Introduction
O ciclo celular bacteriana controla a replicação do genoma e a divisão de células filhas. É importante salientar, como a resistência aos antibióticos é uma ameaça crescente para a saúde pública, o ciclo celular bacteriana apresenta um alvo inexplorado para o desenvolvimento de antibióticos.
No bactéria Caulobacter crescentus, cada ciclo celular conduz a uma divisão assimétrica, obtendo-se duas células filhas de destinos diferentes (Figura 1A) 1,2. Uma célula filha herda um flagelo e é móvel, enquanto a outra filha herda uma haste e é séssil. Um circuito genético integrado controla a progressão do ciclo celular e destino celular por regulação da transcrição, fosfo-sinalização, e proteólise regulamentado 3. Além disso, a replicação do cromossoma e células filhas segregação de rendimento concomitantes que contêm uma cópia exacta do cromossoma 4. É importante notar que estes dois tipos de células podem ser rapidamente separados por colloidal de partículas de sílica de centrifugação de densidade na estirpe sincronizável NA1000 5-7 permitindo o isolamento das células swarmer do resto da população com rendimentos elevados (Figura 1B). Isolado swarmer células em seguida, proceder de forma síncrona através da divisão celular assimétrica. Aqui, nós detalhe o protocolo utilizado para a sincronização de Caulobacter NA1000 estirpe. Nós fornecemos protocolos e dicas de solução de problemas comuns para ambos de grande e pequena escala sincronizações. Este procedimento experimental proporciona uma ferramenta poderosa para interrogar o controlo espacial e temporal da Caulobacter ciclo celular e o destino celular.
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Protocol
1. grande escala Synchrony - Optimal para Western Blot, Microarray / RNA-Seq, e outros ensaios Intensivo de materiais
- A partir de um estoque congelador ou uma placa, um crescer 5 ml O / N cultura da estirpe NA1000 por agitação a 28 ° C em meio PYE.
- Inocular 0,5 ml de células a partir do passo 1 em 25 ml de M2G (Tabelas 1-2) e agitar a 28 ° C até a cultura atingir uma OD 600 entre 0,5 e 0,6.
- Inocular as células em 1 L de M2G e agitar a 28 ° C.
- Uma vez OD 600 atinge 0.5 a 0.6, confirmar a presença de swarmer células usando microscopia de fase líquida montado. Ponto 1 ml de células em uma lâmina de vidro, cubra com uma tampa de deslizamento e imagem por meio de microscopia de fase. Confirmar a presença de células Swarmer, visualizando as células rapidamente natação na população.
- Girar células durante 15 min a 7 kxg a 4 ° C num rotor JA-10.
- Desprezar o sobrenadante e adicionar 180 ml de frio M2 (Tabelas 1-2) e res delicadamenteuspend todas as células utilizando uma pipeta serológica. Descarte células frouxamente peletizadas; eles são células predivisional e saiu.
- Adicionar 60 ml de solução de sílica coloidal fria (não se esqueça de misturar a suspensão de sílica coloidal bem antes de adicionar às células) e misturar a suspensão de células bem.
- Verter a suspensão de células em oito tubos de 30 ml e girar durante 30 min a 6,4 kxg a 4 ° C num rotor JA-20.
NOTA: Deve-se ver duas bandas distintas; a banda swarmer é a banda inferior, enquanto espreitavam / células predivisional estão na faixa superior (Figura 1B). - Aspirar cuidadosamente a banda superior e retire o líquido a ~ 1 cm acima da banda swarmer (a banda inferior).
- (Crítica) Usando uma pipeta Pasteur, retire cuidadosamente a banda swarmer e coloque em um tubo limpo. Para lavar a sílica coloidal, parte superior do tubo fora com frio M2 e centrifugação durante 10 min a 6,4 kxg a 4 ° C num rotor JA-20.
- Descartar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender oas células em 20 ml de frio M2 e rotação durante 10 min a 6,4 kxg a 4 ° C num rotor JA-20.
