Protocol
Study godkjenning: De eksperimentelle protokollene ble godkjent av det italienske helsedepartementet (Roma, Italia) i henhold til Decreto Legislativo 27 gennaio 1992, n. 116 "Attuazione della Direttiva n. 86/609 / CEE i materia di protezione degli animali utilizzati en fini sperimentali o annonse altri fini scientifici."
1. Innhenting hudprøver
- Avlive mus ved halshugging.
- Øre:
- Skjær ut den hårløse delen av ørene på musen.
- Separat dorsal og ventral side ved å dra dem fra hverandre med pinsett. Fjern eventuelle gjenværende brusk ved å forsiktig skrape den indre delen av ørene med tang.
- Trunk hud:
- Barbere hele huden på dyret både med en elektrisk barberhøvel og med delikat riktige lotion.
- Klipp av ønsket hudprøve (fra 2 cm 2 opp til hele dyr huden).
- Hvis kutte av hele rygg og ventral mus hud, gjør et vertikalt snitt i midten av musen tilbake og deretter klippe langs grensene til de barberte områdene rundt musekroppen.
- Forsiktig skille huden fra peritoneum og ryggmuskler, holde huden prøven alltid med pinsett mens separering av huden prøven med lukket rund kantet tuppen av en kirurgisk saks eller en skalpell.
- Forbered en 100 mm cellekultur plate som inneholder 10 ml iskald PBS.
- Fjerne subkutant fett ved å senke huden prøven i PBS i platen fremstilt i trinn 1.3.3 og skrape huden prøven med pinsett.
- Hale:
- Skjær av halen av musen.
- Lage et vertikalt snitt på halen med kirurgiske sakser eller kirurgisk skalpell, med start fra halebasen og rekker til enden av halen.
- Bruk pinsett til å løsne huden fra halen. Ta tak i kanten av kuttet ved haleroten og dra forsiktig mot tuppen mens du holderlegeme av halen med pinsett.
- Fjern overflødig fett ved å forsiktig skrape huden prøven.
- footpad
- Kutt ut hele musen foten med kirurgisk saks. Unngå å kutte noen hårete hud.
- Kutt i huden av foten i lengderetningen fra ankelen til begynnelsen av sifrene.
- Hold ankelen bein med pinsett eller for hånd mens gripe huden med pinsett og dra huden mot sifrene som om å ta av en hanske.
2. Fordøyelse
- Klargjør fordøyelsen cocktail fra stamløsning (fremstilt som i materialliste) med følgende oppskrift: Enzym mix (se Materialer List for spesifikasjoner) 300 mikrogram / ml, DNAse1 50 U / ml. Spe i RPMI 5% FBS.
- Hakk hudprøver med saks i små biter i en 35 mm petriskål med 2 ml Fordøyelse Cocktail (For trunk hud: 2 ml Fordøyelse Cocktail hver 2 cm 2 av huden, opptil 3 ml totalt).
- Inkuber ved 37 ° C i 90 min. Rist petriskålen 1-2 ganger under inkubasjon.
- Hell fordøyd hudprøver på en 70 mikrometer celle sil i 66 mm petriskål inneholdende 1 ml RPMI1640 5% FBS.
- Vask filteret med 5 ml RPMI 1640 5% FBS.
- Klem prøven gjennom celle sil med en sprøytestempelet.
- Flush stempelet, petriskål og sil med 20 ml RPMI 1640 5% FBS, overføre til 50 ml tube.
3. Antistoffer og merking
- Vask den oppnådde suspensjonen to ganger med 5 ml PBS 1% FBS (eller BSA).
- Etiketten den oppnådde cellesuspensjonen med de ønskede antistoffer.
- Resuspender prøvene i 100 ul / prøve av en blanding inneholdende 2 ug / ml av aCD16 / CD32 (klon 2.4G2) fortynnet i PBS 1% FBS.
- Inkuber i 15 minutter ved 4 ° C for å blokkere ikke-spesifikk binding av de ønskede antistoffene via Fc-reseptorer.
- Legg antistoffene som er angitt i tabell1.
- Fremstille en blanding fortynning av de ønskede antistoffer i 100 ul / prøve av PBS 1% FBS ved en konsentrasjon på 4 ug / ml.
- Tilsett 100 ul av blandingen fremstilt i trinn 3.2.3.1 til hver prøve, slik at det i røret, vil det være et volum på 200 pl av antistoffblandingen til en sluttkonsentrasjon på 2 ug / ml.
- Inkuber i 30 minutter ved 4 ° C og omfatter fra lys.
