Summary
Bu makale doğum sonrası gün 1-8 fare veya sıçan yavrular aralıklı hipoksi kısa süreli uygulanması için yöntem anlatılmaktadır. Bu yaklaşım etkili bir hipoksi maruz kalma 30 dakika içinde hasat edilir kültürlü nöral progenitör hücreler üzerindeki sağlam doku düzeyi "etkisi priming" ortaya çıkarır.
Introduction
Bu yöntemin amacı, yeniden üretilebilir ve etkili bir yenidoğan kemirgenlere sistemik alçaltılmış havada bulunan oksijen aralıklı nöbetleri sunmaktır. Kök hücre biyolojisi işlemek için kesintili hipoksi (İH) kullanımı için gerekçe büyüme ortamı O 2 içeriği değiştirilmiş olduğu in vitro hücre kültürü deneylerinde kaynaklanır. % 20 "standart" koşullar O 2, artan çoğalmasında% 3 O 2 sonuçlarında kök / progenitör hücre popülasyonları hücrelerin uzatılmış kültürü ile karşılaştırıldığında Özellikle, apoptozu azalmış ve nöronal verim 1,2 arttı.
Bu grup, sistemik IH yönetimi ile önemli bir deneyime sahiptir ve solunum plastisitede 3-7 IH rolü üzerine kapsamlı çalışmalar yürütmüştür. Bu çalışma, kronik IH kemirgen CNS 8-10 nörogenezisi arttığı son bulgu in vivo akut keşif için temelini oluştururBir önkoşullanma uyarıcı olarak hipoksi (yani., doku hasat öncesinde) nöral kök / progenitör hücrelerin (NPC) 11 sonraki kültürüne. Fare yavrular akut aralıklı hipoksi (AIH) kısa (<1 saat) Dönem maruz kaldılar Dikkate değer, subventriküler bölge (SVZ) hasat edildi hücreler önemli ölçüde neurospheres veya yapışık tek tabaka hücreleri gibi genişleme kapasitesi artmıştır. AİH protokol aynı zamanda bir "nöron kaderi" transkripsiyon faktörü (Pax6) artmış ekspresyonu ile ilişkili bulunmuştur.
Buna göre, in vivo AIH protokolleri için "prime" NPC'ler önce kültürüne bir araç sağlayabilir. Örneğin, bu yaklaşım için uygulamalar yaralı merkezi sinir sistemi içine transplantasyondan önce hücre popülasyonlarının genişletilmesi, ya da sadece önceden in vitro deneylere kültürlenmiş hücrelerin nöronal farklılaşma artan içerebilir. Bundan başka, bu sistemik olarak uygulanması, çünkü herhangi birorgan doku veya hücre içindeki çalışma için bir adaydır. Bu nedenle, yazılı olarak protokol küçük memeliler aralıklı oksijen manipülasyon çalışmalarının geniş bir yelpazede potansiyel uygulanabilir.
Bu yaklaşımın bazı avantajları vardır. Diğer yayınlanan çalışmada, yenidoğanlar tedaviden önce, kronik dozlama için daha az işleme izin veren hipobarik odacıklarda baraj, bir çöp muamelesi ve tedavisi 9 süresince anne teması muhafaza edildi. Geçerli yaklaşım üreme kadın, ya da her bir deney için farklı bir baraj kullanımına tekrarlanan tedaviler atlar. Bu protokol ayrıca hassas çöp eşleştirilmiş ve aynı yaştaki yenidoğanların çalışma sağlar. Temsili veriler bu protokolün bir başka önemli gücü, AIH, teslim olarak, nöral kök hücre biyolojisinde güçlü ve tutarlı bir biyolojik tepkiyi ortaya çıkaran hangi ile yani Çabukluğu göstermektedir. Bu doku ve hücre düzeyinde biyolojik ka ortaya çıkarmak için bu protokol için bir emsal oluştururHücre biyolojisi değiştiren cal değişir.
Bu rapor AIH için kemirgen yavrular yanı sıra neurospheres olarak yetiştirilen SVZ hücrelerin nüfus analizi sergilemek için kullanılan ayrıntılı prosedürler açıklayacağım.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bu protokol tüm hayvan prosedürleri Florida Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) Üniversitesi onayı ile gerçekleştirilen ve 'Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu' ile uyumlu vardır.