- Ressuspender todas as pelotas em 30 ml de frio M2 e medir o OD 600 usando um espectrofotômetro e em branco, utilizando meio M2 frio. Salve 1 ml para a imagem latente fase para verificar se há swarmer células; 90-95% das células devem ser Swarmers.
- Girar as células durante 5 min a 6,4 kxg a 4 ° C num rotor JA-20. Ressuspender as células em meio de 28 ° C de modo que o M2G A 600 é ~ 0,3-0,4 e começar agitação a 28 ° C.
NOTA: Os rendimentos típicos são entre 30 e 60 mL de swarmer cultura de células de 1L de células não sincronizadas. - Comece a tomar pontos no tempo (cultura de tipo selvagem levará aproximadamente 135-140 minutos para dividir) 8,9. Em cada ponto de tempo, medir o OD 600. Verifique se o OD 600 após a divisão é de aproximadamente 2X o OD inicial 600.
- Para blot ou de expressão de genes ensaios ocidentais, retirar alíquotas de 1 mL do cuLTURE nos momentos desejados, girar na velocidade máxima em uma centrífuga de mesa para 30 seg, rapidamente decantar ou aspirar o meio, e flash congelar o pellet celular em nitrogênio líquido. Armazenar as células à temperatura de -80 ° C até à análise a jusante.
2. pequena escala Synchrony - Optimal de Microscopia
- A partir de um estoque congelador ou uma placa, crescer uma cultura de 5 ml O / N com agitação a 28 ° C em M2G.
- Diluir em 15 ml de M2G (Tabelas 1-2) e crescer até meados de log (OD 600 = 0,5-0,6).
- Rotação em 6,4 kxg durante 10 min a 4 ° C num rotor JA-20, e ressuspender em 1 ml M2 frio (Tabelas 1-2) e transferência para um tubo de microcentrifugação de 2 ml.
- Centrifugação 15 kxg durante 3 min num tubo de microcentrífuga para sedimentar as células, aspirar o sobrenadante, o sedimento colocado em gelo, e ressuspender em 900 ul de frio M2.
- Adicionar 900 ul de PVP frio revestido de sílica coloidal e centrifugação durante 20 min a 15 kxg a 4 ° C num microfonetubo rocentrifuge.
- (Critical) Aspirar ou pipeta fora do topo perseguido banda de células predivisional / e recolher o fundo swarmer banda em um novo tubo de microcentrífuga.
- Lavar as células duas vezes swarmer em 1 ml de frio, enquanto M2 centrifugação a 15 kxg durante 3 min.
- Antes da centrifugação final, mover as células em 1 ml de um tubo de ensaio de vidro pré-gelada e medir a DO 600 das células em comparação com um branco de M2.
- Ressuspender o sedimento celular final a 28 ° C a uma DO M2G entre 0,3-0,4 e agitar células / rolo a 28 ° C.
NOTA: Os rendimentos típicos são entre 2 e 4 ml de cultura de células swarmer. - Para experimentos de microscopia, nos momentos lugar 1 ml de células desejado para uma almofada de agarose M2G para geração de imagens.
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Representative Results
Sincronização normalmente produz duas bandas de células (Figura 1B): a banda swarmer, que tem uma densidade mais elevada, e uma banda de células perseguido / predivisional de menor densidade. Para garantir controles comuns de sincronização eficiente incluir o acompanhamento da OD 600 e medição dos níveis de proteína CtrA por western blot no ciclo celular momentos distintos. O OD 600 deveria aumentar em cerca de 2 vezes durante o decurso do ciclo celular (Figura 2). O western blot para o mestre regulador do ciclo celular CtrA é um controle útil para verificar uma boa sincronia (Figura 2). CtrA é utilizado na célula swarmer para bloquear a replicação do ADN e que é degradada após o início da replicação de ADN 10. CtrA é então sintetizado mais tarde no ciclo celular e activa a transcrição de uma série de genes de desenvolvimento, incluindo diversos componentes do flagelo 11,12. A sincronia bem sucedido terá tseu padrão de oscilação dos níveis de proteína CtrA.
