Introduction
Brustkrebszellen zu metastasieren in das Knochenmark vor der Erkrankung nachweisbar 1, sobald kleine Tumore entwickeln Blutgefße 2,3. Die metastasierendem Verfahren ist schnell, aber ineffizient. Zellen, geben Sie die neuen Blutgefäße schnell, zu Millionen pro Tag 4, aber nur wenige überleben die Reise zu entfernten Organen 5. Dennoch gibt es einige Mikrometastasen zu überleben in den Knochen und kann als einzelne Zellen oder kleine Zellklumpen in Knochenmarkaspirate von neu diagnostizierten Patienten 1 gefunden werden. Diese Zellen wider adjuvante Chemotherapie, die für den Zweck der Beseitigung von ihnen 6 verabreicht wird. Dieser Widerstand wird dotiert, im Wesentlichen durch das Überleben Signalisierung durch Wechselwirkungen mit dem Knochenmark-Mikroumgebung 7,8 eingeleitet. Mikrometastasen in etwa ein Drittel der Frauen mit lokalem Brustkrebs gefunden werden und stellen ein unabhängiges Indikator für das Überleben, wenn sie von univariaten Analyse 9 analysiert. Einige micrometastases sind Wachstum eingeleitet, aber Wiederholungsmuster sind abhängig von Zelltyp. Patienten mit triple negativem Brustkrebs neigen dazu, zwischen 1 bis 4 Jahre wiederkehren, was auf schlechte Kontrolle über die schlafenden Zustand. Andere Zelltypen, einschließlich ER / PR + Zellen können für bis zu 20 Jahre ruhend bleiben, mit einem stetigen, kontinuierlichen Rezidivrate 10. Während Unterschiede in der Keimruhe Genexpressionssignaturen zwischen ER + und ER- Brustzelllinien und Tumoren spiegeln unterschiedliche Ruhepotentiale 11, Interaktionen mit Knochenmarkstroma wahrscheinlich einen bedeutenden Beitrag zur Keimruhe.
Das Studium der Keimruhe in vivo ist außerordentlich schwierig, weil Mikrometastasen sind selten und werden zahlenmäßig von blutbildenden Zellen um mehr als 10 6 -fach. Daher müssen entsprechende Modelle erzeugt werden, die in-vitro-Daten, die Mechanismen vorschlagen, und erzeugen überprüfbare Hypothesen in vivo unterbieten sind. Eine Reihe von Ruhe Modelle, darunter matheatika Modelle 12,13, in-vitro-Modellen 7,8,14,15, in vivo-Xenotransplantat-Modelle 16, Kombinationen von in vitro und Xenotransplantatmodellen 17,18 und spontaner Tumormetastasen und Modelle 19, haben einen Einblick in Krebszellruhe 20 ergab . Jedes dieser Modelle haben ihre eigenen Grenzen und sind von sich selbst in erster Linie sinnvoll zur Erzeugung von Hypothesen zur molekularen Signal und Interaktionen, die Ruhephase, um in mehr biologisch relevanten Modellen getestet werden regieren.
Mit dem Gesamtziel definiert, die molekularen Mechanismen der Keimruhe, die Wechselwirkungen mit der Mikroumgebung, die in Zyklusarrest, Redifferenzierung und Therapieresistenz und Mechanismen führt, die in Rückfällen bei ER + Zellen führen, ein in vitro-Modell, das ausgewählt relevanten Elemente der bietet entwickelten wir Stroma-Mikroumgebung 7. Dieses Modell, während in seiner Kompo relativ spärlichenten, ist robust genug, um die Ermittler zu ermöglichen, spezifische molekulare Mechanismen, die signifikante Funktionen der Keimruhe beeinträchtigen abzuleiten. Diese Experimente erzeugen Hypothesen, die direkt in vivo getestet werden können. Das Modell stützt sich auf einige Schlüsselelemente, die wir gezeigt, in Keimruhe relevant. Sie umfassen die Verwendung von Östrogen-abhängigen Brustkrebs-Zellen, der Kultur von Zellen in einem klonogenen Dichte wo ihre Wechselwirkung ist hauptsächlich mit der Erde und die löslichen Bestandteile des Mediums, einer Fibronektin-Substrat und das Vorhandensein von basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF-2) im Medium.
Wir gekennzeichnet Mechanismen, die das System in vitro regeln, einschließlich der Induktion von Zellzyklusarrest von FGF-2 21, durch TGFß 22 vermittelt wird, das Überleben Signalgebung durch PI3 Kinase ERK 7,8 und 8 und morphogenic Differenzierung zu einer epithelialen Phänotyp, die auf abhing RhoA Inaktivierung Integrin45; 5β1 Hochregulierung und die Ligation von Stromazellen Fibronektin Überleben 7,15 (Abbildung 1). Die in-vitro-Zellzykluseffekte von FGF-2 auf die MCF-7 Zellen beginnen bei Konzentrationen mindestens einer Protokoll unter 10 ng / ml 21,23. Die Begründung wurde auf die zeitliche Steuerung von FGF-2-Expression über Brust-duktales Morphogenese, zyklische Expansion und Rezession in einer Reihe von Säugetiersystemen 24-27 basiert. Wir haben gezeigt, dass FGF-2 induziert die Differenzierung, einschließlich duktalen Morphogenese in 3D-Kultur 28, und dass FGF-2-Expression in der Regel verlor mit malignen Transformation von menschlichen Tumoren 29. Die Expression von FGR1 blieb intakt in befragten 29 und MCF-7 Zellen Mammakarzinomen weiterhin alle 4 FGF-Rezeptoren 30 zum Ausdruck bringen. Im Kontext der Dormanz wird FGF-2 durch exportiert und stark auf Knochenmarkstroma 31,32, wo es bei der Konservierung von Blutstammzellen 33 fungiert abgeschieden. Wir DMonstrated, dass FGF-2 induziert einen Ruhezustand in ER + Brustkrebszellen zu Fibronektin Substraten, auch im Knochenmark, wo es morphogenic Differenzierung 7 induziert reichlich kultiviert. Im Modell Brustkrebszellen sind Wachstum gehemmt wird, inaktivieren Rho A durch die RhoGap GRAF, Redifferenzierung zu einer epithelialen Phänotyp und Re-express Integrine α5β1 lost mit malignen Progression. Sie binden Fibronektin durch Integrin α5β1 und aktiviere das Überleben signalisiert, dass sie resistent gegen zytotoxischen Therapie 7,8,15 (Abbildung 1) zu machen. Hemmung der Rho-GTPasen Klasse wurde bereits gezeigt, dass eine Ruhe Phänotyp 34 induzieren.
