskrevne teknikker kan anvendes til mange genom engineering eksperimenter.

Protocol

1. Fremstilling af basalmembranmatrix og Overfladebehandling af Plastvarer

1. Placer frosne basalmembranmatrix bestand fra -20 ° C på is og tø natten over ved 4 ° C.
2. Efter optøning pipette 2 mg alikvoter af basalmembranmatrix i nedkølede Eppendorf-rør. Gemme disse ved -20 ° C indtil brug.
3. Til fremstilling basalmembranmatrix-belagte plader, optø en alikvot på is indtil det sidste stykke af isen i Eppendorf-rør forsvinder (normalt inden for ~ 2 timer).
4. Efter optøning tilsættes basalmembranmatrix til 12 ml kold (4 ° C) DMEM / F12 at basalmembranmatrix coatingopløsning.
5. Tilføj basalmembranmatrix løsning på passende dyrkningsbeholder. For en 6-brønds plade, dispensere 1 ml per brønd. Swirl pladen for at sikre basalmembranen matrix løsning fuldstændig dækker hver brønd.
6. Parafilm forsegle basalmembranen matrix-coatede plade / skål og inkuberes ved room temperatur i 1 time før brug. Alternativt butik basalmembranmatrix-coatede plader / skåle ved 4 ° C og brug inden for 2 uger belægning.
   BEMÆRK: Læg ekstra DMEM / F12 til basalmembranen matrix-coatede plade / skål for at forhindre udtørring. Inden brug 4 ° C lagret basalmembran matrix-coatede plade / skål, placere den i et biologisk sikkerhedsskab og lad den komme til stuetemperatur i mindst 30 min.
7. Aspirer basalmembranmatrix fuldstændigt før tilsætning af medium og celler.

2. Fremstilling af E8 medium

1. Forbered E8 dyrkningsmediet ved optøning E8 supplement natten over ved 4 ° C.
2. Fjern 10 ml E8 basalmedium fra 500 ml lager og kassér.
3. Pipette hele 10 ml hætteglas med E8 supplement direkte i 490 ml E8 basalmedium. Må ikke varm komplet E8 medium i et 37 ° C vandbad, som gentagne temperatursvingninger kan forringe bFGF i komplete E8 medium.
4. Brug komplet E8 medium inden for 2 uger tilsætning af tillægget.

3. Optøning af iPSCs

1. Fjern et hætteglas med frosne iPSCs fra flydende nitrogen og sted på tøris.
2. Hurtigt tø hætteglasset i et 37 ° C vandbad; hætteglasset i vandbad, indtil kun en lille fragment af is rester.
3. Spray hætteglas med 70% ethanol og overførsel til et biologisk sikkerhedsskab.
4. Der tilsættes 1 ml stuetemperatur E8 medium dråbevis direkte til hætteglasset.
5. Ved hjælp af en 2 ml pipette dråbevis cellesuspensionen i 9 ml E8 medium i et 15 ml konisk rør. Swirl røret ofte for at sikre, at cellerne og medium bland godt hurtigt.
6. Centrifugeres cellerne ved 200 x g i 5 min.
7. Aspirer supernatanten og resuspender cellepelleten i et passende volumen af ​​E8 suppleret med 10 pM Y-27632.
8. Tilsæt cellerne til et passende antal kælderen membrane matrix-coatede brønde, og anbringes i et 37 ° C, 5% CO _2-inkubator natten over. Det anbefales at pladen på mindst 0,2 x 10 ⁶ iPSC per brønd af en 6-brønds plade for at muliggøre hurtig genopretning efter optøning.

