Summary
Cet article décrit la méthodologie de l'administration de courtes périodes de hypoxie intermittente à jour 1-8 rat ou de souris chiots postnatales. Cette approche suscite effectivement un niveau de tissu robuste »d'amorçage effet" sur les cellules progénitrices neurales cultivées qui sont récoltées dans les 30 min d'exposition à l'hypoxie.
Introduction
Le but de ce procédé est de fournir de manière efficace et reproductible des matchs intermittente systémique oxygène ambiant réduit de rongeurs nouveau-nés. La justification de l'utilisation hypoxie intermittente (IH) pour manipuler la biologie des cellules souches in vitro provient d'expériences de culture cellulaire dans laquelle la teneur en O 2 du milieu de croissance est modifiée. Plus précisément, par rapport à des conditions «standard» de 20% de O 2, de la culture prolongée de souches / progénitrices des cellules de populations de cellules dans 3% d'O 2 résultats à une prolifération accrue, une diminution de l'apoptose neuronale et un rendement accru de 1,2.
Ce groupe a une grande expérience de l'administration de IH systémique, et a mené des études approfondies sur le rôle de l'IH dans la plasticité respiratoire 3-7. Ce travail, et la découverte récente que IH chronique augmente la neurogénèse chez le rongeur CNS 8-10, constitue la base pour l'exploration de aiguë in vivohypoxie comme un stimulus de préconditionnement (ie., avant la récolte de tissu) sur la culture subséquente de cellules souches / progénitrices neurales (PNJ) 11. Remarquablement, lorsque les souriceaux ont été exposés à une brève période (<1 h) de l'hypoxie aiguë intermittente (AIH), les cellules qui ont été récoltées dans la zone sous-ventriculaire (SVZ) avaient augmenté de façon significative la capacité d'expansion que neurosphères ou monocouches de cellules adhérentes. Le protocole AIH était également associée à une expression accrue d'un "destinée neuronale" facteur de transcription (Pax6).
En conséquence, in vivo protocoles HAI peuvent fournir un moyen de «prime» PNJ avant la culture. Par exemple, les demandes de cette approche peuvent inclure l'expansion des populations de cellules avant la transplantation dans le système nerveux central blessé, ou augmentant simplement la différenciation neuronale de cellules en culture avant des expériences in vitro. En outre, parce que cela est une administration systémique, touteorgane, le tissu ou la cellule est un candidat pour étude similaire. Par conséquent, le protocole écrit est potentiellement applicable à une large gamme d'études sur la manipulation de l'oxygène intermittente chez les petits mammifères.
Il ya certains avantages à cette approche. Dans d'autres travaux publiés, les nouveau-nés ont été traités comme une litière avec le barrage en chambre hypobare, qui permet le dosage chronique, moins de manipulation avant le traitement, et maintenu le contact maternelle pendant le traitement 9. L'approche actuelle contourne traitements répétés à une femelle reproductrice, ou l'utilisation d'un barrage différent pour chaque expérience. Ce protocole permet également l'étude des nouveau-nés de la litière appariés et appariés pour l'âge précis. Les données représentatives démontrent un autre atout majeur de ce protocole, à savoir la rapidité avec laquelle AIH, tel que livré, provoque une réponse biologique puissante et cohérente dans neuronal la biologie des cellules souches. Cela établit un précédent pour ce protocole de susciter biologi tissulaire et cellulaire niveauCAL changements qui modifient la biologie cellulaire.
Le présent rapport décrit les procédures détaillées utilisées pour exposer rongeurs chiots à IAC ainsi que l'analyse de la population de cellules SVZ grandi comme neurosphères.
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Protocol
NOTE: Toutes les procédures d'animaux dans ce protocole sont menées avec l'approbation de l'Université de Floride institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité (IACUC) et sont en conformité avec le «Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire».
1. expérimentale de base mis en place avant l'administration intermittente hypoxie
- Exposer chiots 12 aux différents mélanges de gaz en utilisant un corps entier chambres de pléthysmographe souris de la même manière que les rongeurs adultes à d'autres fins expérimentales 5,13,14. Les chambres ont un diamètre de 4 pouces (volume = 450 ml), ce qui est de taille suffisante pour accueillir les souriceaux 3-4 ou 1-2 de jeunes rats. Ici, protocoles HAI sont livrés à des nouveau-nés âgés de jour postnatal 1-8 (P1-P8).
- Utilisez des réservoirs de gaz de l'air comprimé pour livrer le gaz de 21% "de base", qui maintient la chambre d'oxygénation à 21%. Pour atteindre "hypoxie relative", utiliser un / 90% réservoir de gaz d'azote de 10% d'oxygène.