- Vask med 1 ml PBS 1% FBS, sentrifuger i 5 minutter ved 400 xg, kast supernatanten og resuspender i 300 ul PBS 1% FBS.
- Legg DAPI ved en sluttkonsentrasjon på 2 ug / ml og inkuberes ved 4 ° C, beskyttet mot lys i 10 min.
- Analysere prøvene oppnådd ved FACS.
- For å isolere leukocytter brukes følgende gating strategi:
- Først eliminere eventuelle døde celler ved gating på DAPI- befolkningen.
- Velg singlets i FSC-A vs. FSC W tomten som angitt i figur 1
- Gate cellene basert på størrelse og detalj typisk for leukocytter av interesse.
- Velge CD45 + celler i FSC-A CD45 plott som vist i figur 1.
- Skille de forskjellige populasjoner av leukocytter ved ekspresjon av overflatemarkører som følger:
- Identifisere DC som CD11c + MHC II + celler. Disse kan senere analysert for uttrykk av CD207 å skille Langerhans celler og CD207 + Dermal DC fra CD207- Dermal DC.
- Identifisere Makrofager som CD64 + F4 / 80 + celler.
- Identifisere B-celler som CD19 + MHCII + celler.
- Identifisere T-celler som CD8 + eller CD4 + -celler.
- For å isolere leukocytter brukes følgende gating strategi:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hud fra forskjellige regioner av kroppen ble spaltet i henhold til den protokoll som er beskrevet og farget med de angitte antistoffer. Portstyringsstrategi er vist i figur 1. Først velger levende celler (DAPI- celler), og deretter port på singletter (FSC-A vs. FSC-W) og på celler med lymfocytt-morfologi (FSC-A vs. SSC-A). Når angitt, er CD45 + -celler fra hematopoetisk opprinnelse valgt.
DC er merket med anti-CD11c, -MHCII, og -CD45 antistoffer, blir Makrofager identifisert som F4 / 80 + CD64 + CD45 + celler, B-celler som CD19 + CD45 + MHCII + celler, CD4 + T-lymfocytter som CD4 + CD45 + celler, og CD8 + T-lymfocytter som CD8 + CD45 + celler (figur 2).
Denne metoden guarantees høy levedyktighet av spaltet befolkningen med mer enn 50% av totalt antall levedyktige celler (DAPI-) i alle områder av huden som blir analysert (figur 3A). En indikasjon på det antall CD45 + -celler, hvilket ga per cm 2 er vist i figur 3B.
Et estimat av det totale antall DC, makrofager, B-celler og CD4 + eller CD8 + T-celler kan oppnås fra spalting av en cm2 av hud mus er vist i figur 3C.
Figur 1. Identifikasjon av celler av hematopoietisk opprinnelse i huden encellede suspensjoner. Encellede suspensjoner har blitt farget med DAPI og anti-CD45 antistoff. Blant levende celler (DAPI-negativ), singlets (FSC-A vs FSC-H) er analysert for å velge celler med leukocytter morfologi (FSC-A versus SSC-A). Celler av hematopoietisk opprinnelse er identifisert som CD45 +.
Figur 2. Analyse av immunceller tilstede i musehud avledet fra forskjellige regioner. Celler blir gated som antydet i figur 1. DC er identifisert som CD11c + MHC II + CD45 + celler, og senere farget med CD207 for å skille Langerhans-celler og CD207 + dermal DC fra CD207 -; Makrofager er identifisert som CD64 + F4 / 80 + CD45 + celler; T-lymfocytter er delt i CD8 + CD45 + celler og CD4 + CD45 + celler; B-celler er identifisert som MHCII + CD19 + CD45 + celler. Prosenter henvises til den totale CD45 + celler.
Figur 3. Kvantitativ analyse av immunceller tilstede i musehud fra forskjellige regioner (A) Prosent av levedyktige. (DAPI -) celler avledet fra de angitte områder av musehud. (B) Absolutte tall CD45 + celler i de forskjellige regioner av musehud uttrykt i antall celler pr cm2 av huden. (C) Vurdering antall DC, Mii, B-celler og CD4 + eller CD8 + T-celler som stammer fra en cm 2 av hud fra de angitte områder av mus hud.