4. Vedligeholdelse og regelmæssig Passage af iPSCs

1. Opdater E8 medium dagligt.
2. Overvåg morfologi og sammenflydning af celler med et inverteret mikroskop. iPSCs af høj kvalitet vokser i flade kolonier med tydelige grænser; individuelle kolonier i besiddelse af en "brosten-lignende" udseende.
3. Passage iPSCs celler, når de når ~ 70% konfluens.
4. Forbered en EDTA passage ved tilsætning 0,9 g NaCl og 500 pi 0,5 M EDTA til 500 ml DPBS. Bland godt for at opløse NaCl og vakuumfilter at sterilisere. Varm en alikvot af passage opløsning i et 37 ° C vandbad før passage.
5. Passage, aspirat brugt dyrkningsmedium og vaskes cellerne én gang med et lige volumen af ​​varm pasSaging opløsning. Aspirer og pipette nok EDTA passage opløsning til at overtrække cellerne (1 ml pr brønd af en 6-brønds plade).
6. Placer cellerne under et omvendt mikroskop og observere IPSC kolonier. Fremkomsten af ​​huller i kolonier og rejst grænser bør fremgå i løbet af 2 til 5 min.
7. Aspirere forsigtigt EDTA passage løsning.
8. Ved hjælp af en 10 ml pipette, dispensere 4 ml E8 medium (hvis der anvendes en 6-brønds plade) under højt tryk direkte ind i hver brønd, der skal passeres.
9. Saml IPSC klumper, og opdelt i et passende antal brønde afhængigt af split-forholdet fra 1: 8 til 1:12. Må ikke over-pipette, som opdeling af celleklumper vil resultere i dårlig levedygtighed.
10. Pladen anbringes i en inkubator, og rock pladen back-og-tilbage og side-til-side flere gange for at dispergere cellerne.

5. Fremstilling af MEF'er og iPSCs for Tansfection

1. 48 timer før transfection passage iPSCs på ~ 1: 6 i fire eller flere brønde i en basalmembran matrix-coatede plade med 6 brønde, således at de vil være 70% konfluente to dage dermed.
2. Den næste dag, optø DR4 MEF'er i MEF medium bestående af DMEM (høj glucose) suppleret med 10% FBS og 1 x MEM-NEAA.
3. Plate DR4 MEF'er i to 10 cm skåle på ~ 2 x 10 ⁴ celler / ^cm2 og inkuberes natten over ved 37 ° C.
4. På dagen for transfektion, ændre MEF medium til E8 suppleret med 10 pM Y-27632 30 min før du udfører transfektion på iPSCs.
5. Valgfrit: Hvis der ønskes flowcytometrisk analyse af iPSCs efter transfektion fjerne en basalmembran matrix-coatede plade fra 4 ° C og sted ved stuetemperatur.
6. Valgfrit: 4 timer forud for transfektion supplere pre-transfektion iPSC kultur med Y-27632 ved en slutkoncentration på 10 uM.