NE PASE: tube en plastique (3/16 "de diamètre) relie les réservoirs de gaz à un débitmètre. Ainsi, l'entrée du compteur de débit est constitué d'un tube pour chaque ligne de base et le flux d'air hypoxie. - Configurer le tuyau de gaz comme suit.
- Exécuter un tube en plastique (1/8 "de diamètre) à partir du débitmètre à un régulateur de débit de polarisation, ce qui permet de flux 1 L / min à chaque chambre (à savoir, 4 L / min si les chambres 4 sont utilisés).
- Exécuter un tube en plastique (1/8 "de diamètre) à partir du régulateur d'écoulement de polarisation aux chambres de pléthysmographie. Airflow à 1 L / min à chaque chambre est un débit prédéterminé au cours de laquelle l'échange de gaz est réputé être non-stress induisant des animaux basés sur des observations physiologiques et comportementaux.
- Sceller toutes les connexions inutilisées depuis et vers l'unité de débit de polarisation et toutes les ouvertures inutilisées dans les chambres avec des bouchons de sorte qu'aucun écoulement de gaz échappe à d'autres chambres ne sont pas utilisés, ou sur des chambres d'Plethysmographie pendant le protocole.
- Placer la chambre (s) Dans un incubateur avant de mettre les animaux dans la chambre pour permettre l'équilibrage à 37 ° C, ou la température du corps.
2. Calibrage des temps de cycle pour l'hypoxie intermittente
- Inspectez tous les tuyaux, entre les réservoirs d'air et débitmètre, débitmètre et l'unité de flux de polarisation, et le flux de polarisation unité et la chambre (s) de pléthysmographie pour les connexions appropriées. Les connexions sont mis en place comme décrit à l'étape 1. Vérifiez la connexion d'un chèque par étapes de toutes les lignes et les fermetures décrites: par exemple, la vérification de lignes non utilisées hors de l'unité de débit de polarisation et des ouvertures de chambre ne sont pas utilisés.
- Connectez un capteur de température ambiante O 2 O 2 avec un compteur à main, puis fixez le capteur sur le couvercle de la chambre de pléthysmographie.
- Ouvrez les deux réservoirs de gaz et fixez une paire de pinces hémostatiques chirurgicaux, à long manche isolés avec des tubes en plastique pour bloquer le flux hors cycle du gaz. De cette façon, un seul réservoir de gaz à la fois met en œuvre le 1 L / min débit de gaz pour chambre. Fixer le "niveau de référence" mélange de gaz tandis que le "hypoxique" mélange de gaz est livré à la chambre, et vice versa.
- Noter le temps nécessaire pour que la chambre de O 2 pour atteindre les niveaux de 10% de cible et revenir à 21%. Utiliser les temps enregistrés pour la livraison de protocole ultérieur.
3. Administration de l'hypoxie aiguë intermittente
- Inspectez tous les tuyaux et les connexions comme décrit dans l'étape 2.1.
- Placez les nouveau-nés dans la chambre (s) de pléthysmographie et abriter les couvercles des chambres de pléthysmographie dans la base de chambre. Confirmer une bonne étanchéité à l'joint torique est ainsi que la fermeture de toutes les connexions de chambre inutilisés. Ces étapes sont essentielles pour assurer la bonne exécution des mélanges de gaz.
- Placez les chambres de retenue les chiots à être traités dans le 37 ° C incubateur et fermer la porte. Laisser chambre à équilibrer à 37 ° C avant le début du protocole. Maintenir les animaux témoins à 37 ° C dans le Incubatou à l'air ambiant oxygénation.
- Ouvrez les deux réservoirs de gaz et d'utiliser une paire de pinces hémostatiques chirurgicaux, à long manche isolés avec des tubes en plastique pour bloquer le flux hors cycle du gaz. De cette façon, un seul réservoir de gaz à un moment administre le 1 L / flux de gaz min par chambre.
- Utilisez une minuterie à main pour précisément cycles de temps et d'indiquer le temps de passer les pinces hémostatiques entre tubes, entraînant ainsi l'alternance du flux de gaz dans les chambres.
- Constater la réalisation de chaque cycle à l'aide d'un journal de traitement tel que celui fourni dans la Figure 1 pour marquer toutes les étapes du 2-step, 20 protocole de cycle.
- Surveiller la température de l'incubateur à chaque changement de cycle pour assurer que les animaux sont maintenus à la gamme désigné (33-35 ° C, ce qui est le réglage de l'incubateur qui se traduit par 37 ° C).
