Abstract
L'expression des gènes et son règlement sont très importantes pour comprendre le comportement des cellules dans des conditions différentes. Diverses techniques sont utilisées de nos jours pour étudier l'expression des gènes, mais la plupart sont limités en termes de fournir une vue d'ensemble de l'expression de l'ensemble du transcriptome. Les puces à ADN offrir une technologie de recherche rapide et économique, qui donne un aperçu complet de l'expression globale des gènes et avoir un grand nombre d'applications, y compris l'identification de nouveaux gènes et facteur de transcription sites, la caractérisation de l'activité transcriptionnelle des cellules et lient également aider à analyser des milliers des gènes (en une seule expérience). Dans la présente étude, les conditions pour bactérienne analyse du transcriptome de la récolte de cellules à l'analyse des microréseaux d'ADN ont été optimisés. Prenant en compte le temps, les coûts et la précision des expériences, cette plate-forme de la technologie se avère très utile et universellement applicabale pour étudier transcripto bactériennemes. Ici, nous effectuons l'analyse des microréseaux d'ADN avec Streptococcus pneumoniae comme une étude de cas en comparant les réponses de la transcription de S. pneumoniae cultivées en présence de concentrations de L-sérine dans le milieu variable. L'ARN total a été isolé en utilisant un procédé Macaloid en utilisant un kit d'isolement d'ARN et la qualité de l'ARN a été vérifiée en utilisant un kit RNA de contrôle de la qualité. L'ADNc a été préparé en utilisant la transcriptase inverse et les échantillons d'ADNc ont été marquées avec l'une des deux colorants fluorescents réactifs avec les amines. Diapositives de microréseaux d'ADN maison ont été utilisés pour l'hybridation des échantillons d'ADNc marqués et les données de puces à ADN ont été analysés en utilisant un cadre de données des puces à ADN de pré-traitement (Microprep). Enfin, Cyber-T a été utilisé pour analyser les données générées à l'aide Microprep pour l'identification de gènes différentiellement exprimés statistiquement significatives. Progiciels outre, construits en interne (poivre, FIVA, divulguer, PROCUREUR, Genome2D) ont été utilisés pour analyserdonnées.
Introduction
L'étude de l'ensemble des ARNm abondance (transcriptome) codée par le génome d'un organisme unicellulaire ou une cellule eucaryote à un moment précis ou dans des conditions spécifiques, y compris la surexpression du gène ou knock-out, est appelé transcriptomique. Transcriptomique nous permet d'observer dans quelle mesure les gènes sont exprimés sous une condition particulière à un instant X et nous donne des informations sur la façon fortement les gènes sont exprimés par rapport à une référence.
Une puce à ADN est une matrice bidimensionnelle sur un substrat solide (généralement une lame de verre ou de silicium cellule à couche mince) qui peut être utilisé pour doser des quantités importantes de matière biologique en utilisant un criblage à haut débit, et miniaturisé, le traitement en multiplex et parallèle et la détection méthodes. Microarrays viennent en différents types, y compris ADN puces, des puces à protéines, puces peptidiques, puces tissulaires, microarrays d'anticorps, puces cellulaires et autres. Une puce à ADN estessentiellement un ensemble de taches microscopiques d'ADN fixé à une surface solide, généralement en verre. Les puces à ADN sont utilisés pour mesurer les niveaux d'expression d'un gène ou d'un ensemble de gènes simultanément ou au génotype plusieurs régions du génome 2,3. Picomoles (10 -12 mole) d'une sonde sont présents au sein de chaque point d'ADN qui représente une séquence d'ADN spécifique, aussi connu comme un journaliste. Les molécules d'ARNm étiquetés à partir des échantillons sont appelés «cibles». Les fluorophores sont utilisés pour mesurer l'hybridation sonde-cible et la détection de cibles marqué par un fluorophore détermine l'abondance relative des séquences d'acide nucléique dans la cible. Une expérience de puces à ADN peut accomplir des tests génétiques multiples en parallèle, car un tableau peut contenir des dizaines de milliers de sondes. La disposition d'une expérience de puces à ADN simple est illustrée à la figure 1. Récemment, il a été établi dans nos laboratoires et d'autres que ces tableaux sont réutilisables, ce qui rend cette technique très coût-effective.