6. Let-celledissociering Reagent behandling And Transfektion af iPSCs anvendelse af en Elektroporation System

1. Fjern P3 primære celletransfektion løsning fra 4 ° C og gør det muligt at komme til stuetemperatur i ~ 30 minutter. Tilsæt hele 100 pi supplement til transfektion opløsningen før brug.
2. Varm blid-celle dissociation reagens i et 37 ° C vandbad.
3. Opnå AAVS1 Talens (PZT-AAVS1-L1 og PZT-AAVS1-R1) og AAVS1-CAG-EGFP donor fra -20 ° C.
4. Fjern iPSCs fra inkubatoren og vask en gang med DPBS.
5. Der tilsættes 1 ml blid celle dissociation reagens per brønd og inkuberes iPSCs ved 37 ° C i 5 minutter, eller indtil mere end 50% af cellerne har adskilles fra dyrkningsbeholderen.
6. Pipette cellerne op og ned nogle få gange med en P1000 pipette at dissociere eventuelle resterende celler fra dyrkningsbeholderen, og til at bryde op IPSC klumper.
7. Tilsæt 2 ml E8 medium til hver brønd, og pipette op og ned flere gange ved hjælp af en 10 ml pipette til FürthER disaggregere celleklumper i enkeltceller
   BEMÆRK: Transfektionseffektivitet falder markant, hvis celleklumper ikke er tilstrækkeligt opdelt.
8. Saml iPSCs i en 15 ml konisk rør og centrifugeres ved 100 xg i 3 min.
9. Aspirer supernatanten og resuspender cellerne i en minimal mængde af E8 medium.
10. Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer efter anvendelse af en vital plet såsom 0,4% trypanblåt. Sørg for, at cellerne er tilstrækkeligt dissocieres mens tælle (1-3 celler pr "klump").
11. Dispenser 3 x 10 ⁶ celler i hver af to 15 ml koniske rør og spin ned igen ved 100 x g i 3 min.
    BEMÆRK: lavhastighedscentrifugering reducerer celle stress og giver let resuspension af iPSCs før elektroporation.
12. Sæt elektroporation systemet til det særlige program celletype for humane embryonale stamceller line H9 (Program CB-150).
13. Efter centrifugering aspireres supernatanten fra cell pellets. Til den ene pille, der tilsættes 10 ug af HR donor som kontrolprøve. Til den anden pellet tilsættes 10 ug af HR donor, sammen med 5 ug af hver talen (PZT-AAVS1-L1 og PZT-AAVS1-R1) som eksperimentel prøve.
14. Resuspender hver cellepellet i 100 pi P3 primære celletransfektion opløsning og overføres til en kuvette.
15. Udfør transfektion og straks tilføje 500 pi stuetemperatur E8 medium til hver kuvette.
16. Dråbevis transficerede iPSCs Overførsel til en 10-cm skål indeholdende DR4 MEF'er fremstillet i trin 5.4.
17. Valgfrit: Tilføj flere dråber fra hvert eksperiment i en brønd af en basalmembran matrix-coatede plade med 6 brønde, hvis flowcytometri anaylsis af transfektionseffektivitet er ønsket.
18. Gentag trin 6,15-6,17 for at afslutte begge prøver. Den følgende dag, vaske celler med DPBS to gange og skifte dyrkningsmedium til NutriStem, som synes at støtte iPSC kultur på foderautomater bedre end E8.
19. Transient EGFP ekspressionssystemer toppe ved 48 til 72 timer efter transfektion; vurdere transfektionseffektiviteten som ønsket.

7. Puromycin udvælgelse af målrettede iPSCs

1. Begynd puromycinselektion 72 timer efter transfektion, når iPSCs nå 70% konfluens.
2. For NCRM5 iPSCs, begynder puromycinselektion på 0,5 ug / ml puromycin (1/2 fuld dosis) fortyndet i NutriStem dyrkningsmedium. Den optimale puromycin koncentration kan variere fra 0,25 til 1 ug / MLL for nogle IPSC linjer.
3. Kultur iPSCs i NutriStem + 0,5 ug / ml puromycin i 3 dage, forfriskende mediet dagligt.
4. Efter 3 dage øge koncentrationen af ​​puromycin til 1 ug / ml.
5. Kultur iPSCs under 1 pg / ml puromycin selektion for yderligere 7 til 8 dage, eller indtil særskilte kolonier forekommer store nok til koloni plukning.

