Introduction
Borstkanker metastaseren naar het beenmerg voordat de ziekte detecteerbaar 1, zodra kleine kankers bloedvaten 2,3. De metastatische proces is snel, maar inefficiënt. Cellen voer de nieuwe bloedvaten snel, met miljoenen per dag 4, maar enkele overleven de reis naar verre organen 5. Niettemin zijn sommige micrometastasen overleven in het bot en kan worden gevonden als enkelvoudige cellen of kleine celklonten in beenmergaspiraten van nieuw gediagnosticeerde patiënten 1. Deze cellen weerstaan adjuvante chemotherapie, die wordt toegediend voor het doel van het elimineren van hen 6. Deze weerstand is begiftigd, aanzienlijk, door de overleving signalering geïnitieerd door interacties met de beenmerg micro-omgeving 7,8. Micrometastasen te vinden bij ongeveer een derde van de vrouwen met gelokaliseerde borstkanker brengen en een onafhankelijke indicator van overleving bij analyse van univariate analyse 9. Sommige micrometastases zijn groei geïnitieerd, maar herhaling patronen afhankelijk van het type cel. Patiënten met triple negatieve borstkanker steeds terug komen tussen 1-4 jaar, wat suggereert slechte controle over de rusttoestand. Andere celtypen, waaronder ER / PR + cellen, tot 20 jaar slapend blijven, met een stationair continu recidief 10. Terwijl verschillen in slaaptoestand genexpressie handtekeningen tussen ER + en ER borstkanker cellijnen en tumoren weerspiegelen verschillende slaaptoestand potentials 11, interacties met beenmerg stroma waarschijnlijk betekenen een belangrijke bijdrage aan de kiemrust.
De studie slaaptoestand in vivo is buitengewoon moeilijk, omdat micrometastasen zeldzaam en worden overtroffen door hematopoietische cellen met meer dan 10 6-voudige. Daarom moet relevante modellen worden gegenereerd die voorzien in vitro data die mechanismen kunnen suggereren en het genereren van toetsbare hypothesen in vivo. Een aantal slaaptoestand modellen, waaronder matheuitkraging modellen 12,13, in vitro modellen 7,8,14,15, in vivo xenograft modellen 16 combinaties van in vitro en xenograft modellen 17,18 en spontane tumoren en metastase model 19, hebben enig inzicht in kankercel rusttoestand 20 opleverde . Elk van deze modellen hebben hun eigen beperkingen en zijn van zichzelf vooral nuttig voor het genereren van hypothesen over moleculaire signalering en interacties die bepalen slaaptoestand te testen in meer biologisch relevante modellen.
Met het algemene doel van het definiëren van de moleculaire mechanismen van slaaptoestand, de interacties met de micro-omgeving die resulteert in cyclus arrest, redifferentiatie en therapeutische weerstand en mechanismen die leiden tot een herhaling in ER + cellen, we een in vitro model dat zorgt voor geselecteerde relevante elementen van de ontwikkelde stromale micromilieu 7. Dit model, terwijl relatief schaars in zijn componenten, voldoende robuust is om onderzoekers mogelijk om specifieke moleculaire mechanismen die significant functies slaaptoestand invloed afleiden. Deze experimenten genereren hypotheses die direct kunnen worden getest in vivo. Het model is gebaseerd op een aantal belangrijke elementen die we aangetoond relevant rusttoestand zijn. Zij omvatten het gebruik van oestrogeen-afhankelijke borstkanker cellen, kweken van cellen in een klonale dichtheid waar hun interactie primair bij de ondergrond en oplosbare bestanddelen van het medium, een fibronectine substraat en de aanwezigheid van basische fibroblast groeifactor (FGF-2) in het medium.