Des techniques d'isolement et de purification d'ARN différents ont été développés au cours des années, y compris C-TAB, SDS et méthodes GT 4-8. En outre, plusieurs kits commerciaux sont également disponibles. Pour l'expression des gènes de l'ARN de haute qualité est très importante. Par conséquent, les procédés d'isolement de l'ARN sont modifiés pour obtenir une quantité maximale de l'ARN. De même, les étapes de préparation d'ADNc et l'étiquetage des ADNc sont minimisés. Normalisation des données après la numérisation est également effectuée efficacement en utilisant maison-intégré paquets et des outils logiciels neuf.
Streptococcus pneumoniae est un agent pathogène humain à Gram positif qui colonise le nasopharynx et est la cause de multiples infections telles que la pneumonie, la septicémie, l'otite moyenne et la méningite 10. La bactérie peut utiliser une grande variété de nutriments nécessaires à la croissance et à la survie 11,12. Un certain nombre d'études ont été menées sur lamétabolisme de l'azote à pneumocoques et la réglementation en soulignant l'importance des acides aminés et de leur rôle dans la virulence 13,14. Dans cette étude, la réponse transcriptomique de S. pneumoniae à l'évolution des concentrations de L-sérine, un acide aminé abondamment présent dans le plasma de sang humain, est présenté en utilisant des puces à ADN. La réponse transcriptomique de S. pneumoniae cultivées dans une concentration minimale de L-sérine (150 uM) a été comparée à celle développée dans une concentration maximale (10 mM) de serine. Milieu défini chimiquement (MDP ou milieu minimal) 15 a été utilisé pour cette étude pour contrôler la concentration de la sérine. L'objectif de cette étude est de rendre cette technique convivial et pour fournir différents outils pour la normalisation et l'analyse des données. Par conséquent, un certain nombre d'outils ont été développés pour l'analyse et l'interprétation des données. FIVA (fonctionnelle Information Viewer et Analyzer) fournit une plate-forme pour traitement de l'information contenue dans des groupes de gènes ayantprofils d'expression des gènes semblables et pour la construction de profils fonctionnels 16. PROCUREUR est un autre logiciel qui facilite l'identification des fonctions putatives et annotations de gènes 17. En faisant usage de méthodes de classification, COMMUNIQUER fournit un algorithme de détection de liaison du site de l'ADN. Cis de les motifs de gènes peuvent être projetées en utilisant cet algorithme 18. Genome2D offre une plate-forme Windows pour la visualisation et l'analyse des données du transcriptome en offrant différentes gammes de couleurs pour caractériser les changements dans les niveaux d'expression des gènes sur une carte du génome 19. Le serveur Web de Pepper propose, en plus de la méthode tout-en-une analyse, une boîte à outils pour l'exploitation minière pour les régulons, promoteurs et de liaison du facteur de transcription 20 sites. Annotation complet de régions intergéniques dans un génome bactérien peut être obtenu en utilisant ce paquet. Les biologistes peuvent grandement bénéficier de poivre car il leur offre une plate-forme pour la conception de l'expériences afin que les informations hypothétique peut être confirmée in vitro 20. Ces logiciels contribuent de manière significative à l'analyse des microréseaux comme la plupart d'entre eux sont librement disponibles et font la normalisation et l'analyse des données très fiable.
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Protocol
1. Préparation des médias et culture cellulaire
- Cultivez S. pneumoniae D39 souche de type sauvage 21 comme décrit précédemment 11. Ensemencer les cellules stockées à -80 ° C dans 10% de glycerol (par rapport 1/100 dans 50 ml de tubes stériles) dans 50 ml de constitution chimique définie moyenne (MDP), avec un pH final de 6,4 à 15, mais omettre la L-sérine à partir de l'acide aminé mélange.
Remarque: deux MDP différents ont été utilisés; une contenant une concentration minimale de L-sérine (150 uM) et l'autre contenant une concentration maximale de L-sérine (10 mM). Cette concentration minimum est essentiellement la concentration de L-sérine dans le plasma sanguin humain et l'objectif est de comparer l'expression des gènes de S. pneumoniae souche D39 en vertu de ces deux conditions.
2. Isolement de l'ARN total
- Matériels
- Utilisation de l'acide phénol, le grade d'ARN pour l'isolement de l'ARN total.
- Macaloid:
- Suspendre deux grammes deMacaloid dans 100 ml de TE et faire bouillir pendant 5 min. Refroidir à température ambiante et soniquer jusqu'à Macaloid gels.Centrifuge la solution à 2000 g pendant 5 min à température ambiante, remettre en suspension dans 50 ml de TE pH 8 et conserver à 4 ° C.