8. Colony Picking og Udvidelse af målrettede iPSCs

1. Brug basalmembranmatrix til at coate en 96-brønds plade ved at dispensere 50 pi basalmembranmatrix coatingopløsning (2 mg basalmembranmatrix fortyndet i 12 ml DMEM / F12) i hver brønd. Opbevar pladen ved 4 ° C natten over før anvendelse.
2. Efter at basalmembranen matrix-coatede plade til at komme til stuetemperatur, aspireres basalmembranmatrix og dispenseres 100 pi E8 suppleret med 10 pM Y-27632 i hver brønd.
3. Placer en omvendt mikroskop i et biologisk sikkerhedsskab, og spray let med 70% EtOH at sterilisere.
4. Træk en glas Pasteur-pipette over en bunsenbrænder til opnåelse af en ideel koloni-picking værktøj, der har en lille "krog" på spidsen. Der steriliseres med 70% EtOH, og placere i hætten for at tørre.
5. Tag fadet indeholder målrettede IPSC kolonier fra rugemaskinen, og anbringes i hætten under mikroskopet.
6. Pick iPSCs ved at spore en cirkel omkring kolonien grænsen til koloni-picking værktøj.
7. Brug "krog" af koloni-picking værktøj til forsigtigt at skrabe og fjern iPSC koloni fra overfladen af ​​pladen. For større kolonier, tegne et X med kolonien-picking værktøj til kvartal kolonien vil lette cellevækst efter fornyet plating.
8. Når celleklumper er fritliggende og frit flydende, så brug en P200 pipette sat til ~ 30 pi at indsamle iPSCs. Plate celler direkte i 96-brønds plade.
9. Valgfrit: Brug en p20 pipette indstillet til ~ 5 pi at indsamle iPSCs i et Eppendorf-rør, hvorefter der tilsættes 50 pi blid-celle dissociation reagens at fordøje i 5 minutter ved 37 ° C. Efter fordøjelse tilsættes 500 pi E8 medium ind i Eppendorf-rør til at fortynde den blide-cell dissociation reagens og spin ned cellerne ved 200 xg i en standard bordplade mikrocentrifuge i 5 minutter. Derefter aspireres meste af mediet og lade ~ 30 pi at resuspendere og overføre celler i 96-brønds plade.
   BEMÆRK: Dennefremgangsmåde vil lette dissociation af cellen klump og hurtig udvidelse af plukket koloni.
10. Fortsæt koloni plukning indtil et tilstrækkeligt antal IPSC kolonier er blevet opsamlet (ca. anbefales 20-30 kolonier pr eksperiment).
11. Efter koloni plukning placere plade med 96 brønde i en inkubator natten over. Opdater med komplet E8 medium den følgende dag, og kultur indtil ~ 70% sammenflydende.
12. Passage celler fra 96 ​​brønde i en 24-brønds, derefter ind i en 6-brønds, som beskrevet i trin fra 4,5 til 4,10.
    BEMÆRK: mængderne af EDTA-opløsning og E8 medium bør reduceres proportionalt ved brug af brønde mindre end en 6-brønds plade.
13. Vurdere målretning succes ved krydset PCR og Southern blot-analyse for at bekræfte målrettet kassette integration og fravær af tilfældigt indsatte vektorer ^16.

Representative Results

En visualisering af protokollen er tilvejebragt i figur 2, med perioder, hvor iPSCs dyrkes i andet medium fremhævet af enten grøn for E8 eller blå for NutriStem. Det er vigtigt at transficere kun høj kvalitet iPSCs; undersøge petriskåle hele rutinemæssig vedligeholdelse, og kontroller, at IPSC kulturer indeholder primært forskellige kolonier, der bærer en brosten-lignende morfologi (figur 3A); differentierede celler bør ikke optager mere end 10% af kulturen. Transficerbarhed iPSCs vurderes og optimeres ved hjælp af den lille Pmax-GFP-vektor (figur 4A-B), som transfektion med Pmax-GFP typisk repræsenterer den maksimalt opnåelige virkningsgrad på grund af sin lille størrelse. For eksempel har vi opnået 68,6% transfektionseffektivitet med Pmax-GFP (figur 4B). For at målrette AAVS1 safe harbour er iPSCs passeres ved hjælp af en blid encellede dissociation reagens og transficeres med AAVS1-Talens og AAVS1-CAG-EGFP (plasmider er afbildet i figur 1A). Transficerede iPSCs udplades derefter på et egnet densitet på DR4 MEF'er (figur 3B). Forbigående ekspression af AAVS1-CAG-EGFP toppe ved 48 til 72 timer efter transfektion (figur 3C); hvis det ønskes, kan en lille del af transficerede iPSCs være FACS analyseret. NCRM5 iPSCs kan transficeres med effektiviteten på 60,9% ved anvendelse af AAVS1-CAG-EGFP donor (figur 4C). Transfektionseffektivitet kan variere meget; til eksperimenter, hvor GFP + fraktionen er endda så lav som 10%, fortsætter med at puromycinselektion. Efter udførelse puromycinselektion bør individuelle kloner udviser ensartet fluorescens være stor nok til koloni plukning (figur 3D). At vælge kloner, er en egnet koloni placeret under lav forstørrelse (figur 3E), og isoleres ved første sporing og fjerdedelsmetoden det (fig 3F-G). De kvarte kolonier derefter forsigtigt skrabed fra dyrkningsbeholderen (figur 3H). Ved hjælp af en p200 pipette er celleklumper derefter overført til en brønd af en basalmembran matrix-coatede 96-brønds plade. iPSCs skal vedlægge inden for 2-4 timer efter plating (figur 3i),. Hvis vedhæftede fil ikke er inden for 24 timer, basalmembranmatrix-belægning eller Y-27632 behandling sandsynligvis optimale; Basalmembranmatrix-coat en ny 96-brønds plade og forberede frisk E8 + 10 uM Y-27632 før picking flere kolonier. Når i en 96-brønds format, målrettet IPSC kloner ekspanderes og bør udvise stabil og ensartet ekspression af GFP (fig 4D-E).