Hier werden wir die spezifischen Verfahren, die Ermittler erlauben wird, um das Modell zu etablieren und zu studieren spezifischen molekularen und zellulären Mechanismen, die Ruhephase der ER + Brustkrebszellen zu skizzieren. In den Experimenten hier dargestellt, um die Verwendung des Modells veranschauGezielte wir den PI3K-Weg (1B) mit einem Akt-Inhibitor und einem PI3K-Inhibitor und alle Mitglieder der Rho-Familie (1B) mit einem pan-Rho-Inhibitor und einem Rho-Kinase (ROCK) Inhibitor.
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Protocol
1. Klonogentest
- Bereiten Sie eine Einzelzellsuspensionen von Östrogen-abhängigen Brustkrebs-Zelllinien MCF-7 und T47D-Zellen unter Verwendung der unten angegebenen Schritte,
- Saugen Sie das Kulturmedium (DMEM / 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum / Glutamin und Pen / Strep) von einer 10 cm Gewebekulturschale, die nicht mehr als 50% konfluent mit MCF-7 oder T-47D-Zellen ist. Spülen mit PBS. Inkubieren mit Trypsin 0,25% / 2,21 mM EDTA in DMEM mit hohem Glucose gelöst bei 37 ° C für 1-4 min.
- Prüfzellen in 1-Minuten-Intervallen unter einem Phasenkontrastmikroskop, um eine einzelne Zellverteilung zu gewährleisten. Resuspendieren der Zellen mit einer 2 ml-Pipette durch Auf- und Abpipettieren mehrmals, um Zell-Zell-Kontakt unterbrechen, um eine fast unveränderlich, einzelne Zelle Status zu erreichen.
- Weiterhin Zellen bei 37 ° C für 4 min inkubieren in Trypsin, wenn Sie Zellklumpen nach nur 2 min Inkubation zu beobachten. Verwenden Sie diese Zellen für die klonogenen Studien, wenn sie haft e bleibenach andere nach 4 min von Trypsinierung, weil Fehler in der Kolonie Nummer Ertrag eingebracht werden.
HINWEIS: Wenn Zellen verklumpten, wird die Anzahl der gebildeten Kolonien des Produkts von weniger Zellen als die Anzahl inkubiert reflektieren. Wenn Zellen übermßig trypsiniert, kann ihr klonogenen Potential vermindert. - Vorbereitung einer Einzelzellsuspension von 1.500 Zellen / ml Kulturmedium für 24-Well-Platten oder weniger (+ 500 Zellen / ml, abhängig von dem Zelltyp oder einen Durchgang-Zahl), durch serielle Verdünnungen in einem Master Rohr das gesamte Volumen von Nöten alle Variablen in dem Experiment.
ANMERKUNG: Das Ziel ist eine endgültige Zelldichte von 800 Zellen / cm 2 (im Bereich von ca. 500 bis 1.100 Zellen / cm 2). Das Ziel ist, auf etwa 100 + 50 Kolonien zu erhalten, die relativ einfach Zählung ermöglicht, verhindert Verdrängung und ermöglicht ausreichend Kolonien in statistisch signifikanten Differenzen im Kolonien werden erhöht oder verringert experimentellen perturbagen.
- Inkubieren Zellen bei Klonogene Density Mit skizzierten Schritte
- Zellen in vierfachen Vertiefungen auf 24-Well-Fibronektin-beschichtete Platten bei einem klonogenen Dichte von 1500 Zellen / Well von einer Master-Einzelzellsuspension Rohr von 1.500 Zellen / ml. Man reibt das Medium, das Zellen mit einer 5 ml Pipette durch Aufziehen 3 ml und Abgabe 1 ml Medium in jeder der 2 Brunnen.
HINWEIS: Fibronectin-beschichteten Platten sollten gekauft vorbeschichtet werden von einem kommerziellen Anbieter. Lackplatten außerhalb eines Qualitäts gesteuert automatisierten Prozess führt zu einer unebenen Oberfläche ungeeignet für diesen Test. - Mischen Sie die Suspension durch Auf- und Abpipettieren mit einer 5 ml Pipette erarbeiten 3 ml Zellsuspension und füllen 2 Brunnen mit je 1 ml. Füllen Sie nur 2 Brunnen zu einem beliebigen Zeitpunkt von einer Pipette. Schicken Sie das Restvolumen in der Pipette zu der Zellsuspension in der Master-Rohr, Die Zellen wiederum durch Auf- und Abpipettieren und stellt weitere 3 ml, um eine andere 2 wel füllenls mit je 1 ml.