1. Temel Deney Seti yukarı Aralıklı Hipoksi İdaresi Öncesi
- Diğer deneysel amaçlar 5,13,14 yetişkin kemirgenler kadar aynı şekilde bir tüm vücut fare Pletismograf odaları kullanarak farklı gaz karışımları için yavrular 12 Açığa. Odaları 3-4 fare yavrular ya da 1-2 sıçan yavrular karşılamak için yeterli büyüklükte bir 4 inç çapı (hacim = 450 ml) var. Burada, AIH protokolleri doğum sonrası gün 1-8 (P1-P8) yaş yenidoğanlarda teslim edilir.
- % 21 kamara oksijenasyonu tutar% 21 "taban" gaz teslim basınçlı hava gaz tankları kullanın. "Göreli hipoksi" elde etmek için,% 10 oksijen /% 90 azot gazı tankı kullanın.
DEĞİLE: Plastik boru (3/16 "çapında) bir akış ölçere gaz tankları bağlanır. Bu nedenle, akış ölçere girişi bir tüp taban çizgisi ile hipoksi hava akışı için, her oluşur. - Aşağıdaki gibi gaz boru yapılandırın.
- Her odaya 1 L / dk akışını sağlayan bir önyargı akış regülatörü, akış ölçer plastik boru (1/8 "çap) Run (yani 4 L / dk 4 odacıklı kullanılırsa).
- Pletismografi odalarına önyargı akış düzenleyici plastik boru (1/8 "çap) çalıştırın. Hava akımı, 1 L / saat, her bölmeye dakika gaz alışverişi olmayan stres yapıcı fizyolojik ve davranış gözlemlere dayanarak hayvanlara olduğu kabul edildiği bir önceden tespit edilmiş bir akış hızıdır.
- Hiçbir gaz akış protokolü sırasında kullanılmadığı, ya da pletismografi odaları dışında diğer odalarına kaçar ve böylece kapakları odalarına ve önyargı akış biriminden kullanılmayan tüm bağlantıları ve tüm kullanılmayan açıklıkları kapatılmalıdır.
- (Odasına yerleştirin ler) 37 ° C'ye kadar dengeye veya vücut ısısı sağlamak için bölme hayvanların koyarak önce bir inkübatör içine.
Aralıklı Hipoksi için Döngüsü Times 2. Kalibrasyon
- Hava tankları ve akış ölçer arasındaki tüm hortumunu kontrol edin doğru bağlantıları için sayaç ve önyargı akış ünitesi ve önyargı akış ünitesi ve pletismografisi odasını (ler) akar. Örneğin, kullanımda olmayan kullanılmayan önyargı akış biriminin dışına hatları ve herhangi bir odacık açıklıkları kontrol: Tüm açıklanan hatları ve kapanışları bir adım adım çekle bağlantısını kontrol edin Adım 1'de açıklandığı gibi bağlantı kurulmaktadır.
- Bir el O 2 metre ile ortam O 2 sensörünü bağlayın ve sonra pletismografisi odası kapak sensörü takın.
- Her iki gaz tankları açın ve gaz off-döngüsü akışını kelepçe plastik boru ile izole cerrahi, uzun saplı hemostat bir çift takın. Bu şekilde, bir seferde sadece bir gaz tankeri odasının başına 1 L / dk gaz akışını iletiyor. "Hipoksik" gaz karışımı tersi odasına teslim ve ise "taban" gaz karışımı Kelepçe.
- % 10 hedef düzeylere ulaşması ve% 21 geri dönmek için hazne O 2 için gerekli süreyi kaydedin. Sonraki protokol teslimat için kaydedilen süreleri yararlanın.
Akut Aralıklı Hipoksi 3. İdare
- Adım 2.1 anlatıldığı gibi tüm boru ve bağlantıları kontrol edin.
- Pletismografisi odasının (ler) yenidoğan yerleştirin ve oda üssü haline pletismografisi odası kapaklarını ev. Kullanılmayan odası bağlantılarının uygun bir O-ring conta ile mühür olduğu gibi kapatma onaylayın. Bu adımlar, gaz karışımları uygun teslimat sağlanması için kritik öneme sahiptir.
- Yavrular tutan odaları 37 ° C inkübatör içine tedavi edilmesi yerleştirin ve kapağını kapatın. Kamara önce protokolü başlamadan 37 ° C gelmesini sağlayınız. Incubat 37 ° C 'de kontrol hayvanları korumakveya oda havası oksijenasyonu de.
- Her iki gaz tankları açın ve gaz off-döngüsü akışını kelepçe plastik boru ile izole cerrahi, uzun saplı hemostat bir çift kullanın. Bu şekilde, bir seferde sadece bir gaz tankeri odasının başına 1 L / dk gaz akışının sağlamaktadır.