Figura 1. O ciclo celular de Caulobacter crescentus. (A) Um esquema dos desenhos animados do ciclo celular swarmer. As células swarmer diferenciar em células de replicação desengaçados competentes retraindo pili, ejetando flagelos, e iniciar a replicação do DNA. Os círculos e teta estruturas mostradas dentro dos contornos celulares representam cromossomos quiescentes e replicar. As células então progredir através do ciclo celular a construção de um único flagelo no pólo oposto do caule. Após a divisão, dois tipos de células únicas são gerados, uma replicação bloqueada móveis swarmer celular e uma célula estacionária competente replicação perseguido. (B) Os resultados representativos para centrifugação de densidade. Lower densidade perseguido e predivcélulas isional flutuar perto do topo do gradiente, enquanto densa swarmer células acabam em direcção ao fundo do tubo. Barras de escala são de 1 mm em imagens de microscopia de fase. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Os resultados representativos para um bem sucedido swarmer sincronia celular. A massa celular medida por OD 600 deve aumentar lentamente e finalmente dobrar durante todo o curso do ensaio. Alíquotas de 1 mL foram pipetadas para cuvetes de plástico a partir de uma grande sincronia celular e a DO600 medido utilizando um espectrofotómetro a pontos de tempo indicados. Além disso, o ciclo celular mestre proteína reguladora CtrA deve estar presente na célula swarmer para bloquear a replicação do ADN, seguido de uma rápida degradaçãocoincidente com a iniciação da replicação de ADN. CtrA é então regenerado mais tarde no ciclo celular para activar a expressão de muitos genes de desenvolvimento, incluindo componentes flagelares e pili críticos. As transferências de Western para mestre ciclo celular proteína reguladora CtrA foram realizadas utilizando-se alíquotas de 1 ml de uma sincronia de grande escala. As células foram ressuspensas em 250 ul de tampão de amostra Laemmlli por OD 600, separado num 10% de TRIS-GLY PAGE, transferidas para PVDF, e colocados a hibridar com anticorpo anti-CtrA. Procedimentos sincronia falhados levar a CtrA Western blot, sem qualquer alteração nos níveis de proteína. α-CtrA anticorpo 12 foi incubada a uma diluição de 1: 10.000, durante 1,5 h em 3% de leite em TBST e lavadas 3 vezes em TBST. Cabra-α-coelho secundário foi então adicionada a diluição 1: 10.000 em 3% de leite em TBST durante 1 hora, lavou-se 3 vezes com TBST, e fotografada em filme usando um estojo de detecção quimioluminescente. Por favorclique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Na 2 HPO 4 | 17,4 g |
| KH 2 PO 4 | 10,6 g |
| NH4Cl | 10 g |
| H2O | Ressuspender em 1 L & autoclave |
Tabela 1. 20X M2 Sais Receita.
| 20X M2 Sais | 50 ml | |
| 0,5 M MgSO4 | 1 mL | |
| 20% de Glucose | 10 ml | Substituto para H 2 O em M2 |
| Sulfato Ferroso Solution Chelate | 1 mL | |
| 0,1 M de CaCl2 | 5 ml | Adicionar último a avprecipitação oid |
| H2O | Encha-se de 1 L | |
| Efectuar a filtração estéril com filtros de 0,22 | iM |
Tabela 2. M2 e M2G receita.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PVP Coated Colloidal Silica (Percoll) | Sigma-Aldrich | P4937 | |
| Colloidal Silica (Ludox AS-40) | Sigma-Aldrich | 420840 | |
| JA10 Rotor | Beckman-Coulter | 369687 | |
| JA20 Rotor | Beckman-Coulter | 334831 | |
| Ferrous Sulfate Chelate Solution | Sigma-Aldrich | F0518 | |
| 30 ml Centrifuge Tubes | Corning | 8445 | |
| Na2HPO4 | EMD | SX0720-1 | |
| KH2PO4 | VWR | BDH9268-500G | |
| NH4Cl | Amresco | 0621-500g |
References
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