| antistoff | farging | Konsentrasjon | Tid | Temperatur |
| DCBlande | ||||
| CD11c | PE-Cy7 | 2 ug / ml | 30 min | 4 ° C |
| MHC II | PE | " | " | " |
| CD45 | PE-Cy5.5 | " | " | " |
| CD207 | APC | " | " | " |
| Makrofager Mix | ||||
| F4 / 80 | APC-Cy7 | 2 ug / ml | 30 min | 4 ° C |
| MHC II | PE | " | " | " |
| CD45 | PE-Cy5.5 | " | " | " |
| CD64 | PE-Cy7 | " | " | " |
| T- og B-celler Mix | PE | 2 ug / ml | 30 min | 4 ° C |
| CD4 | APC-Cy7 | " | " | " |
| CD19 | APC | " | " | " |
| CD45 | PE-Cy5.5 | " | " | " |
Tabell 1. Indikasjoner for farging av forskjellige populasjoner av immunceller fyller huden. Tre mikser indisert for farging av DC, makrofager og lymfocytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrevet en fremgangsmåte for fremstilling av enkeltcellesuspensjoner fra forskjellige mus hud regioner. Metoden for fordøyelsen vi har vedtatt, ikke bare gir høy avkastning, men bevarer også uttrykk for overflatemarkører, som er grunnleggende for den påfølgende FACS analyse.
Bruken av en cocktail av kollagenase I og II og termolysin, garanterer minimum batch til batch-forskjeller i enzymaktivitet som gjør denne fremgangsmåten meget reproduserbar. Andre publiserte metoder er avhengige av forskjellige enzym cocktailer, men i våre hender gir de lavere avkastning og, enda viktigere, er mindre reproduserbar. Vår metode er imidlertid ikke diskriminerer mellom celler fyller epidermis og celler fyller dermis. Siden det i mange tilfeller kan det være nyttig å skille mellom disse to forskjellige avdelinger, vi direkte leseren til disse tidligere arbeider som bruker slike fremgangsmåter. 15
I vår erfaring hudprøves fra øret og hale er lettere å fordøye enn stammen huden hvor det subkutane fettsjiktet må være grundig skrapes for å gjøre dermis tilgjengelig for enzymet cocktail. Den de-smøring trinn, men i tillegg til skjære skal utføres raskt og skånsomt for å opprettholde cellenes levedyktighet. En langvarig eller for grundig avfetting trinnet kan føre til skade på immunceller bosatt i huden og derfor resultere i mye lavere yield og redusert levedyktighet av innhentede celler.
Det bør også bemerkes at for å bevare integriteten til overflatemarkører, bør fordøyelse utføres i et medium fritt for reduksjonsmidler slik som β-merkaptoetanol. For å unngå uønsket skade på overflatemarkører, bør inkubasjonstiden holdes så korte som mulig, og i ethvert tilfelle ikke forlenget med mer enn 90 min.
Spesiell forsiktighet bør, også, tatt da helle fordøyd hudprøver inn i cellensil. Det er viktig å grundig vaske spaltet hud for å vaske bort den frigjorte cellene før knusende den fordøyde prøven med sprøytestempelet. Med dette trinnet huden prøve vaskes fra den frigjorte immunceller som da ikke har gjennomgått noen mer fysisk stress. Ødeleggelsen bør også utføres forsiktig for ikke å drepe eventuelle celler og både cellefilter og sprøytestemplet bør være grundig vasket i det etterfølgende vasketrinn.
Hud spaltning kan også utføres i et 50 ml Falcon i et vannbad ved 37 ° C. I dette tilfelle huden kan hakkes på forhånd, og deretter satt inn i Falcon-røret. Legg merke til at huden prøvene bør alltid være neddykket i fordøyelsen buffer under inkubasjon og at øre-stykker holde seg til sidene av Falcon rør. Ved bruk av Falcon rør, derfor sørge for at bitene av hakket hud opphold nedsenket i fordøyelsen medium.
Denne fremgangsmåte kan være nyttig i maNY ulike eksperimentelle innstillinger, spesielt når man studerer ikke-betent hud. I løpet av betennelse, vasodilatasjon og vev svelling løsne strukturen av vev og immunceller fra blod er massivt rekruttert til huden. Effektiviteten av cellen utvinning er således mye høyere. I homeostatiske betingelser, en effektiv måte å fordøye den stramme kollagenmatriksen av dermis er faktisk nødvendig for å gjenopprette immunceller som utgjør den komplekse nettverk fyller huden.