- Hassas bir zaman döngü elde tutulan bir zamanlayıcı kullanarak ve böylece odalarına gaz akışının münavebe ile sonuçlanan, borular arasındaki hemostat geçiş zamanı gösterir.
- Örneğin 2 aşamalı, 20 çevrim protokolünde tüm adımları kapalı işaretlemek için Şekil 1'de verilen biri olarak tedavi günlüğünü kullanarak her döngünün tamamlanmasını kaydedin.
- Hayvanlar belirlenen aralığın (37 ° C ile sonuçlanan inkübatör ayarı 33-35 ° C) muhafaza edilir sağlamak için her döngü değişikliğinde inkübatör sıcaklığını izleyin.
- Yakından hayvanlar gibi sesler çıkarma, değişmiş seviyesi gibi görünen sıkıntı olmadan çevrimleri tahammül emin olmak için protokol boyunca yavru etkinliğini izlemekuzuv faaliyet veya yuvarlanma.
Subventricular Zone Kök / Progenitör Hücreler 4. İzolasyon ve Kültür
NOT: kontrollere göre AIH aşağıdaki neurosphere oluşumunda değişiklik doku ve hücresel düzey değişiklikleri ortaya çıkarma, bu protokolün etkinliğini gösteren bir bitiş noktası bir örnektir.
- Hücreleri oluşturan neurospheres izole etmek için, AIH tamamlandıktan hemen sonra odadan fare veya sıçan yavrular kaldırın. Protokol fesih 30 dk içinde IACUC protokollerine göre hayvanların Kurban.
- Daha önce yöntemler bölümlerde 15,16 ve ayrı bir video protokolü 8 yayımlanan, SVZ doku hasat neurosphere kültürü yerleştirmek ve standart geçit ve türev neurospheres genişlemesini yürütmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tarihsel verilere dayalı ilk deneyler, 1 dk döngüsü uzunlukları kullanılarak yapılmıştır. Yukarıdaki 2. Adımda gerçekleştirilen sonraki kalibrasyon dayanarak, bunun% 21 başlangıca dönmek için benzer bir zaman aldı, odasında O 2 seviyesi 1 dk sonrası hipoksi flushing'in 13% olduğu belirlenmiştir edildi ve. Bununla birlikte, 2 dakika döngüsü 10% elde oksijen ve "taban" döngüsü sırasında% 21 bir dönüş hem de yeterli olmuştur. Daha sonra, 2 dakika döngü uzunlukları kullanılmıştır. Protokol süresi başlangıç ve hipoksi (80 dk toplam tedavi süresi) arasında değişen 20 döngü oluşuyordu. A 20 çevrim süresi nedeniyle böyle bir döngü süresi, solunum sonucu değişiklikler 11 önlemler ortaya çıkarmak için yeterli olduğunu gösteren önceki çalışma için seçildi. Kurmak tarif (Şekil 2) kullanarak, AIH tabi yenidoğanlar hiçbir belirgin olumsuz olayları vardı ve 80 sırasında ağrı ve rahatsızlık düşündüren davranışlar sergilemek vermedidk protokolü. Özellikle, görünür hiçbir apne, aşırı bacak veya kafa hareketleri, ya da vocalizations gözlendi. OİH sonra subventrikuler türetilmiş sinir kök / progenitör hücre popülasyonları, her oluşturan kürenin içinde artan genişleme gösteren, 14 gün boyunca (ve aynı zamanda yapışık olarak tek katlı bir popülasyonları, veriler gösterilmemiştir) çapı yaklaşık iki kat artış sergilerler için neurospheres olarak kültürlendi (Şekil 3). Aşağıdaki izin veren koşullar içinde plakalanır hücreler (mitojenik faktörlerinin yokluğunda yani) normoksik hasat hücreleri ile karşılaştırıldığında daha geniş bir nöron farklılaşmasını gösterir önemli ölçüde daha fazla beta-3-pozitif hücrelerin (% 45 <% 10> bir artış) elde tedavi (kontrol) yavrular (Şekil 4).
Şekil 1. Bu akut IH rekor sac hayvan belgelemek için kullanılır ve deneysel ayrıntıları, başlangıç ve IH protokolünün tamamlanmasını takiben önce için bir kontrol listesi sağlamak ve tüm tamamlanan döngü doğru taksitli için bir izleme belgesi olarak hizmet vermektedir.