We kenmerk mechanismen die het systeem regelen in vitro, waaronder de inductie van celcyclus arrestatie door FGF-2 21, gemedieerd door TGFp 22, overleving signalering door PI3 kinase ERK 7,8 tot 8 en morfogene differentiatie epitheliale fenotype, dat op afhing RhoA inactivering integrine45, 5β1 opregulatie en ligatie van stromale fibronectine voor overleving 7,15 (figuur 1). De in vitro celcyclus effecten van FGF-2 aan MCF-7 cellen beginnen bij concentraties ten minste één log dan 10 ng / ml 21,23. De grondgedachte was gebaseerd op de temporele controle van FGF-2 expressie betreffende mammaire ductale morfogenese, cyclische expansie en recessie in een aantal zoogdiersystemen 24-27. We toonden aan dat FGF-2 induceert, waaronder ductale morfogenese in 3D cultuur 28 en dat FGF-2 expressie algemeen verloren maligne transformatie van humane tumoren 29. De expressie van FGR1 bleef intact in borstcarcinomen ondervraagde 29 en MCF-7 cellen blijven alle 4 FGF-receptoren 30 te drukken. In de context van de slaaptoestand, is FGF-2 werd uitgevoerd door en zwaar afgezet op beenmerg stroma 31,32 wanneer het functioneert in het behoud van hematopoietische stamcellen 33. We demonstrated dat FGF-2 leidt tot een slapende toestand in ER + borstkankercellen gekweekt op fibronectine substraten, ook overvloedig in het beenmerg, waar het induceert morfogenisch differentiatie 7. In het model borstkankercellen zijn groei geremd, inactiveren Rho A via RhoGap GRAF, redifferentiate een epitheliaal fenotype en re-express integrinen α5β1 lost met maligne progressie. Ze binden fibronectine door middel van integrine α5β1 en activeer survival signaleren dat ze bestand zijn tegen cytotoxische therapie 7,8,15 (figuur 1) te maken. Remming van Rho GTPases klasse is eerder aangetoond dat een slapende fenotype 34 induceren.
Hier zullen we de specifieke procedures die onderzoekers zullen toelaten om het model vast te stellen en te bestuderen specifieke moleculaire en cellulaire mechanismen die rustperiode van ER + borstkankercellen schetsen. In de experimenten die hier ter illustratie van het gebruik van het modelWij gerichte PI3K (Figuur 1B) met een Akt-remmer en een PI3K remmer en alle leden van de Rho familie (Figuur 1B) met een pan-Rho inhibitor en een Rho kinase (ROCK) inhibitor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Klonale Assay
- Bereid een enkele cel suspensies van oestrogeen-afhankelijke borstkanker cellijnen MCF-7 en T47D cellen met behulp van de onderstaande stappen
- Zuig het kweekmedium (DMEM / 10% door warmte geïnactiveerd foetaal kalfsserum / glutamine en pen / strep) uit een 10 cm weefsel kweekplaat die niet meer dan 50% confluent met MCF-7 en T-47D-cellen. Spoelen met PBS. Incubeer met 0,25% trypsine / 2,21 mM EDTA opgelost in DMEM hoog glucose bij 37 ° C gedurende 1-4 min.
- Controle cellen op 1 minuut intervallen onder een fasecontrastmicroscoop een enkele cel verdeling ontstaat. Resuspendeer de cellen met een pipet 2 ml door pipetteren en neer meerdere malen verstoren cel-cel contact tot een bijna onveranderlijk enkel statuscel bereiken.
- Blijf cellen incuberen in trypsine bij 37 ° C gedurende 4 minuten als je klompjes cellen waarnemen na slechts 2 min incubatie. Heeft deze cellen voor Monogene studies niet gebruiken als ze aanhanger e blijvenandere na 4 min van trypsinisatie ach, omdat fout zal in de kolonie aantal opbrengst worden ingevoerd.
OPMERKING: Indien cellen samengeklonterd, wordt het aantal gevormde kolonies het product van minder cellen dan het aantal geïncubeerd weerspiegelen. Als cellen overmatig worden getrypsiniseerd, hun clonogene potentiaal verminderd. - Bereid een enkele celsuspensie van 1500 cellen / ml kweekmedium voor 24 putjes of minder (+ 500 cellen / ml, afhankelijk van het celtype of passage nummer) door seriële verdunningen in een master buis met het gehele volume nodig voor alle variabelen in het experiment.
Opmerking: Het doel is een uiteindelijke celdichtheid van 800 cellen / cm 2 (bereik van ongeveer 500 tot 1100 cellen / cm2). Het doel is om ongeveer 100 + 50 kolonies verkregen, die relatief eenvoudig tellen toelaat, voorkomt crowding en voldoende kan kolonies tot significante statistische verschillen wanneer kolonies worden verhoogd of verlaagd met experimentele perturbaties.
- Incubeer cellen op Klonale Density Met behulp van onderstaande stappen
- Incubeer cellen in viervoud putjes on 24 goed fibronectine beklede platen bij een dichtheid van clonogene 1500 cellen / well van een meester enkele celsuspensie tube 1.500 cellen / ml. Vermaal het medium dat cellen met een pipet 5 ml door het opstellen van 3 ml en het doseren van 1 ml medium in elk van 2 waterputten.