HINWEIS: Das kontinuierliche Mischen des Masterrohr ist erforderlich, da Zellen kontinuierlich zu sedimentieren. Die Zusammenstellung einer ausreichenden Menge, um nur 2 Brunnen zu füllen ist notwendig, um ähnliche Zellzahlen in jede Vertiefung hinzufügen, weil Zellen sedimentieren in der Pipette als auch. - Arbeiten schnell, um die großen Mengen an Zellen zu verteilen, da ermöglicht den Zellen in Suspension bei Raumtemperatur und der CO 2 -Konzentration sitzen ihre klonogenen Potential (unveröffentlichte Beobachtungen) modulieren.
- Optimieren Sie die räumliche Verteilung der Zellen während der Akt der Pipettieren sie in Brunnen für Kolonie-Assays. Dies geschieht durch langsam Pipettieren der Suspension, die die endgültige Zellkonzentration in der Mitte der Vertiefung. Die Platte, um die Bewegung weiterer Gegenstand nicht vor Zellen am Boden absetzen. Die Platte wirbeln Sie nicht, weil Kreismisch effektiv die Zellen, um den Umfang der auch die Schaffung hohe Zelldichten und unzählige konfluente Kolonien Zentrifuge bei 6 Tage.
HINWEIS: wenn es nicht notwendig mischen, da dies überhaupt nach der Einführung die Lautstärke mit den Zellen in Suspension weniger wünschenswert als keine Vermischung. Wenn es notwendig ist, um Zellen zu mischen, dies durch Bewegen der Platte vor und zurück in senkrechten Richtungen, während es auf einer flachen Oberfläche aufliegt. - Zellen bei 37 ° C 5% CO 2 inkubieren ohne Medienwechsel für 6 Tage. Die geringe Zahl von Zellen in einem Bohrloch nach 6 Tagen nicht signifikant beeinflussen den Nährstoff oder Zytokin Zusammensetzung noch den pH-Wert des Originalmediums.
- Entwerfen der zeitliche Verlauf des Assays wie folgt: Zellen, die auf Fibronectin beschichteten Substrate am Tag 1. Inkubieren Ersetzen bestehender Medium mit 1 ml frischem Medium oder frischer Medium enthaltend FGF-2 10 ng / ml am Tag 0 Stain-Zellen am Tag 6 nach unten in 1.4). Durchzuführen keine experimentellen Störungen an Tag 3, wie unten in 1.3).
- Zellen in vierfachen Vertiefungen auf 24-Well-Fibronektin-beschichtete Platten bei einem klonogenen Dichte von 1500 Zellen / Well von einer Master-Einzelzellsuspension Rohr von 1.500 Zellen / ml. Man reibt das Medium, das Zellen mit einer 5 ml Pipette durch Aufziehen 3 ml und Abgabe 1 ml Medium in jeder der 2 Brunnen.
- Einrichten Experimental Störungen der molekularen Signal oder Adhäsionsmoleküle
- An Tag 3 werden 10056; l einer Lösung, die 10-fach von dem geplanten Konzentration der störenden Mittels zu dem 1 ml Medium in den Vertiefungen. Nicht zu verwechseln. Weiterhin die Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 für weitere 3 Tage inkubiert.
HINWEIS: Stören Mittel können eine Vielzahl von Inhibitoren und Blockierungsmittel Adhäsionsmoleküle, Rezeptoren oder andere Oberflächenproteine, Inhibitoren der intrazellulären Signalwegen, Moleküle, Faktoren, Co-Faktoren oder strukturellen Proteinen, die Rollen bei der Unterstützung des Ruhezustand spielen können, umfassen. - Flecken Kolonien am Tag 6, wie folgt.
- An Tag 3 werden 10056; l einer Lösung, die 10-fach von dem geplanten Konzentration der störenden Mittels zu dem 1 ml Medium in den Vertiefungen. Nicht zu verwechseln. Weiterhin die Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 für weitere 3 Tage inkubiert.
- Stain Colonies
- Flecken Zellen nach 6 Tagen in Kultur mit einer frisch hergestellten 0,1% Kristallviolett in 2% Ethanol / 10 mM Natriumborat (pH 9,0) Lösung. Saugen Sie Medien und fügen Sie eine ml Kristallviolett-Lösung in jede Vertiefung für 20 Minuten.
- Waschplatten, indem sie mit den Öffnungen nach unten und in einem spitzen Winkel in einem Eiskübel überfüllt mit kontinuierlich fließendem LeitungseintauchenWasser in der Spüle. Kippen Sie die Platte an einem horizontalen Winkel einmal unter Wasser, auch die Öffnung nach unten und dann nach hinten neigen, um einen spitzen Winkel beim Entfernen in einem sanften fließenden Bewegung.
- Wiederholen der Eint 2 oder 3 mal, bis das Wasser auf dem Boden der Vertiefungen ist nicht mehr blau. Kräftiges Waschen kann Zellen oder Kolonien, die aufgrund der experimentellen Eingriff weniger haft sind, was eine um wesentlich zu dem Fehler in Zählung und der Daten.
- Dry Platten über Nacht, indem sie den Kopf auf Handtücher auf der Tischplatte angrenzend an die entsprechenden markierten Abdeckungen.
- Graf Colonies
- Zählen die Anzahl der wachsenden und ruhenden Kolonien in jeder Vertiefung nach 6 Tagen Inkubation Färbung und Trocknen. Graf Kolonien optimal bei 40-facher Vergrößerung in einem umgekehrten Phasenkontrastmikroskop. Zählen Kolonien von> 30 Zellen wachsen und Kolonien von 12 Zellen oder weniger, mit dem morphologischen Erscheinungsbild sehr groß im Vergleich zum Züchten von Zellen, große expaNDED Cytoplasma mit großen Cytoplasma in Verhältnissen, die in 1 gezeigten Kern 7,15.