- Surveiller de près l'activité des petits tout au long du protocole afin d'assurer que les animaux tolèrent cycles sans détresse visibles tels que les vocalisations, altération de l'étatactivité de membre ou de roulement.
4. Isolement et culture de cellules souches / progénitrices de la zone sous-ventriculaire
REMARQUE: Le changement dans la formation de neurosphère suivante AIH rapport aux témoins est un exemple d'un point de terminaison qui démontre l'efficacité de ce protocole pour obtenir des changements Tissue et au niveau cellulaire.
- Pour isoler neurosphères formant des cellules, retirez rat ou de souris chiots de la chambre immédiatement après AIH est terminée. Sacrifier les animaux selon des protocoles IACUC dans les 30 minutes de la fin du protocole.
- Récolter le tissu SVZ, placer dans la culture de neurosphère et mener passage standard et expansion de neurosphères dérivés, comme précédemment publié dans les méthodes chapitres 15,16 et un protocole de vidéo séparée 8.
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Representative Results
Les premières expériences, basées sur des données historiques, ont été effectuées en utilisant des longueurs de cycle 1 min. Sur la base des calibrations ultérieures effectuées à l'étape 2 ci-dessus, on a déterminé que le niveau d'O 2 dans la chambre était de 13% à 1 min post-rinçage et l'hypoxie, qu'il a fallu un temps similaire pour revenir à la ligne de base de 21%. Cependant, un cycle de 2 min est suffisante pour atteindre à la fois 10% d'oxygène et un retour à 21% au cours du cycle «de référence». Par la suite, la durée du cycle 2 min ont été utilisés. La durée du protocole est composée de 20 cycles alternant entre l'inclusion et l'hypoxie (80 min de temps de traitement global). Une durée de cycle 20 a été choisie en raison de travaux antérieurs montrant que cette durée du cycle est suffisante pour susciter des changements dans les résultats respiratoire 11 mesures. Utilisation de la décrit mis en place (Figure 2), les nouveau-nés soumis à AIH avait pas d'événements indésirables apparents et ne présentent pas de comportements suggestifs de la douleur et de l'inconfort lors de la 80protocole min. Plus précisément, l'apnée pas visible a été observé, de membres ou la tête des mouvements excessifs, ou vocalisations. Suite à AIH, des populations de cellules-ventriculaire zone dérivé de neurones souches / progénitrices cultivées comme neurosphères pendant 14 jours (et des populations monocouches aussi comme adhérentes, données non représentées) présentent une augmentation de près de deux fois plus de diamètre, ce qui démontre l'expansion accrue au sein de chaque domaine de formage (Figure 3). Les cellules sont ensuite étalées dans des conditions permissives (par exemple, absence de facteurs mitogenes) produisent significativement plus de cellules bêta-3-positif (une augmentation de <10% et> 45%) ce qui indique plus grande différenciation neuronale par rapport aux cellules récoltées à partir de normoxique traités (témoins) chiots (figure 4).
Figure 1. Cette feuille aiguë record IH est utilisé pour documenter les animaux et les détails expérimentaux, fournissent une liste de contrôle pour Avant le départ et après l'achèvement du protocole de IH, et servent de document de suivi pour connaître précisément tous les cycles achevés.
Figure 2. hypoxie intermittente mis en place pour rongeurs nouveau-nés. (A) Incubateur à maintenir un environnement à 37 ° C. Pléthysmographie chambre est disponible à l'intérieur de l'incubateur, et de nouveau avec la porte de la chambre entrouverte (B). (C) Droit, débitmètre ajusté à 1 l / min pour chaque chambre. Le débit de gaz est dirigé par l'unité unité de séparation des flux de polarisation (centre) pour toute chambre connecté (à gauche, au sein de l'incubateur). (D) contrôle hémostatique de base (bande rouge) et l'hypoxie (bande jaune) lignes d'entrée. ank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. neurosphères de contrôle (A) démontrent un diamètre inférieur à AIH neurosphères (B). Images prises à 10X objectif, barre d'échelle = 100 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. neurosphères de contrôle (A) démontrent moins de neuroblastes bêta-3-tubuline positif que neurosphères AIH (B). Images prises à 20X objectif, barre d'échelle = 50 um.g "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse plethysmography chambers | Buxco | PLY4211 | |
| Flow meter | Porter | F150 | |
| Bias flow unit | AFPS | ||
| Baseline Gas Mix | Airgas | AIZ300 | Compressed Air |
| Hypoxic Gas Mix | Airgas | X03NI72C2000189 | 10% Oxygen, balance nitrogen |
| Oxygen Meter | Teledyne | AX-300 |
References
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