Figur 1: Gene targeting vektorer og målretning skematisk. (A) repræsentationer AAVS1-CAG-EGFP og PZT-AAVS1-L1 / R1 Talens plasmider, der anvendes i denne undersøgelse. Den SA-2A element i AAVS1-CAG-EGFP plasmid repræsenterer splejsnings-acceptor og 2A selvspaltende peptid anvendes til at begrænse puromycin N-acetyl-transferase (PAC) genekspression målrettet-integration events. Kylling β-actin globin (CAG) promotor anvendes til at drive ekspression af EGFP. (B) Den AAVS1 safe harbour, indeholdt i intron 1 af PPP1R12C genet, er målrettet anvendelse Talens at generere en dobbeltstrenget DNA-brud. Dette aktiverer homolog rekombination (HR) reparationsmaskineri, som derefter anvender AAVS1-CAG-EGFP donor (forsynet homologiarme flankerer kløvningspunkt) som et substrat for reparation. Kassetten er integreret og PAC-genet anbringes under kontrol af den endogene PPP1R12C promotoren.

Figur 2. Tidslinje af gen-targeting eksperiment. IPSCs dyrkestil 70% konfluens og passeret ~ 1: 6 på dag -2 (d-2). MEF'er udplades ved d-1 og iPSCs opsamles og transficeret ved d0. På d1 er medier skiftet til NutriStem, og iPSCs dyrkes i to dage mere, før der tilsættes puromycin til mediet ved d3. Kolonier er typisk klar til plukning af D12. Perioder, hvor iPSCs dyrkes i E8 medium er fremhævet grønt, mens perioder med NutriStem kultur er i blåt.

Figur 3: iPSC genmålretning repræsentative billeder (A) Fase billede af høj kvalitet iPSCs høj.. Bemærk fase-lyse grænse og brosten-lignende morfologi. (B) DR4 MEF udpladet på 2 x 10 ⁴ celler / ^cm2 24 timer efter optøning. (C) Tooghalvfjerds timer efter transfektion EGFP + celler er klart når de ses under et fluorescens MICRoscope. (D) Efter puromycin-baseret udvælgelse til ~ 14 dage kolonier udviser ensartet GFP-fluorescens er store nok til at blive plukket. (EH) Repræsentative billeder af kolonien plukke proces. Kolonier udtages ved hjælp af en forstrakt Pasteur pipette, først ved skitserer koloni og derefter efter fjerdedelsmetoden det muligt at opnå mindre celleklumper. (I) plukket IPSC kolonier tillægger basalmembranen matrix-coatede overflade af den 96-brønds plade inden 2 4 timer. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 4: FACS-analyse af transfektionseffektivitet og klonale målrettede iPSCs. (A) Kontrollen NCRM5 iPSCs uden transfektion af enhver plasmid. (B) NCRM5iPSCs transficeret med lille test vektor Pmax-GFP er FACS analyseret for GFP-ekspression. (C) Forbigående ekspression af AAVS1-CAG-EGFP plasmid bedømmes ved FACS. (d) en NCRM5-AAVS1-CAG-EGFP klon skærme ensartet positiv EGFP udtryk som analyseret ved FACS. Bemærk den stramme gruppering af analyserede iPSCs i forhold til C). (E) Fluorescens billede af en udvidet NCRM5-AAVS1-CAG-EGFP målrettet klon.