HINWEIS: Cluster von 13 bis 29 Zellen werden in der Regel nicht gezählt, da sie nicht sehr häufig in einfachen Ruhe Assays. Sie können angerechnet werden, wenn Störungen verschieben das Wachstumspotenzial der entweder wachsen oder ruhenden Zellen. Diese Ergebnisse müssen dann mit biologischer Bedeutung korreliert werden.
- Zählen die Anzahl der wachsenden und ruhenden Kolonien in jeder Vertiefung nach 6 Tagen Inkubation Färbung und Trocknen. Graf Kolonien optimal bei 40-facher Vergrößerung in einem umgekehrten Phasenkontrastmikroskop. Zählen Kolonien von> 30 Zellen wachsen und Kolonien von 12 Zellen oder weniger, mit dem morphologischen Erscheinungsbild sehr groß im Vergleich zum Züchten von Zellen, große expaNDED Cytoplasma mit großen Cytoplasma in Verhältnissen, die in 1 gezeigten Kern 7,15.
2. Klonogene Inkubation für Immunfluoreszenz-Studien
- Einzustellen Zellzahlen ungefähr 7,500-8,000 Zellen / Vertiefung in Platten mit 6 Vertiefungen zu entsprechen Nummern / Oberfläche analog 24 Vertiefungen Experimente Zelle.
- Platzieren Sie einen runden, sterile, Fibronektin-beschichtete Deckglas in jede Vertiefung Basis des 6-Well-Platten für die bildgebenden Untersuchungen vor der Zelle hinaus. Pipette Zellen in 3 ml Volumina in jede Vertiefung 2 Vertiefungen in einer Zeit in Konzentrationen ausgeführt, wie bei den obigen Experimenten klonogenen in 1.2 beschrieben).
- Inkubieren Zellenfür 6 Tage, wie oben in 1.2.4 und 1.2.5. Hinzuzufügen Störfaktoren am Tag 3 bei 10-facher Konzentration in 300 ul-Volumina, wie sie in den Kolonie-Assay-Verfahren in 1.3 beschrieben).
- Stain-Zellen am Tag 6 mit Antikörpern gegen Adhäsionsmoleküle wie Integrine α4, α5, α6, β1, β3 zB focal adhesion komplexe Moleküle FAK, paxillin und Vinculin Zelle, zum Beispiel, Proteine der Motilität beteiligt, wie α-Tubulin B. Signalweg Elemente, wie Phospho-Akt, Phospho-ERK, Phospho-p38, Phospho-JNK, zum Beispiel, oder jedes andere Protein, das das Ziel der Untersuchung für seine Rolle in der Ruhe ist, unter Verwendung von Standard-Techniken zur direkten oder indirekten Immunfluoreszenzfärbung.
- Folien mit einer Pinzette entfernen Tag 6. Fix in Aceton / Methanol 1: 1 bei -20 ° C für 20 min und der Luft trocknen. Eine alternative Fixiermittel wie Paraformaldehyd, verwendet werden, falls erforderlich. Permeabilisieren Zellen mit 0,1% Triton X-100, 0,1% Natriumcitrat 2 min foder den Nachweis von intrazellulären Antigenen. Zellen mit PBS waschen.
- Für indirekte immunofluorecence Färbung Blockobjektträger 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 5% BSA oder mit 10% Serum vor der Immunisierung von der Spezies, in welcher der sekundäre Antikörper erzeugt wurde.
- Inkubieren über Nacht bei 4 ° C mit primären Antikörpern gegen Adhäsionsmoleküle Brenn komplexe Moleküle Zelle Signalweg Elemente oder andere Protein, das das Ziel der Untersuchung für seine Rolle in der Ruhe auf spezifische Verdünnungen vom Hersteller empfohlenen Verdünnung in PBS 0,1% Triton X -100.
- Mit PBS waschen 3 Mal. Deckgläser mit Fluorophor-konjugierten Antikörpern Inkubieren bei Raumtemperatur für 2 Stunden. Als ein Beispiel kann Alexa Fluor 488 Esel Anti-Maus-IgG-Antikörper verwendet, um Maus monoklonalen primären Antikörper nachzuweisen. Berg Deckgläser Zellseite nach unten auf Glasobjektträger unter Verwendung eines Antifade Mittel mit DAPI. Verschließen Sie die Umfänge mit Nagellack.
- Für direkte Immunfluoreszenz, die Durchführung der BSAwie oben in 2.4.2) Blockieren, Inkubation mit Fluorophor-konjugierte primäre Antikörper über Nacht bei 4 ° C. Mit PBS waschen 3 Mal. Inkubieren Sie die Objektträger mit einer Antifade Mittel und Dapi und Dichtung mit Nagellack.
- Schutzglasschalen mit Aluminiumfolie und bei 4 ° C für die Bildgebung und Fotografie jederzeit bis zu mehreren Wochen später. Ansehen und Foto-Zellen unter Verwendung beliebiger fluoreszenzmikroskopischen Bildgebungssysteme mit einer Kamera ausgestattet an 1,000x Vergrößerung.
- Für fibrilläres Aktinfärbung Block gleitet in 1% Rinderserumalbumin (BSA) für 30 Minuten und Inkubieren in BODIPY FL-Phallacidin (grün) oder Rhodamin-Phalloidin (rot) bei Raumtemperatur für 20 min. Fügen Sie einen Antifade Mittel und Dichtung wie oben.