Leseren kan også være interessert i en omfattende gjennomgang som dekker opprinnelsen og fenotype forskjellige dendrittiske celler og makrofager fyller huden i både homeostatiske og inflammatoriske tilstander. 16
I ulike eksperimentelle innstillinger, kan ulike deler av mus hud behandles. For eksempel, i hud transplantasjonsmodeller, en del av halen kan bli transplantert på stammen av en mottagende dyr; når studying ødemdannelse eller immuniseringsprosedyrer, blir stimuli ofte injisert på fotputen hos mus, mens øret blir ofte brukt for å evaluere T-celle hukommelse med DTH-analyser. Med vår metode kan vi effektivt pakke huden bosatt immunceller fra forskjellige steder gjør vår metode nyttig for den eksperimentelle innstillingen av valget.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Supplemented RPMI 1640 medium | RPMI1640 supplemented w/ L-glu, pen-strep w/o beta mercapto ethanol | ||
| PBS | |||
| FBS | |||
| Liberase TM (Enzyme Mix) | Roche | 5401119001 | resuspend [2.5 mg/ml] in dH2O; store aliquots at -20 °C |
| Dnase I | Sigma | D4263-1VL | resuspend in RPMI 1640 w/o serum [1,000 U/ml] |
| Materials | |||
| Surgical Scissors | |||
| Surgical Forceps | |||
| Surgical Scalpel | |||
| 35 mm Petri dishes | |||
| 66 mm Petri dishes | |||
| 100 mm Petri dishes | |||
| 70 µm Cell Strainers | BD | 352350 | |
| Digestion cocktail | Dilute in RPMI 5% FBS | ||
| LIberase TM | 300 µg/ml | ||
| DNAse1 | 50 U/ml | ||
| Antibodies | |||
| Name | Company | Clone | Label |
| aCD45.2 | 104 | PE-Cy5.5 | |
| aCD11c | N418 | PE-Cy7 | |
| CD11b | M1/70 | FITC | |
| F4/80 | A 3-1 | APC-Cy7 | |
| aCD4 | Gk1.5 | APC-Cy7 | |
| aCD8 | 53-6.7 | PE | |
| aCD64 | X54-5/7.1 | PE-Cy7 | |
| aCD207 | 4C7 | APC | |
References
- Streilein, W. J. Circuits and signals of the skin-associated lymphoid tissues (SALT). Journal of Investigative Dermatology. 85 (1 Suppl), 10s-13s (1985).
- Tay, S. S., Roediger, B., Tong, P. L., Tikoo, S., Weninger, W.
- Shen, W., et al. Adaptive immunity to murine skin commensals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), E2977-E2986 (2014).
- Broggi, A., Zanoni, I., Granucci, F. Migratory conventional dendritic cells in the induction of peripheral T cell tolerance. Journal of leukocyte biology. 94 (5), 903-911 (2013).
- Pan, J., et al. DCs metabolize sunlight-induced vitamin D3 to'program'T cell attraction to the epidermal chemokine CCL27. Nature Immunology. 8 (3), 285-293 (2007).
- Vitali, C., et al. Migratory, and not lymphoid-resident, dendritic cells maintain peripheral self-tolerance and prevent autoimmunity via induction of iTreg cells. Blood. 120 (6), 1237-1245 (2012).
- Azukizawa, H., et al. Steady state migratory RelB+ langerin+ dermal dendritic cells mediate peripheral induction of antigen-specific CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T cells. European journal of immunology. 41 (5), 1420-1434 (2011).
- Idoyaga, J., et al. Specialized role of migratory dendritic cells in peripheral tolerance induction. The Journal of clinical investigation. 123 (2), 844-854 (2013).
- Boyman, O., Conrad, C., Tonel, G., Gilliet, M., Nestle, F. O. The pathogenic role of tissue-resident immune cells in psoriasis. Trends in immunology. 28 (2), 51-57 (2007).
- Di Meglio, P., Perera, G. K., Nestle, F. O. The multitasking organ: recent insights into skin immune function. Immunity. 35 (6), 857-869 (2011).
- Rosenblum, M. D., et al. Response to self antigen imprints regulatory memory in tissues. Nature. 480 (7378), 538-542 (2011).
- Rosenblum, M. D., Truong, H. A., Abbas, A. K., Gratz, I. K. 177: Maintenance of memory regulatory T cells in peripheral tissues. Cytokine. 63 (3), 284-285 (2013).
- Kim, B. S., et al. TSLP elicits IL-33-independent innate lymphoid cell responses to promote skin inflammation. Science translational medicine. 5 (170), (2013).
- Gopinathan, K. M. New insights into skin structure: scratching the surface. Advanced drug delivery reviews. 54 (Suppl 1), S3-S17 (2002).
- Sandrine, H., et al. CD207+ CD103+ dermal dendritic cells cross-present keratinocyte-derived antigens irrespective of the presence of Langerhans cells. The Journal of Experimental Medicine. 207 (1), 189-206 (2010).
- Bernard, M., Samira, T., Sandrine, H. The origins and functions of dendritic cells and macrophages in the skin. Nature Reviews Immunology. 14 (6), 417-428 (2014).