OPMERKING: fibronectine beklede platen worden gekocht pre-coated van een commerciële leverancier. Coating platen buiten een kwaliteitscontrole, geautomatiseerd proces resulteert in een ongelijk oppervlak ongeschikt voor deze assay. - Meng de schorsing door en neer te pipetteren met een pipet 5 ml, opstellen 3 ml celsuspensie en vul 2 putten met elk 1 ml. Fill slechts 2 wells per keer van de ene pipet. Zet de resterende volume in de pipet om de celsuspensie in de master buis, resuspendeer cellen weer door en neer te pipetteren en het opstellen van een 3 ml aan een andere 2 wel te vullenls met elk 1 ml.
OPMERKING: Continue menging van de master buis is noodzakelijk, omdat cellen continu zal sediment. Het opstellen van voldoende volume om slechts 2 putten te vullen is het noodzakelijk om soortgelijke cel aantallen aan elk putje toevoegen omdat cellen sediment in de pipet ook. - Werk snel tot grote hoeveelheden cellen te verdelen, omdat waardoor cellen te zitten in suspensie bij kamertemperatuur en CO 2 concentratie zal de clonogene potentiaal (ongepubliceerde observaties) moduleren.
- Optimaliseren van de ruimtelijke verdeling van de cellen tijdens de handeling van het pipetteren hen in putten voor kolonie assays. Doe dit door langzaam pipetteren de suspensie die de uiteindelijke celconcentratie in het midden van de put. Laat de plaat om de beweging verder niet bloot voordat de cellen naar de bodem. Niet zwenk de plaat omdat cirkelvormige vermenging effectief Centrifugeer de cellen aan de omtrek van de put het hoge celdichtheden en ontelbare confluente kolonies 6 dagen.
OPMERKING: indien noodzakelijk niet mengen want dit is minder wenselijk dan geen vermenging helemaal na de introductie van het volume met de cellen in suspensie. Indien het noodzakelijk is om cellen te mengen, doen aan door de plaat heen en weer loodrechte richtingen, terwijl daarvoor een vlakke ondergrond. - Incubeer de cellen bij 37 ° C 5% CO 2 zonder media verandering voor 6 dagen. Het kleine aantal cellen in een goed na 6 dagen niet significant zal invloed hebben op de nutriënt of cytokine samenstelling of de pH van het oorspronkelijke medium.
- Ontwerp van het tijdsverloop van de assay als volgt: Incubeer cellen aan fibronectine gecoate substraten op dag 1. Vervang bestaande medium met 1 ml vers medium en vers medium dat FGF-2 10 ng / ml op dag 0. Stain cellen op dag 6 als hieronder in 1.4). Gedrag elke experimentele storingen op dag 3, zoals hieronder in 1.3).
- Incubeer cellen in viervoud putjes on 24 goed fibronectine beklede platen bij een dichtheid van clonogene 1500 cellen / well van een meester enkele celsuspensie tube 1.500 cellen / ml. Vermaal het medium dat cellen met een pipet 5 ml door het opstellen van 3 ml en het doseren van 1 ml medium in elk van 2 waterputten.
- Set Up Experimentele Verstoringen van Molecular Signaling of adhesiemoleculen
- Op dag 3, voeg 10056, l van een oplossing die 10x van de uiteindelijke beoogde concentratie van het verstorende middel aan het 1 ml medium in de putjes. Niet mengen. Blijf de cellen te incuberen bij 37 ° C, 5% CO 2 gedurende nog 3 dagen.
OPMERKING: verstorende stoffen kunnen omvatten een scala van remmers en blokkerende middelen van adhesie moleculen, receptoren of andere oppervlakte-eiwitten, remmers van intracellulaire signaalroutes, moleculen, factoren, co-factoren of structurele eiwitten, die rol kunnen spelen in het ondersteunen van de slapende toestand. - Stain kolonies op dag 6 als volgt.
- Op dag 3, voeg 10056, l van een oplossing die 10x van de uiteindelijke beoogde concentratie van het verstorende middel aan het 1 ml medium in de putjes. Niet mengen. Blijf de cellen te incuberen bij 37 ° C, 5% CO 2 gedurende nog 3 dagen.
- Stain Kolonies
- Stain cellen na 6 dagen in kweek met een vers bereide 0,1% kristalviolet in 2% ethanol / 10 mM natriumboraat (pH 9,0) oplossing. Zuig media en voeg een ml kristalviolet oplossing in elk putje gedurende 20 min.