Discussion

De mest kritiske trin for en vellykket generation af AAVS1 safe harbour målrettet menneskelige iPSCs er: (1) effektivt at levere talen og donorplasmider i iPSCs ved transfektion; (2) at optimere dissociation af iPSCs i enkeltceller før transfektion og udpladningsdensitet efter transfektion; (3) optimering dosis og tidspunkt for lægemiddel-selektion baseret på væksten af ​​iPSC linje; (4) forsigtigt dissekere og plukke målrettede kolonier og overførsel til ny plade / godt. Sammenlignet med lignende metoder, der anvendes i Hockemeyer papir ^10, denne protokol, der bruges et par open source AAVS1-Talens, anderledes iPSC dissociation reagens og anderledes transfektion enhed til at levere Talens og donor vektorer, hvilket bidrog til at reducere antallet af iPSCs anvendes i eksperiment og samtidig opfylde høje transfektion og målretning effektivitetsgevinster.

For at opnå højeffektiv gen redigering i humane iPSCs, er det vigtigt først at optimere levering af genet ediTing reagenser (DNA / RNA), samtidig med at balancere den akutte celledød leveringsmetoden og reagenser forårsager på iPSCs. Målet er at maksimere levering effektivitet, samtidig med at opretholde et nogenlunde lavt niveau af celledød. Da det er meget let at forberede store mængder AAVS1-talen plasmider, der kan opnå> 50% HR effektivitet ved hjælp af lægemiddel-selektion i menneskelige iPSCs, er det ikke nødvendigt at gøre mRNA fra Talen plasmider. Udfordringen for levering kommer fra store donorplasmider, som i dette tilfælde er ~ 10 kb. Det anbefales at bruge AAVS1-CAG-EGFP donor til at teste levering effektivitet i specifikke humane IPSC linjer snarere end at bruge pMaxGFP inkluderet i transfektion kit, fordi pMaxGFP er en ~ 3,5 kb lille plasmid og meget let at levere ind i nogen celler. AAVS1-CAG-EGFP donor kan ændres ved hjælp af restriktionsenzymer vist i figur 1A til at målrette forskellige transgener ind AAVS1 locus. En anden 12 kb donor, som indeholder et 6,4 kb kassette til at erstatte CAG-EGFP, har væreOr anvendt med succes til at opnå lignende transfektion og målretning effektivitet (data ikke vist). Generelt humane iPSCs er blandt de vanskelige at transficere celletyper og leveringen effektivitet for store plasmider kan være så lav som 5-10% som målt ved flowcytometri analyse af GFP + -celler. Yderligere optimering af transfektionseffektivitet er afhængig af korrekt dissociation af humane iPSCs i enkelte celler, fordi celleklumper vil reducere risikoen for at levere genet redigering reagenser ind i hver celle. Denne protokol bruger en blid og hurtig-arbejdende celle dissociation reagens, men behandle iPSCs i mere end 10 minutter, kan ikke anbefales. Normalt iPSC kultur er mindre end 80% sammenflydende, hvis følgende trin 5.1, hvilket gør en 5 minutters inkubation med forvarmet blid celle dissociation reagens typisk tilstrækkelig til at adskille de iPSCs i enkelte celler med forsigtig pipettering. Hvis ikke alle celler kan adskilles i enkelte celler efter 10 min af behandling, fordi cellekultur over-conflydende eller kolonierne bliver meget kompakt, skal du blot samle det anbefalede antal enkeltceller fra flere brønde / plader og forlade stramt vedhæftede celler bag. Heavy pipettering anbefales ikke, da mekanisk forskydning er mere skadelig for cellerne end enzymatisk dissociation. Når der arbejdes med tidlig-passage iPSCs (før passage # 15), er meget vigtig for celleoverlevelse blid dissociation praksis, fordi cellerne er allerede mere følsomme for transfektion stress end sene passage iPSCs. Hvis det er vanskeligt at opnå højeffektiv i både transfektion og celleoverlevelse, vælge den praksis, der giver størst transfektionseffektivitet. Efter transfektion bør cellerne udpladet med en densitet, der vil nå 50-80% konfluens på dag 3, når medikament-selektion begynder. Da hver iPSC linje vokser forskelligt, muligvis efter transfektion udpladningsdensitet skal optimeres for hver cellelinie. En høj udpladningsdensitet kan føre til over-konfluens, der reducerer effektiviteten af ​​drug-udvælgelse, mens en ekstrem lav udpladningsdensitet kan forårsage forsinket restitution og vækst resistente kolonier. Normalt 3 millioner startende iPSCs er nok til at blive udpladet i ½ til 2 10 cm skåle afhængigt af overlevelse og vækst af specifikke iPSCs. Tilsvarende hvis du bruger en nyligt genererede eller som-endnu uprøvet iPSC linje, genererer en puromycin kill kurve for at etablere den laveste effektive dosis i utransficerede celler kan være nødvendige; IPSC linjer kan variere betydeligt i deres følsomhed over for puromycinselektion. De MEF'er blev anvendt til selektion, fordi de synes at understøtte iPSC vækst bedre end nogle ekstracellulære matricer under lægemiddel-selektion. Som en tommelfingerregel, mindst 5 dage puromycin ved 1 pg / ml eller 7 dage ved 0,5 ug / ml er nødvendige for at fuldføre valget. Endelig koloni-picking teknik er afgørende for at bevare alle de målrettede kolonier efter udvælgelse stof. Forsigtig pipettering eller dissociation reagens behandling hjælper til at bryde kolonierne i flere stykker jævntfordeles i nye godt, og derfor kan fremskynde koloni ekspansion. Hvis du bruger en dissociation reagens til disaggregere de plukkede kolonier før plating, sørg for at det er tilstrækkeligt fortyndet med> 10x medium efter behandling, fordi den resterende dissociation reagens kunne dræbe de overførte celler hvis venstre på natten over. Uanset hvilken teknik anvendes, praktiserende koloni plukning før de reelle eksperimenter er stærkt opmuntret.