- Solutions:
- Traiter toutes les solutions avec diéthylpyrocarbonate (DEPC). Ajouter 100 ul DEPC / 100 ml de solution, incuber O / N à 37 ° C et l'autoclave pendant 15 min.
- Méthodologie
- Croître de 50 ml de S. culture cellulaire pneumoniae D39 en tubes de 50 ml à 37 ° C (sans agitation) jusqu'à la phase mi-exponentielle (DO ~ 0,3). cultures de centrifugation à 4 ° C sur 10 000 g pendant 2 min. Jeter les médias et geler immédiatement les culots de cellules dans l'azote liquide.
- Premix 300 ul de chloroforme: IAA (24: 1) et 300 ul de phénol (phénol acide, la teneur de l'ARN). Utiliser 500 ul de la phase organique dans l'étape 2.2.3.
- Préparer le mélange suivant à l'avance dans des tubes à bouchon à vis sans ARN: 00,5 g de billes de verre, 50 pi de SDS à 10%, 500 ul de phénol / chloroforme: IAA (tel que préparé dans l'étape 2.2.2), Macaloid couche (150 à 175 ul, pas exact car il est très visqueux). Remettre en suspension les culots cellulaires dans 400 ul de TE (DEPC) et ajouter les cellules remises en suspension dans des tubes à bouchon à vis.
- Pour briser les cellules, placer les tubes à bouchon à vis dans une pile de billes pour des impulsions 2x 60 "(" d'homogénéiser ') avec 1 min d'intervalle sur la glace. Centrifuger les échantillons pendant 10 min à 10000 × g (4 ° C).
- Verser la phase supérieure dans un nouveau tube, ajouter 500 ul de chloroforme: IAA (24: 1) et centrifuger pendant 5 min à 10000 × g (4 ° C).
- Transférer 500 ul de la phase supérieure dans des tubes frais, ajouter 2 volumes (1 ml) de tampon de lyse / liaison et mélanger par pipetage de haut en bas. Isoler l'ARN total en utilisant le kit d'isolement d'ARN et suivre le protocole recommandé fabricant.
3. ARN Nettoyage
< ol>4. Analyse de l'ARN
- Déterminer la concentration de l'ARN sur un spectrophotomètre. Déterminer la qualité de l'ARN en utilisant un dosage de la manière suivante (figure 2).
- Diluer 1 pi d'échantillon de 50 ul d'eau DEPC pour obtenir une concentration de 20 à 200 ng / ul.
- Utilisez une ul échantillon d'ARN dilué à vérifier la qualité sur le Bioanalyser selon les instructions du fabricant.
- Remarque: un rapport de 23S 16S: de l'ordre de 2,0 est considéré comme bon ARN 1 unité A260 correspond à 40 pg / ml.. Une quantité recommandée pour l'étiquetage est de 10-20 mg.
5. ADNc Préparation et d'étiquetage
MÉNAGEMENT "> NOTE: Le protocole suivant a été suivie pour la préparation d'ADNc et l'étiquetage.- Recuit
- Effectuer réaction de recuit dans 300 tubes de PCR ul, en gardant la concentration d'ARN total de 10 à 15 pg pour diapositives maison ou 5 ug pour les diapositives de l'entreprise fait. Mélanger l'ARN avec 2 ul nonamères aléatoires (1,6 ug / ul) et ajouter de l'eau sans nuclease si nécessaire pour maintenir le volume final du mélange d'hybridation à 18 ul.
- Conserver le mélange d'annelage à 70 ° C pendant 5 min. Après cela, le mélange refroidir à la température ambiante pendant 10 min (recuit) et, si nécessaire, centrifuger les réactions au fond du tube. Placer les tubes de réaction sur de la glace pendant au moins 1 min.
- Reverse Transcription
- Préparer la transcriptase mélange inverse comme suit: à 18 pl recuit mélange, ajouter 12 ul de mélange maître (constitué de tampon 5X First Strand 6 pi, 3 pi de 0,1 M DDT, 1,2 pl 25x AA-dUTP / nucléotide mix et 1,8 pl inverser transcriptase (1 pi pour les diapositives de l'entreprise fait). Gardez le mélange de réaction pour 2-16 h à 42 ° C.
6. La dégradation de l'ARNm et de l'ADNc Purification
- Pour dégrader l'ARNm à partir du mélange réactionnel, ajouter 3 ul de NaOH 2,5 M et lieu à 37 ° C pendant environ 15 min. Par la suite, ajouter 15 pi de 2M HEPES acide libre pour neutraliser le NaOH.