- Spoel de platen door onderdompeling ze met de goed openingen naar beneden in een scherpe hoek in een ijs emmer vol met continu lopende kraanwater in de gootsteen. Kantel de plaat naar een horizontale hoek eenmaal onder water, ook het openen naar beneden, en dan kantelen terug naar een scherpe hoek bij het verwijderen in een zachte vloeiende beweging.
- Herhaal de onderdompeling 2 of 3 totdat het water op de bodem van de putjes niet langer blauw. Krachtige wassen kunnen cellen of kolonies die minder hechtend wijten aan experimentele interventie verwijderen, aanzienlijk bijdraagt aan de fout in het tellen en de gegevens.
- Droge platen 's nachts door ze ondersteboven op handdoeken op de bank top grenzend aan hun corresponderende label covers.
- Count Kolonies
- Tel het aantal groeiende en slapende kolonies in elk putje na 6 dagen incubatie kleuring en drogen. Telling kolonies optimaal bij een vergroting van 40x op een omgekeerde fase contrast microscoop. Telling kolonies van> 30 cellen groeien en kolonies van 12 of meer cellen met morfologische tekenen van zeer grote omvang in vergelijking met groeiende cellen, grote expanded cytoplasma met grote cytoplasma verhoudingen, getoond in figuur 1 7,15 kern.
OPMERKING: Clusters van 13-29 cellen normaal geteld zij niet zeer frequent in eenvoudige kiemrust assays. Ze kunnen worden geteld als verstoringen verschuiven van het groeipotentieel van zowel groeien of slapende cellen. Deze resultaten zullen dan moeten worden gecorreleerd met biologische betekenis.
- Tel het aantal groeiende en slapende kolonies in elk putje na 6 dagen incubatie kleuring en drogen. Telling kolonies optimaal bij een vergroting van 40x op een omgekeerde fase contrast microscoop. Telling kolonies van> 30 cellen groeien en kolonies van 12 of meer cellen met morfologische tekenen van zeer grote omvang in vergelijking met groeiende cellen, grote expanded cytoplasma met grote cytoplasma verhoudingen, getoond in figuur 1 7,15 kern.
2. Klonale Incubatie Immunofluorescentie studies
- Pas celaantallen ongeveer 7,500-8,000 cellen / putje in 6-puts platen, overeenkomen met nummers / oppervlaktegebied analoog aan 24 goed cel experimenten.
- Plaats een ronde, steriel, met fibronectine gecoate dekglaasje in elk putje voet van 6 goed platen voor imaging studies voorafgaand aan de cel toevoeging. Pipet cellen in 3 ml volumes in elk putje 2 wells per keer bij concentraties uiteengezet, zoals beschreven voor de clonogene experimenten beschreven in 1.2).
- Incubeer cellengedurende 6 dagen, zoals beschreven in 1.2.4 en 1.2.5. Voeg verstorende factoren op dag 3 10x concentraties in 300 gl volumes, zoals beschreven in de kolonie testprocedures in 1,3).
- Stain cellen op dag 6 met antilichamen tegen adhesiemoleculen cel zoals integrinen α4, α5, α6, β1, β3 bijvoorbeeld focal adhesion molecules complex FAK, paxillin en vinculin bijvoorbeeld eiwitten betrokken bij motiliteit zoals α-tubuline, bijvoorbeeld, signaling pathway leden, zoals fosfo-Akt, fosfo-ERK, fosfo-p38, fosfo-JNK, bijvoorbeeld, of elk ander eiwit dat het doelwit van onderzoek op zijn rol in slaaptoestand, onder toepassing van standaardtechnieken voor directe of indirecte immunofluorescentiekleuring.
- Verwijder dia's met een pincet dag 6. Fix in aceton / methanol 1: 1 op -20 ° C gedurende 20 min en de lucht drogen. Een alternatief fixatief, zoals paraformaldehyde kan worden toegepast, indien nodig. Permeabilize cellen met 0,1% Triton X-100, 0,1% natriumcitraat gedurende 2 min fof detectie van intracellulaire antigenen. Was de cellen met PBS.
- Voor indirecte immunofluorecence kleuring block objectglaasjes gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met 5% BSA of met 10% pre-immuun serum van de soort waarin het tweede antilichaam was opgewekt.