3. Klonogene Inkubation für Molekulare Studien
- Western Blots
- Inkubieren ER + Brustkrebszellen MCF-7 oder T47D auf klonogenen Dichten von 20.000 Zellen / 60 mm Platte und 50.000 Zellen / 100 mm Platte auf fibronecZinn-beschichteten Platten bei 37 ° C in 5% CO 2.
- Inkubieren Zellen bei etwas höheren Dichte von 75.000 Zellen / 100 mm Platte für molekulare Studien erfordern mg Mengen für Protein aus Lysaten. Verwenden Sie bis zu zehn Platten pro Versuchspunkt, um ausreichend Protein für molekulare Studien unter Verwendung von Western-Blots oder für RNA-Isolierung für Northern Blots zu sammeln.
- Zellzahl anhand Gelbeladung ist eine notwendige Ergänzung für den Vergleich der Proteinexpression in beträchtlichem Ausmaß unterschiedlich große wachsenden und ruhenden Zellen. Sammle die Zellen durch Trypsinisierung und zählen ein Aliquot in einem Hämozytometer in 0,2% Trypan Blau zur Herstellung von Lysaten für Westernblots statt Abschaben der Zellen mit einer einzigen Kante Klinge.
- Centrifuge Zellen bei 10.000 × g für 2 Minuten, entfernen Medien durch Aspiration, fügen Sie 200 ul Lysepuffer, beschallen die Zellen in Lysepuffer und bestimmen die Proteinkonzentration.
- Berechnen der Menge an Protein pro Zelle durch Teilen der Proteinausbeute durch die Anzahl der Zellendaß die Menge erzeugt. Laden des Lysates in jede Vertiefung einer separaten Polyacrylamidgelen, die sowohl a) äquivalente Mengen des Proteins, und b) Proteinmengen, die äquivalente Zellzahlen darstellt. Mindestens 25 ug Protein sollte in jede Vertiefung geladen.
Hinweis: das Vergleichen zwischen wachsenden oder ruhenden Zellen, die in der Größe und der Proteingehalt (Figur 1) sind signifikant verschieden zu ermöglichen.
- Durchflusszytometrie
- Sammeln Zellen von 100-mm-Platten durch Trypsinierung, wie in 3.1 und analysiert durch Standardfluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) Protokolle, die primäre oder sekundäre Immunfluoreszenzfärbung für entweder intrazelluläre oder extrazelluläre Antigene, wie in Abschnitt 2.4 beschrieben.
HINWEIS: Abnehmen Zellen aus Gewebekulturplatten durch Trypsinisierung beeinflußt nicht die Konzentration von Membranproteinen, wie durch Antikörpermarkierung bestimmt.
- Sammeln Zellen von 100-mm-Platten durch Trypsinierung, wie in 3.1 und analysiert durch Standardfluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) Protokolle, die primäre oder sekundäre Immunfluoreszenzfärbung für entweder intrazelluläre oder extrazelluläre Antigene, wie in Abschnitt 2.4 beschrieben.
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Representative Results
Experimente wurden durchgeführt, um den Test zu wiederholen. Der Zeitverlauf des Experiments ist in 2A gezeigt. Die Zellen werden bei klonogenen Dichte am Tag -1 inkubiert wird FGF-2 in frischem Medium am Tag 0 gegeben und die Zellen werden bis zum Tag 6 kultiviert, wenn sie gefärbt sind, und die Kolonien gezählt. Jegliche Störungen in das System werden am Tag 3 in 100 ul-Volumina bei 10-facher Endkonzentration verabreicht gewünscht. 2B veranschaulicht das typische Erscheinungsbild von wachsenden und ruhenden Kolonien. Wachsenden Kolonien enthalten> 30 Zellen und ruhenden Kolonien enthalten 12 oder weniger Zellen, welche ein Vielfaches größer ist als wachsende Zellen mit großen Cytoplasma / Kern-Verhältnisse sind. 2C zeigt ein typisches experimentelles Ergebnis vierfach durchgeführt. Die vorherrschende Verteilung der Zellen ohne Zusatz von FGF-2 wird durch wachsende Klone dargestellt, während in der Gegenwart von FGF-2, die überwiegende Mehrheit der Klone ruhenden.
NHALT "> 3 ist ein Beispiel für ein Experiment, in dem störende Mittel wurden am 3. Tag der Abbildung hinzugefügt stellt die Dosis-abhängige Hemmung der ruhenden Klone durch Hemmung der Rho-GTPase durch eine pan-Rho Inhibitor C3-Transferase und eine Rho-Kinase (ROCK) Inhibitor Y27632. Der Assay kann die ED 50 von zugesetztem Inhibitoren auf ruhenden Klone sowie wachsende Klone zu beurteilen. In diesem Experiment wurde die Wirkung auf wachsende Klone nicht bestimmt, da es nur präsentiert, um die Methodik veranschaulichen.Die 4 und 5 zeigen, dass der Assay verwendet werden, um die kombinierten Effekte von Inhibitoren auf das Überleben von ruhenden Klone abzuschätzen. Vorherige Studien haben gezeigt, dass die PI3K erfährt eine anhalt Aktivierung in ruhenden Zellen in diesem Modell und Hemmung von PI3K und Akt sowohl das Überleben der ruhenden Klone 7 teilweise hemmt. Hier Vorbemerkungen demonstrierte tHut unspezifische Hemmung der Rho Familie der kleinen GTPasen auch teilweise hemmt das Überleben der ruhenden Klone. In den 4 und 5 dargestellten Daten zeigen, dass die Kombination von Hemmung der PI3K und einer ihrer Effektoren, AKT, mit der Hemmung der Rho-Familie mit C3-Transferase und einer ROCK-Inhibitor nahezu vollständig das Überleben der ruhenden Klone unter Umständen zu beseitigen. Wir haben bereits gezeigt, dass die schlafenden Klone überleben die Hemmung der PI3K, aber nicht der Akt werden von Zellen, mesenchymalen und notleidende 7 nicht mehr zeigen die ruhenden Phänotyp, sondern erscheinen zusammen. Zellen im ruhenden Klone in dem die Familie Rho wurde weitgehend von C3 Transferase gehemmt und die ROCK-Hemmer verlieren auch die typische ruhende Aussehen, übernehmen fibrolastoid Auftritte und zerzauste Membranen und auch scheinen beunruhigt (Abbildung 6). Diese Experimente zeigen, ein Modell, das in einer sehr br abgefragt werden könnenOAD Weise, um ein Verständnis der Elemente, die Ruhezeit und Resistenz verantwortlich sind, die Therapie zu erzielen.