- On purifie le mélange d'ADNc en utilisant des colonnes de nettoyage de PCR et suivre le protocole du fabricant.
7. Mesure de la concentration d'ADNc
- Mesurer les concentrations d'ADNc sur un spectrophotomètre. Pour continuer avec l'étiquetage, vérifier que la concentration de l'ADNc est d'au moins 60 ng / ul (diapositives maison) ou 20 ng / ul (des diapositives de l'entreprise fait).
8. étiquetage des ADNc avec Amine-colorant réactif et purification
- Utilisation colorant réactif d'amine pour marquer l'ADNc. Directement mélanger la ADNc avec une aliquote (5 pi) deamine-réactif colorant.
- Incuber le mélange à la température ambiante, dans l'obscurité, pendant 60 à 90 min et passer directement à la purification de l'ADNc marqué par un colorant. Purifier l'ADNc marqué par un colorant à l'aide de colonnes de nettoyage de PCR et en suivant le protocole du fabricant. Eluer ADNc dans 50 ul de tampon d'élution.
9. Mesure de labélisée ADNc
- Utilisation d'un spectrophotomètre pour mesurer l'incorporation de colorants réagissant avec les amines dans l'ADNc. Vérifier que la concentration de colorants réagissant avec les amines est au moins 0,5 pmol / ul dans un volume total de 50 ul.
10. Le mélange des échantillons étiquetés ADNc
- Pour les diapositives maison, utiliser tous les ADNc marqué pour l'hybridation avec une différence non supérieure à 30% de la concentration d'ADNc. Pour les diapositives de l'entreprise fait, utiliser ADNc avec pas plus de différence de 2 fois la concentration ADNc.
Remarque: normalement, environ 300 ng d'ADNc est nécessaire pour les diapositives de l'entreprise fait, qui est très peu par rapport à la required quantité d'ADNc pour les diapositives maison.
11. hybridation et de lavage
- Utilisez les réactifs suivants: eau déminéralisée, l'éthanol 99%, SHY tampons (maison; avec un ARN de levure 40 pi). Préparer maximum 1 ml de SHY.
- Appareillage et solutions préparation
- Allumez concentrateurs sous vide et de chauffage au moins 1 h avant le séchage. Mettre sur l'hybridation four, au point ajustée à la température d'hybridation correcte de jeu (pour S. pneumoniae puces à ADN, utiliser 45 ° C). De même, préchauffer la cassette d'hybridation et four pendant 30-60 min.
- Préchauffer tampon SHY à 68 ° C pendant au moins 30 min.
- La préparation des échantillons (ADNc marqué)
- Mélanger des quantités égales de ADNc marqués (max 30% de différence). Sécher l'échantillon en utilisant des concentrateurs à vide à haute température (env. 40 min) jusqu'à ce que le volume est inférieur à 7 ul.
- Lifter-dérapant
- Utilisez Lifter-feuillets propres.Remarque: ± 30 pi peuvent être chargés sur la diapositive.
- Nettoyez les Lifter-feuillets avec du savon, beaucoup d'eau du robinet et 100% d'éthanol. Remarque: les bordereaux de levage sales donnent bruit de fond élevé.
- Air sécher les Lifter-feuillets avec pistolet à air pour souffler les particules de poussière. Placez un lève-dérapant propre sur la diapositive avec le revêtement de téflon blanc sur les côtés vers le bas.
- L'ajout d'un tampon d'hybridation (à l'ADNc marqué)
- Dissoudre les échantillons de colorants secs dans 7 ul de H2O et incuber à 94 ° C pendant 2 min.
- Immédiatement, ajouter 35 ul tampon préchauffé SHY (68 ° C), mélanger doucement et de spin à vitesse maximale pendant 1 min pour se débarrasser de précipités. Préchauffez la sonde à 68 ° C pendant environ 5 min jusqu'à ce que le chargement.
- Glissez-lifter-dérapant assemblage et préchauffage.
- Placez le porte hybridation diaporama sur un bloc thermique à 50 ° C. Placer les lames de puces à ADN avec le lifter-dérapant sur le support hybridation diaporama chauffée et préchauffer la lame avec lifter-dérapant pour une minute. Effectuez les prochaines étapes le plus rapidement possible.
- Ajouter 40 ul de la cible de l'échantillon à l'extrémité de la glissière. Permettre au fluide de se écouler entre les surfaces de verre par la force capillaire. Effectuer toutes pipetage lentement et prudemment.