Şekil 2. Aralıklı hipoksi yenidoğan kemirgenler için kurulmuş. (A) İnkübatör 37 ° C'de ortamını korumak için. Pletismografisi odası odası kapısının aralık (B) ile tekrar inkübatör içinde gösterilir, ve. (C) Doğru, her bölme için 1 L / dak ayarlandı Akış ölçer. Gaz akışı herhangi bir bağlı odasının (kuvöz içinde, sol) için önyargı akış ünitesi splitter ünitesi (merkez) üzerinden yönlendirilir. (D) başlangıca (bürokrasi) ve hipoksi (sarı bant) giriş hatlarının Hemostat kontrol. ank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. Kontrol neurospheres (A) OĐH neurospheres (B) daha küçük bir çapa göstermektedir. Görüntüler 10X objektif, ölçek bar = 100 mikron alınan. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. Kontrol neurospheres (A) OĐH neurospheres daha az beta-3-tubulin-pozitif neuroblasts (B) göstermektedir. Görüntüler 20X objektif, ölçek bar = 50 mikron alındığı.g "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse plethysmography chambers | Buxco | PLY4211 | |
| Flow meter | Porter | F150 | |
| Bias flow unit | AFPS | ||
| Baseline Gas Mix | Airgas | AIZ300 | Compressed Air |
| Hypoxic Gas Mix | Airgas | X03NI72C2000189 | 10% Oxygen, balance nitrogen |
| Oxygen Meter | Teledyne | AX-300 |
References
- Studer, L., et al. Enhanced proliferation, survival, and dopaminergic differentiation of CNS precursors in lowered oxygen. J Neurosci. 20 (19), 7377-7383 (2000).
- Chen, H. L., et al. Oxygen tension regulates survival and fate of mouse central nervous system precursors at multiple levels. Stem Cells. 25 (9), 2291-2301 (2007).
- Ling, L., et al. Chronic intermittent hypoxia elicits serotonin-dependent plasticity in the central neural control of breathing. J Neurosci. 21 (14), 5381-5388 (2001).
- Mitchell, G. S., et al. Invited review: Intermittent hypoxia and respiratory plasticity. J Appl Physiol. 90 (6), 2466-2475 (2001).
- Fuller, D. D., Zabka, A. G., Baker, T. L., Mitchell, G. S. Phrenic long-term facilitation requires 5-HT receptor activation during but not following episodic hypoxia. J Appl Physiol. 90 (5), 2001-2006 (2001).
- Fuller, D. D., Johnson, S. M., Olson, E. B., Mitchell, G. S. Synaptic pathways to phrenic motoneurons are enhanced by chronic intermittent hypoxia after cervical spinal cord injury. J Neurosci. 23 (7), 2993-3000 (2003).
- Baker-Herman, T. L., et al. BDNF is necessary and sufficient for spinal respiratory plasticity following intermittent hypoxia. Nat Neurosci. 7 (1), 48-55 (2004).
- Zhu, L. L., et al. Neurogenesis in the adult rat brain after intermittent hypoxia. Brain Res. 1055, 1-6 (2005).
- Zhang, J. X., Chen, X. Q., Du, J. Z., Chen, Q. M., Zhu, C. Y. Neonatal exposure to intermittent hypoxia enhances mice performance in water maze and 8-arm radial maze tasks. Journal of neurobiology. 65 (1), 72-84 (2005).
- Zhu, L. L., Wu, L. Y., Yew, D. T., Fan, M. Effects of hypoxia on the proliferation and differentiation of NSCs. Mol Neurobiol. 31 (1-3), 231-242 (2005).
- Ross, H. H., et al. In vivo intermittent hypoxia elicits enhanced expansion and neuronal differentiation in cultured neural progenitors. Exp Neurol. 235 (1), 238-245 (2012).
- Fuller, D. D., et al. Induced recovery of hypoxic phrenic responses in adult rats exposed to hyperoxia for the first month of life. J Physiol. 536 (Pt 3), 917-926 (2001).
- Fuller, D. D., Fregosi, R. F. Fatiguing contractions of tongue protrudor and retractor muscles: influence of systemic hypoxia. J Appl Physiol. 88 (6), 2123-2130 (2000).
- Baker, T. L., Fuller, D. D., Zabka, A. G., Mitchell, G. S. Respiratory plasticity: differential actions of continuous and episodic hypoxia and hypercapnia. Respir Physiol. 129 (1-2), 25-35 (2001).
- Marshall, G. P. 2nd, et al. Production of neurospheres from CNS tissue. Methods Mol Biol. 438, 135-150 (2008).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. (45), (2010).