Abbildung 1: Die Mechanismen, die unsere in vitro Modell Ruhe (A) Wachsende und ruhenden MCF-7-Klonen nach 6 Tagen Inkubation bei klonogenen Dichte auf Fibronektin-beschichteten Platten mit und ohne FGF2 10 ng / ml 7 (100-facher Vergrößerung).. (B) Zusammenfassung Schema skizziert die Daten, die FGFR und Integrin α5β1 parallel stationären Signalisierung wird benötigt, um zu aktivieren und zu pflegen Ruhe 7. FGF-2 reguliert Cyclin-abhängigen Kinase-Inhibitoren was G1 Verhaftung 21, aktiviert ERK 8 und 7, die PI3-Kinase-Signalisierungs initiatesurvival und hochregulieren Integrin α5β1 7, die Steady-State nach einigen Tagen erreicht. Dual-Signalisierung through FGFR durch PI3K und unabhängig durch Ligation von Integrin α5β1 durch Fibronektin FAK zu aktivieren und Membranlokalisierung und Aktivierung des RhoA GAP GRAF 15 erforderlich. Dies führt zu einer Inaktivierung von RhoA und einer permissiven stabilen Zustand für kortikale Umlagerung von F-Actin (Phalloidin gefärbten Mikrofotografie), epitheliale Re-Differenzierung und Keimruhe 15. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Die Elemente des in vitro Dormanz-Assay (A) Schema der zeitlichen Komponenten der Dormanz Assay.. Zellen werden auf Fibronectin-beschichteten Gewebekulturplatten in klonogenen Dichte / Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen in einer inc inkubiert, bei einer maximalen Dichte von 1500 Zellenubator bei 37 ° C und 5% CO 2 am Tag 1. Das Medium wird am Tag 0 mit frischem Medium oder frisches Medium ersetzt FGF-2 10 ng / ml und die Zellen werden erneut inkubiert. Zellen werden mit Kristallviolett-Lösung bei 10-facher gewünschten Konzentrationen angefärbt, wie beschrieben, an Tag 6. Alle Inhibitoren oder Störungsmittel werden am Tag 3 in 100 ul-Volumina zugesetzt und die Zellen werden erneut inkubiert, bis Tag 6 (B) Das Aussehen von gefärbten wachsenden und ruhenden MCF-7 Kolonien. Wachsende Kolonien enthalten> 30 Zellen und ruhenden Kolonien enthalten 12 oder weniger Zellen. Ruhende Zellen Pfannkuchen geformt, viele Male größer ist als wachsende Zellen mit großen Cytoplasma / Kern-Verhältnisse. (100-facher Vergrößerung). (C) Graph, der die klonogenen Potential von 1.500 MCF-7 menschlichen Brustkrebszellen mit und ohne FGF-2 10 ng / ml auf Fibronectin-beschichtete 24-Well-Platten inkubiert. Ohne FGF-2 wird die vorherrschende Verteilung der Zellen durch Züchten von Klonen, während in der Gegenwart von FGF vertreten 2 die große Mehrheit der Klone sind inaktiv. Experimente wurden vierfach durchgeführt. (Fehlerbalken sind + SD)
Abbildung 3: dosisabhängige Hemmung der ruhenden Klone durch pan-Rho-Familie C3-Transferase-Inhibitoren und die ROCK-Inhibitor Y27632 T-47D-Zellen wurden in der klonogenen Dichte von 1.000 Zellen pro Vertiefung auf 24-Well-Fibronektin-beschichteten Platten mit FGF-2 inkubiert. 10 ng / ml für 6 Tage. Medien waren C3 Transferase 3 oder 5 & mgr; g / ml, und die ROCK-Inhibitor Y27632 0,1, 1 oder 10 ug / ml an Tag 3 und ruhenden Klone wurden am Tag 6 der Graph rechnete zeigt eine dosisabhängige Hemmung von gefärbten ruhenden Klone 6. Tag Die ED 50 von C3 betrug etwa 3 & mgr; g / ml, während die des ROCK Inhibitors betrug zwischen 1 und 10 & mgr; M in diesem Test. Experimente wurden vierfach durchgeführt. (Fehlerbalken sind + SD)
Abb. 4: Zusammenwirken von pan-Rho Familie Inhibitor C3 mit einem Akt Inhibitor oder mit PI3-Kinase-Inhibitor auf das Überleben von ruhenden T-47D-Klone T-47D-Zellen wurden in der klonogenen Dichte von 1000 Zellen pro 24 auch Fibronektin inkubiert gut -beschichteten Platten mit FGF-2 10 ng / ml für 6 Tage. Medien, C3 Transferase 5 ug / ml, Akt Inhibitor 25 uM und 20 uM LY294002 wurden einzeln oder in Kombination an Tag 3 und ruhenden Klone hinzugefügt wurden am Tag gezählt 6. Die kombinierten Effekte von C3 und der AKT-Hemmer scheinen additiv auf diese Konzentrationen, aber die kombinierte Wirkung von C3 und dem PI3K-Inhibitor angezeigt synergistische in diesen Experimenten auf einer Inhibition der ruhenden Klon Überleben sein. Experimente wurden vierfach durchgeführt. (Fehlerbalken sind + SD)