- Gardez les diapositives avec lifter-dérapant horizontale en tout temps et se déplacer lentement pour se assurer que le dispositif de levage-dérapant ne bougea pas.
- Prenez la cassette préchauffé hybridation du four d'hybridation et de fermer la machine. Lieu de papier-filtre imbibé de 3 ml 2x SSC (citrate salin standard) dans la cassette d'hybridation.
- Placez délicatement le support de diapositives d'hybridation avec diapositives dans la cassette d'hybridation. Fermez la cassette d'hybridation et de mettre dans le four à hybridation à nouveau (pour environ 16 à 18 h).
- Glisser à laver
- Préparer frais lavage-tampons I, II et III (750 ml par étape de lavage). Pour 500 ml laver tampon I, utiliser 2 x SSC / 0,5% de SDS. Pour 500 ml laver chamoiser II, utilisez 1 x SSC / SDS à 0,25%. Pour 500 ml laver tampon III, utiliser 1 x SSC / 0,1% SDS (facultatif)
- Placez les lavage-tampons à 30 ° C (pour être sûr SDS est dissous).
- Immerger les lames aussi rapidement que possible, mais très doucement, dans un tube falcon rempli de 50 mL Tampon de lavage jusqu'à ce que je le verre repose sur le fond conique du tube.
- Après quelques secondes, lorsque les puits de levage-dérapant au fond du tube, sortir la lame avec des pincettes sans rayer le tableau et mis dans le rack de la station de lavage. Continuer avec le lavage sans écart de temps.
- Laver les lames pendant 5 min dans 500 ml laver tampon I (dans une station de lavage). Donnez-lui un second lavage pendant 20-30 min dans 500 ml laver tampon II (dans une station de lavage). De même, laver les lames pendant 5 min dans 500 ml laver tampon III (facultatif) (dans une station de lavage).
- Sécher les diapositives pendant 2 min à 2000 rpm.
12. Microarray analyse
- Numérisation des imagesavec des longueurs d'onde respectives en scanner et enregistrer dans un dossier "Projet Jove".
- Utiliser un logiciel pour analyser les fichiers numérisés d'abord comme décrit précédemment 22. Après l'exécution de ce logiciel, sélectionnez l'onglet "Ouvrir une image" pour charger le fichier image rouge (-.550) comme "Rouge" et le fichier d'image verte (-.635) que "Green". Téléchargez le fichier gal (de .GAL) ayant S. pneumoniae liste de tableau sur le fichier image en sélectionnant "Load Array List" onglet 22.
Remarque: cette liste de tableau se composait de 48 grilles, sur chaque grille, il y avait 16 lignes et 15 colonnes. Chaque place sur la grille représente un seul gène et de l'information au comptant incluant le nom du gène est ajouté à travers un fichier de description de place. Les numéros de place sont donnés à partir de gauche à droite et de haut en bas. - Après avoir repéré attentivement les grilles, sélectionnez l'onglet "Trouver Array, Trouver blocs, Aligner Caractéristiques" pour aligner les points. Après l'alignement de toutes les fonctionnalités, d'analyser l'image en sélectionnant le "Analyse" tab. Créez un nouveau fichier ayant des résultats, l'histogramme et diagramme de dispersion. Enregistrez ce fichier à partir de l'onglet "Résultats Enregistrer sous" dans un fichier .gpr pour une analyse ultérieure.
- Effectuer poursuite de la normalisation et le traitement des données avec le logiciel Microprep développé en interne comme décrit neuf.
- Utilisez répétitions biologiques indépendants pour les données de puces à ADN qui sont colorant échangé. Effectuer la mise en œuvre CYBERT d'une variante de t-test1 et calculer les taux de découverte de faux (FDR) comme décrit neuf.
- Pour gènes exprimés de manière différentielle, prenez p <0,001 et FDR <0,05 comme une norme.
- Télécharger des données de puces à ADN sur la page de présentation NCBI pour obtenir un GEO (Gene Expression Omnibus) numéro d'accession.