Som beskrevet strategi udnytter et gen-trap metode til at drive ekspression af PAC-genet ud af endogene PPP1R2C promotoren, picking betydeligt mere end 30 kolonier bør ikke vise sig nødvendigt. SA-2A knyttet PAC udvalg teoretisk eliminerer tilfældige integration kun celler, men yderligere tilfældig integration (er) kan forekomme i iPSCs der bærer vellykkede målrettede integrationer. I de fleste tilfælde har næsten 100% af de narkotikarelaterede udvalgte kloner målrettede integrationer og ~ 10-40% af dem har ekstra tilfældig Integrations. Størstedelen af ​​målrettede kloner tendens til at have en enkelt allel målretning, selvom forsøg hvor> 50% dobbelt-allel målretning forekommer. Den variable frekvens af yderligere tilfældige integrationer, samt forholdet mellem enkelt- versus dobbelt-allel målretning, er vanskelig at kontrollere. Plukke ~ 20 kolonier anbefales derfor at sikre enkelt- eller dobbelt-allel targeting kun kan opnås kloner. I lyset af mislykkede målretning eksperimenter, re-evaluering af de målrettede cellernes transficerbarhed, overlevelse og vækst, er effekten af ​​nukleaser i den specifikke cellelinie, og kvaliteten af ​​donor- og nukleaseinhibitorer forberedelser stærkt anbefales, inden en ny forsøger eksperimentet i sin helhed.