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Abb. 5: Kombinierte Effekte von ROCK-Inhibitor Y27632 mit einem Akt Inhibitor oder mit PI3-Kinase-Inhibitor auf das Überleben von ruhenden T-47D-Klone T-47D-Zellen wurden in der klonogenen Dichte von 1000 Zellen pro 24 auch Fibronektin-beschichteten Platten inkubiert gut FGF-2 mit 10 ng / ml für 6 Tage. Medien, ROCK-Inhibitor Y27632 3 ug / ml, Akt Inhibitor 25 uM und 20 uM LY294002 wurden einzeln oder in Kombination an Tag 3 und ruhenden Klone hinzugefügt wurden am Tag 6. Die kombinierten Effekte von Y27632 und der AKT-Hemmer nicht zu sein scheinen gezählt Additiv bei diesen Konzentrationen, aber die kombinierte Wirkung von Y27632 und dem PI3K-Inhibitor scheinen mehr als Zusatzstoff in diesen Experimenten auf einer Inhibition der ruhenden Klon Überleben. Experimente wurden vierfach durchgeführt. (Fehlerbalken sind + SD)
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Abb. 6: Das Aussehen der überlebenden ruhenden T-47D-Klonen nach der Behandlung mit C3-Transferase und ROCK-Inhibitor Y27632 Colony Assays wurden vierfach in 24-Well-Fibronektin beschichteten Gewebekulturplatten bei 1.000 Zellen mit FGF-2 fest / gut, wie beschrieben, Inhibitoren wurden am Tag 3 bei den gezeigten Konzentrationen zugesetzt wurden die Zellen gefärbt und am Tag fotografiert 6. Cells mit pan-Rho Familie Inhibitoren behandelt verloren ihre Ausbreitung Aussehen, wurde klein, dendritischen und schien verzweifelt. (100-facher Vergrößerung).
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Discussion
Unser Modell besteht aus mehreren Schlüsselelemente der Vegetationsruhe im Knochenmark besteht. Es besteht aus Östrogen empfindlichen Zellen, die die Art wahrscheinlich ruhend im Mark längere Zeiträume 10 zu bleiben, sie besteht aus Fibronectin, einem wichtigen Strukturelement der Mark, FGF-2, ein Wachstumsfaktor reichlich durch die Knochenmarkstroma synthetisierten und stark in der extrazellulären Matrix von Knochenmark 31,32 und Inkubation der Zellen bei klonogenen Dichte wo ihre Wechselwirkungen sind in erster Linie mit dem Substrat abgeschieden. Während die Knochenmarkmikroumgebung viel komplexer, dieses einfache System kann mit soviel zusätzliche Komplexität bereitzustellen, um bestimmte mechanistische Fragen entstehen.
Das Modell kann verwendet werden, um zu vergleichen ruhend mit wachsenden Zellen in einer Anzahl von Weisen, einschließlich Zell biologischen Techniken molekularen Techniken und in vivo-Techniken werden. Zellphänotypen kann durch erneutes Klonieren Motilität untersucht werdenund Invasion studiert 35, nichtadhärenten tumorauslösende spherule Formation 36 oder durch funktionelle Studien zur Wechselwirkung mit der Mikroumgebung unter Verwendung von spezifischen Antikörpern oder blockierenden Peptiden 7.
Der primäre Ausgang des klonogenen Assay ist eine numerische Zählung der Kolonien entweder wachsenden oder ruhenden, was zu der wachsenden oder ruhenden klonogenen Potential der Zellen übersetzt. Wie oben angedeutet, eine große Anzahl von Variablen haben das Potential dieses Ergebnis beeinflussen, welche alle müssen streng wie möglich gesteuert werden, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Dazu gehören die Quelle von Zellen, Gesamtdurchlaufhäufigkeit Kryokonservierung Technik und die Qualität der Zellkulturen, die kryokonserviert worden ist, die Anzahl von Durchgängen, da Auftauen der Zusammenfluß der Kulturen aus dem die Einzelzellpräparate erhalten wurden, die Quelle und Qualität der fötales Kälberserum, die Dauern der Trypsinierung und ihre Reproduzierbarkeit ist die Dauervon Zellen bei Raumtemperatur belassen, die Geschicklichkeit der Pipettieren gleichwertigen Zellzahlen in jede Vertiefung, die Geschicklichkeit oder die gleichmäßige Verteilung Zellen über die gesamte Fläche von einem Brunnen, die Anzahl der eine Platte aus dem Inkubator für die Beobachtung entfernt, unter Dutzenden andere. Neben der Vertretung allgemein anerkannten Zellkultur Qualitätskontrollen, diese Variablen beeinflussen die ruhenden klonogenen Potenzial von Experiment zu Experiment. Intra experimentellen Variabilität ist typischerweise kleiner als 8-10%, jedoch, was die prozentuale Veränderung von Experiment zu Experiment, das in hohem Maße reproduzierbar sind. Typischerweise beginnt die Varianz der Daten mit einer direkten Korrelation von zunehmender Erfahrung des Experimentators mit dem System und der Zeit, in der Durchführung dieser Assays verringern.