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Representative Results
ARN, l'isolation et l'analyse d'ADNc
L-sérine est l'un des acides aminés essentiels et de sa concentration dans le plasma sanguin humain varie de 60 à 150 uM chez les enfants et les adultes. Son rôle dans la biosynthèse des purines et des pyrimidines souligne son importance dans le métabolisme et ce est un précurseur de plusieurs acides aminés (glycine, la cysteine et le tryptophane). Pour étudier l'impact de la L-sérine dans l'ensemble du transcriptome de S. D39 pneumoniae souche de type sauvage, l'analyse de puces à ADN de la souche cultivée dans D39 MDP avec une concentration minimale (150 uM) de L-sérine contre cette cultivées dans un maximum de concentration (10 mM) dans le même milieu a été effectuée. Tout d'abord, l'ARN total à partir de cellules cultivées dans les deux concentrations a été isolé. Les concentrations des échantillons d'ARN sont donnés dans le tableau 1. La qualité de l'ARN total a été examinée en utilisant le test de contrôle de qualité. L'ARN a été traité à la DNase I avant d'effectuer cetteessai pour éliminer l'ADN génomique possible figure 2 montre la qualité de l'ARN. L représente la voie échelle, pistes 1 et 2 représentent l'ARN à partir de la serine et 150 um pistes 3 et 4 représentent l'ARN à partir de 10 mM de serine. La présence de deux bandes claires correspondant aux deux sous-unités d'ARN indique la bonne qualité de l'ARN et l'étape suivante de l'essai peut être effectuée.
Après la mesure de la qualité de l'ARN, la synthèse d'ADNc a été effectuée. ADNc a été formée en utilisant nanomers aléatoires et enzyme transcriptase inverse. Les concentrations des échantillons d'ADNc sont donnés au tableau 1. Cet ADNc a été marquée avec des colorants réactifs avec les amines et les concentrations de l'ADNc marqué étiquettes de teinture et sont données dans le tableau 1. Après marquage, les échantillons ont été mélangés en conséquence et ensuite hybridées. Après le lavage, les lames ont été numérisés à l'aide du scanner, et l'analyse a été réalisée en utilisant un logiciel Gene Pix Pro. La figure 3 montre la dispersionanalyse de tracé du rapport de colorants amine réactive. Après une première analyse, des données a également été analysée à l'aide du progiciel PicroPrep (PrePrep, Prep, PostPrep) 9 à réduire le bruit et Cyber-T a été utilisé pour l'analyse finale. Le tableau 2 résume les résultats des études de microréseaux après application des critères de ≥ 2.0 pliez différence et valeur p <0,001. Un certain nombre de gènes ont été exprimés de manière différentielle en présence d'un minimum de L-sérine par rapport à la valeur maximale (tableau 2).
Figure 1. Vue d'ensemble de la technologie des puces à ADN. L'ARN est isolé à partir de la commande et les échantillons cibles et étiqueté ADNc est ensuite hybride.
Figure 2.Contrôle de la qualité de l'ARN isolé de S. cellules pneumoniae de D39 cultivées en présence de minimum (150 uM) et maximum (10 mM) des concentrations de sérine. Lane L représente la taille-ladder tandis que la piste 1 et 2 représentent des échantillons d'ARN isolés à partir de cellules cultivées en présence de la concentration en sérine minimum. De même, les voies 3 et 4 représentent des échantillons d'ARN isolés à partir de cellules cultivées en présence de la concentration en sérine maximale. Les bandes représentent l'ARNr 16S et 23S. La présence de seulement deux bandes montre qu'il n'y a pas de contamination ADNg et l'ARN est de bonne qualité.
Figure 3. Tableau de comparaison nuage de points d'un mélange de l'échantillon. Chaque spot dans la parcelle représente la valeur moyenne de l'expression (log2) d'un gène dans une expérience avec de la teinture 1 sur l'axe-y et colorant 2 sur l'axe des x.
| Échantillon | ARN échantillon | Description | concentration de l'ARN (ng / ul) | concentration d'ADNc (ng / ul) | Etiqueté ADNc (ng / ul) | DyLight-550 (pmol / ul) | DyLight-650 (pmol / ul) | système d'hybridation |
| S1 | R1 | De type sauvage D39 cultivés dans MDP + minimum L-sérine | 2057 | 255 | 225 | 0,8 | R1 + R3 | |
| R2 | De type sauvage D39 cultivés dans MDP + minimum L-sérine | 2566 | 201 | 179 | 1.2 | R2 + R4 | ||
| S2 | R3 | De type sauvage D39 cultivé dans MDP + L-sérine maximum | 2831 | 292 | 276 | 2.3 | ||
| R4 | De type sauvage D39 cultivés dans MDP + Maxmum L-sérine | 1867 | 172 | 150 | 1 |
Tableau 1. Schéma hybridation des échantillons utilisés dans l'analyse des microréseaux.