Det skal bemærkes, at tilsvarende gen-trap donorstrategier kan anvendes til at målrette andre aktive gener, men er ikke egnet til lydløs genmålretning som kræver en uafhængig promotor til at drive selekterbart genekspression. Også, mens the AAVS1 safe harbor anses for at have åbne chromatinstruktur, betyder det ikke garantere, at transgen kan udtrykkes kraftigt på dette locus. Faktisk vores seneste rapport viste, at flere svage promotorer var ude af stand til at køre påviselig fluorescerende reporter genekspression efter målrettet integration på AAVS1 locus ^14.

Denne protokol fokuserer på at bruge godt validerede Talens at målrette et godt studerede sikker havn locus i det humane genom. Teknikkerne er meget reproducerbar og let at tilpasse til mange applikationer involverer transgen. Sammenlignet med genom engineering metoder ved hjælp af tilfældige integrationer, AAVS1-talen medieret gen-targeting er yderst effektive og specifikke, og i tilfælde af iPSCs resulterer i stabilt fluorescerende celler, der har potentiale til at ekspandere og differentiere til en hvilken som helst human celle type. Mens denne protokol ikke beskrive design og validering af designer nukleaser eller bedømmelsen af ​​målrettede IPSC kolonier for pRoper kassette integration og off-target analyse, har flere gode protokoller beskrevet disse aspekter af metoden i detaljer ^16-18. Feeder-fri IPSC kultur og overførselsteknikker ved hjælp E8 medium er også beskrevet i detaljer i tidligere offentliggørelse ^19. Ovennævnte protokol, mens optimeret til genaddition i AAVS1 safe harbour af humane iPSCs, kan tjene som en generel model for forsøg med site-specifik nuklease-medieret gen redigering / tilføjelse ved hjælp af en homolog rekombination donor i nogen celletype.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-Free, 10 ml	Corning	354230	Store at -20 °C.
DMEM/F-12	Life Technologies	11320-033	Store at 4 °C.
Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates	Corning	3506
Essential 8 Medium	Life Technologies	A1517001	Store basal medium at 4 °C. Store supplement at -20 °C.
Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254	Store at room temp. Once dissolved in H2O, store at -20 °C.
Sodium Chloride	Sigma	S5886-500G
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Life Technologies	15575-020
DPBS, no calcium, no magnesium	Life Technologies	14190-250
100 mm TC-Treated Culture Dish	Corning	430167
DR4 MEF 2M IRR - Academic	GlobalStem	GSC-6204G	Store in liquid Nitrogen.
DMEM, high glucose, pyruvate	Life Technologies	11995-040	Store at 4 °C.
Defined Fetal Bovine Serum, US Origin	HyClone	SH30070.03	Store at -20 °C. Thaw at 4 °C overnight and aliquot. Store aliquots at -20 °C until needed.
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Life Technologies	11140-050	Store at 4 °C.
4D-Nucleofector Core unit	Lonza	AAF-1001B	part of the electroporation system
4D-Nucleofector X unit	Lonza	AAF-1001X	part of the electroporation system
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT)	Lonza	V4XP-3024	Upon arrival, remove Primary Cell Solution and supplement and store at 4 °C.
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Life Technologies	A1110501	Store at -20 °C. Thaw overnight at 4°C and warm an aliquot in a 37 °C water bath before use.
NutriStem XF/FF Culture Medium	Stemgent	01-0005	Store at -20 °C. Thaw overnight at 4 °C
AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 and pZT-AAVS1-R1)	Addgene	52637 and 52638

Name	Company	Catalog Number	Comments
AAVS1-CAG-EGFP Homologous Recombination donor	Addgene	22212
Puromycin Dihydrochloride	Life Technologies	A11138-03	Store at -20 °C. Prepare working aliquots of 1 mg/ml in ddH2O.
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets	Fisher Scientific	13-678-20A
Sorvall Legend XTR (Refrigerated), 120 V 60 Hz	Thermo Scientific	75-004-521
TX-750 4 × 750 ml Swinging Bucket Rotor	Thermo Scientific	75003607
Trypan Blue Solution, 0.4%	Life Technologies	15250-061