Gen-Expression in ruhenden und wachsenden Zellen durch RT-PCR, Northern-Blot, Western Blot, Immunpräzipitation / Western und funktionale komplexen Niederschlag / Western bewertet werden, Immunfluoreszenz oder Immunhistochemie, Multiplexen durch Mikrofluidik, Raman-Spektroskopie, Durchflusszytometrie und andere Techniken. Diese Techniken können verwendet werden, um die Rolle von spezifischen Rezeptoren, andere Membranproteine, Signalwege, Transkriptionsfaktoren, Histon-Modifikationsmittel, Organellen und mitochondriale Proteine, Stoffwechselwege und Energienutzung, der Spannung und Kraft und die Interaktion mit der Mikroumgebung auf vielfältige Weise auf das zu bestimmen, Rolle der Keimruhe.
Unsere früheren Untersuchungen haben bedeutende Rolle für den PI3K-Signalwege in das Überleben der ruhenden Klone 7 als auch bei der Aufrechterhaltung der ruhenden Phänotyp mit der epithelialen Verteilung der kortikalen Aktin 15 demonstriert. Wir haben auch gezeigt, dass RhoA gesagt, müssen, um gehemmt für den ruhenden Phänotyp aktiviert sein werden. Dies steht im Gegensatz zu den hier vorgestellten Daten, in denen die Inaktivierung der Rho-Familie mit pan-Inhibitoren vermindert Überleben der ruhenden Klone. Tseine unterstreicht die Gefahr der Verwendung chemischer Inhibitoren, Mechanismen zu sezieren und die Notwendigkeit für die Verwendung von genetischen Verfahren zur Hemmung oder Aktivierung spezifischer Signalwege. Zu diesem Zweck eignet sich die Methode zur genetischen Manipulation von Zellen, entweder durch permanente Transfektion oder Transduktion oder durch transiente Transfektion 15, siRNA oder Nanopartikel. Da der Assay beträgt 6 Tage in der Dauer, die transiente Genexpression, Störung wird in signifikanten phänotypischen Effekten bei 6 Tagen, die geschätzt werden kann.
Erkenntnis, ihr Potenzial für das Studium Mechanismen der Eingabe sowie Verlassen Ruhe, untersuchen wir derzeit Mechanismen für diese Zellen zu Ruhe zu entkommen. Bei der Eingabe von Keimruhe ist wenig bekannt, ist ein Verständnis der Mechanismen für die Ausfahrt aus dem Ruhezustand sogar noch weitere Ferne gerückt. Wir haben Vorbemerkungen berichtet, dass entzündliche Reaktionen von verletzten Stroma kann dem Wiedererwachen der dor beitragenmant MCF-7-Zellen unter Verwendung dieses Modells 37. Das Modell kann auf T-47-Zellen angewendet werden, ein weiterer ER + Brustkrebs-Zelllinie. Während ER- Zellen nicht ruhend in Reaktion auf FGF-2 zu werden, kann es möglich sein, die Methodik auf andere Krebszelltypen mit verschiedenen Differenzierungsmittel in zukünftigen Untersuchungen anzupassen.
Obwohl es eine sehr nützliche Technik zur Identifizierung Schlüsselmechanismus in Keimruhe beteiligt, bleibt es ein In-vitro-Modell. Jedoch können Zellen, die Ruhephase oder in vitro-Manipulation durchgemacht haben zur Xenograft Tumorbildungsfähigkeit getestet werden. Das Hauptpotenzial Vorteil des Systems ist jedoch die Identifizierung von Mechanismen, die die Entwicklung einer Hypothese, die in hoch komplexen in-vivo-Modellen getestet werden Dormanz kann erlauben.
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Disclosures
Unterstützt durch das Department of Defense Grants DAMD17-01-C-0343 und DAMD17-03-1-0524, die New Jersey State Kommission für Cancer Research 02-1140-CCR-E0 und der Ruth Estrin Goldberg Memorial für Krebsforschung (RW)
Acknowledgments
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCF-7 cells | ATCC | HTB-22 | |
| T47D cells | ATCC | HTB-123 | |
| BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Plate | Corning | 354411 | |
| BD BioCoat Fibronectin 60 mm Culture Dishes | Corning | 354403 | |
| BD BioCoat Fibronectin 100 mm Culture Dishes | Corning | 354451 | |
| BD BioCoat 22x22mm #1 Glass Coverslip with a uniform application of human fibronectin | Corning | 354088 | |
| 6 Well tissue culture plate | CellTreat | 229106 | |
| Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X Powder | Corning Life Sciences | 50-013-PB | |
| Heat Inactivated, Fetal Bovine Serum | Serum Source International | FB02-500HI | |
| 0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100X | Corning | 30-002-CI | |
| L-Glutamine, 100x, Liquid | Corning | 25-005-CI | |
| Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 234-FSE-025 | |
| Akt Inhibitor (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycerocarbonate) | CalBiochem | 124005 | |
| LY294002 | CalBiochem | 19-142 | Chenical PI3K inhibitor |
| C3 transferase | Cytoskeleton | CTO3 | Inhibits RhoA, RhoB, and RhoC, but not related GTPases such as Cdc42 or Rac1 |
| Y-27632 dihydrochloride | Santa Cruz Biotechnology | 129830-28-2 | |
| BODIPY FL-Phallacidin (green) | Molecular Probes | B607 | Fluorochrome for fibrillar actin staining |
| BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (red) | Molecular Probes | R415 | Fluorochrome for fibrillar actin staining |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Antibody, ReadyProbes Reagent | Molecular Probes | R37114 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Molecular Probes | P-36931 |
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