| Gene une | Fonction b | Ratio c | |||
| SPD0600 | Cellule protéines de division DivIB | 4 | |||
| SPD0445 | Phosphoglycerate kinase | 3,5 | |||
| SPD0646 | Protéine hypothétique | 3.4 | |||
| SPD0873 | Protéine hypothétique | 3.3 | |||
| SPD1223 | Protéine hypothétique | 3.3 | |||
| SPD0980 | Pyrophosphokinase ribose-phosphate 2,8 | ||||
| SPD1628 | Xanthine phosphoribosyltransférase | 2,7 | |||
| SPD1011 | Glycérate kinase | 2.4 | |||
| SPD0645 | Protéine hypothétique | 2.3 | |||
| SPD0564 | Protéine hypothétique | 2.2 | |||
| SPD0641 | Mannose-6-phosphate isomérase, classe I, ManA | 2.1 | |||
| SPD1333 | Protéine hypothétique | 2.1 | |||
| SPD1384 | Cation protéine de la famille d'efflux | 2.1 | |||
| SPD1432 | UDP-glucose 4-épimérase, Gale-1 | 2.1 | |||
| SPD1866 | N-acétyl-6-phosphate déacétylase, Naga | 2.1 | SPD0104 | LysM protéines de domaine | 2 |
| SPD0140 | Transporteur ABC, la protéine ATP-binding | 2 | |||
| SPD0261 | Aminopeptidase C, pepC | 2 | |||
| SPD1350 | Protéine hypothétique | 2 | |||
| SPD1822 | Grande sous-unité ribosomique pseudouridine synthase, protéines RluD de sous-famille | 2 | |||
| SPD0453 | Système de restriction de modification de type I, S sous-unité | -2 | |||
| SPD0459 | Protéine de choc thermique GrpE | -2 | |||
| SPD1006 | Le glucose-1-phosphate adénylyltransférase | -2 | |||
| SPD1799 | Capteur histidine kinase, putatif | -2,1 | </ Tr>|||
| SPD0387 | Beta-hydroxyacyl- (acyl-support-protéine) déshydratase FABZ | -2,2 | |||
| SPD1494 | Sucre transporteur ABC, protéines perméase | -2,2 | |||
| SPD0974 | Classe I amidotransférase de glutamine, putatif | -2,4 | |||
| SPD1600 | Phosphoribosyltransférase Anthranilate | -2,5 | |||
| SPD1472 | Isoleucyl-ARNt synthétase | -2,6 | |||
| SPD0681 | Protéine hypothétique | -2,7 | |||
| SPD0501 | antiterminateur de transcription, LICT | -3,4 |
Tableau 2. Liste des gènes régulés dans la comparaison du transcriptome de S. de type sauvage pneumoniae souche D39 cultivé en CDM 15 avec une concentration minimale de L-sérine et du MDP 15 avec une concentration maximale de la L-sérine. Un nombre de gènes se réfèrent à des balises de point de D39. B D39 annotation / TIGR4 annotation 21. Ratio c représente le pli augmentation / diminution dans l'expression de gènes dans le MDP-maximale par rapport au MDP-minimum (signe moins indique régulation négative).
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Discussion
Nous décrivons un protocole conviviale qui peut être appliquée pour effectuer l'analyse de transcriptome total de bactéries. Le point clé de cette technique particulière, ce est que la condition dans laquelle les cellules sont récoltées varie. Après la récolte des cellules et isolement de l'ARN, cette technique devient égale pour tous les types d'échantillons bactériens et suit les étapes exactement identiques et, par conséquent, peut être appliquée à tout type de culture bactérienne. Le protocole est très simple et pratique et commence à partir de l'isolement de l'ARN. Notre protocole d'isolement d'ARN (en utilisant un Macaloid et kit d'isolement d'ARN) est le temps effectif par rapport au phénol-chloroforme et les méthodes conventionnelles Trizol. Dans l'étape suivante, la préparation d'ADNc avec la transcriptase III enzyme est effectuée. Ensuite, l'étiquetage des ADNc est effectuée en mélangeant d'abord de l'ADNc avec des colorants réactifs avec les amines, puis la purification de l'ADNc marqué. Le marquage est également simple et ne prend pas beaucoup de temps que les échantillons doivent être incubées pendant environ 1h dans l'obscurité. Toutes ces étapes peuvent être effectuées dans ne importe quel laboratoire standard car il ne exige aucun équipement spécialisé. Un scanner de puces à ADN est nécessaire pour numériser des diapositives. Pour la numérisation et l'analyse diapositive, le programme GenePix Pro est utilisé, qui est un programme très simple et conviviale 22.
Après avoir fait toutes les expériences, l'analyse a été effectuée à l'aide MicroPrep et CYBERT. Le paquet MicroPrep, se compose de trois modules, à savoir, PrePreP, PreP et PostPreP neuf. Ce cadre de données de pré-traitement réduit le temps pour la normalisation des données et réduit également la quantité de données mis au rebut. La facilité avec laquelle le logiciel peut être utilisé permet au chercheur d'avoir une compréhension des données de puces à ADN en un temps minimal. Il ne faut que quelques minutes pour convertir les données de signal brutes en données de haute qualité pour un traitement ultérieur après analyse d'image de glissement est fait. Une analyse plus poussée sur le bassin de gènes régulés dans le MICRoarray peut être fait en utilisant différents logiciels internes. Ils comprennent le poivre 20, 16 FIVA, COMMUNIQUER 18, 17 et PROCUREUR Genome2D 19. Ces outils Windows et les logiciels sont conviviaux et fournissent profonde aperçu des données pendant une enquête plus approfondie. Ces logiciels font qu'il est très facile et pratique pour les chercheurs d'utiliser cette technologie que les données devient beaucoup plus significative et pertinente.
Les colorants utilisés dans les puces à ADN sont connues pour être sensibles à un effet de l'ozone, où les colorants deviennent instables en présence d'ozone et l'intensité du signal est si faible qu'elle ne peut pas être reconnue par le scanner. des colorants réactifs avec les amines qui sont moins sensibles à l'effet de l'ozone sont utilisés pour marquer l'ADNc. La solution à l'ozone à effet va rendre cette technologie encore mieux.
Une liste a été créée de gènes qui étaient régulés à la baisse en amont ou en présence de la L-Ser minimaline concentration par rapport au maximum (tableau 2). Les gènes surexprimés peuvent être classés en fonction de la fonction de leur produit. Sept d'entre eux codent pour des protéines hypothétiques, quatre sont impliqués dans le transport et le métabolisme des hydrates de carbone, une protéine de division cellulaire DivIB, certains gènes et de transport d'acides aminés et le métabolisme. De même, il ya aussi certains gènes qui sont régulés à la baisse dans notre condition testée. Un BglG famille LICT de régulateur transcriptionnel, certains gènes de glucides et quelques gènes spécifiques acides aminés sont parmi les gènes régulés à la baisse. Un choc thermique protéines GrpE est aussi parmi ceux de régulés à la baisse. Par conséquent, cette étude fournit un aperçu complet des gènes exprimés de manière différentielle dans les conditions testées. Après analyse des résultats, parfois vérification des résultats est nécessaire. Cela peut être fait soit par qPCR ou dosages β-galactosidase en utilisant des fusions du promoteur de lacZ.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils ne ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Nous remercions Anne de Jong et Siger Holsappel de l'aide à la production de puces à ADN de diapositive. Le soutien d'Anne de Jong pour l'analyse bioinformatique est également apprécié. Nous remercions également Jelle Slager d'examiner le document. Muhammad Afzal et Irfan Manzoor sont pris en charge par l'Université GC, Faisalabad, Pakistan, sous le programme de développement du corps professoral d'HEC Pakistan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acid phenol | SigmaAldrich | P4682 | |
| Roche RNA isolation kit | Roche Applied Science | 11828665001 | |
| Glass beads | 105015 | ||
| Chloroform | Boom | 92013505.1000. | |
| IAA | 106630 | ||
| Nanodrop | Nanodrop | ND-100 | |
| Agilent BioAnalyser | Agilent | G2940CA | |
| Superscript III | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| AA-dUTP | Life technologies Invitrogen | AM8439 | |
| DDT | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| First Strand buffer | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| NaOH | SigmaAldrich | S8045-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H4034-500G | |
| DyLight-550 | Thermoscientiffic | 62262 | |
| DyLight-650 | Thermoscientiffic | 62265 | |
| SHY Buffer | SigmaAldrich | H7033-125ML | |
| Speedvac cooler | Eppendorf | RUGNE3140 | Speedvac concentrator plus |
| Hybridization oven | Grant Boekel | Iso-20 | |
| Lifter-slips | Erie Scientific | 25x60I-M-5439 | |
| Wipe | KIMTECH | ||
| SDS | SigmaAldrich | L3771-100g | |
| SSC | SigmaAldrich | W302600-1KG-K | |
| Genpix autoloader 4200A1 | MSD analytical technologies | Microarray scanner | |
| Sodium bicarbonate | SigmaAldrich | 104766 |
References
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