- Incubeer overnacht bij 4 ° C met primaire antilichamen tegen adhesiemoleculen, focal complexe moleculen cel, signaling pathway leden of enig ander eiwit dat het doelwit van onderzoek op zijn rol in rusttoestand verdund specifieke verdunningen aanbevolen door de fabrikant in PBS 0,1% TRITON X -100.
- Was 3 maal met PBS. Incubeer dekglaasjes met fluorofoor geconjugeerde antilichamen bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. Als voorbeeld kan Alexa Fluor 488 Ezel anti-muis IgG antilichaam worden gebruikt om monoklonale primaire antilichamen te detecteren. Mount coverslips cel naar beneden op glasplaatjes met behulp van een antifade agent met Dapi. Sluit de perimeters met nagellak.
- Voor directe immunofluorescentie, het uitvoeren van de BSAblokkering zoals beschreven in 2.4.2), incubeer met fluorofoor geconjugeerd primair antilichaam overnacht bij 4 ° C. Was 3 maal met PBS. Incubeer de glaasjes met een antifade middel en Dapi en afdichting met nagellak.
- Cover slide trays met aluminiumfolie en bewaar bij 4 ° C voor imaging en fotografie op elk gewenst moment tot enkele weken later. Bekijk en foto cellen met behulp van een fluorescentie microscopische beeldvormende systemen uitgerust met een camera op 1000x.
- Voor fibrillair actine kleuring blok glaasjes in 1% runderserumalbumine (BSA) gedurende 30 min en incubeer in BODIPY FL-Phallacidin (groen) of Rhodamine phalloidin (red) bij kamertemperatuur gedurende 20 min. Voeg een antifade middel en afdichting als hierboven.
3. Klonale Incubation voor Moleculaire Studies
- Western Blots
- Incubate ER + borstkankercellen MCF-7 of T47D op klonogene dichtheid van 20.000 cellen / 60 mm plaat en 50.000 cellen / 100 mm plaat op fibronectin-beklede platen bij 37 ° C in 5% CO 2.
- Incubeer cellen tegen iets hogere dichtheden van 75.000 cellen / 100 mm plaat voor moleculaire studies vereisen mg bedragen voor eiwit uit lysaten. Gebruik maximaal tien platen per experimentele punt om voldoende eiwitten te verzamelen voor moleculaire studies met behulp van Western blots of voor RNA-isolatie voor Northern vlekken.
- Cell nummer gel op basis van laden is een noodzakelijke aanvulling voor het vergelijken van eiwitexpressie in enorm verschillend formaat groeiende en slapende cellen. Verzamel cellen door trypsinizing en tel een portie in een hemocytometer in 0,2% trypan Blue voor de bereiding van lysaten voor Western blots in plaats van het afschrapen van de cellen met een enkele rand mes.
- Centrifugeer cellen bij 10.000 xg gedurende 2 minuten, verwijder media door aspiratie, voeg 200 ul lysisbuffer, ultrasone trillingen de cellen in lysisbuffer en bepaal de eiwitconcentratie.
- Bereken de hoeveelheid eiwit per cel door de eiwitopbrengst te delen door het aantal cellendat gegenereerd dat bedrag. Laad het lysaat in elk putje van afzonderlijke polyacrylamide gels die zowel a) equivalente hoeveelheden proteïne en b) -eiwit hoeveelheden die gelijk aantal cellen vertegenwoordigt. Ten minste 25 ug eiwit moet in elk geladen put.
Opmerking: Dit zal vergelijkingen tussen groeien en slapende cellen, die significant verschillend in grootte en eiwitgehalte (figuur 1) zijn mogelijk.
- Flowcytometrie
- Verzamel cellen van 100 mm platen door behandeling met trypsine, zoals bij 3,1 en geanalyseerd door middel van standaard fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) protocol gebruikmakend van primaire of secundaire immunofluorescente kleuring voor intracellulaire of extracellulaire antigenen, zoals beschreven in 2.4.
Opmerking: Het losmaken cellen uit weefsel kweekplaten door trypsinisatie beïnvloedt de concentratie van membraaneiwitten zoals bepaald door antilichaam labeling.
- Verzamel cellen van 100 mm platen door behandeling met trypsine, zoals bij 3,1 en geanalyseerd door middel van standaard fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) protocol gebruikmakend van primaire of secundaire immunofluorescente kleuring voor intracellulaire of extracellulaire antigenen, zoals beschreven in 2.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Experimenten werden uitgevoerd om de test herhalen. Het tijdsverloop van het experiment wordt getoond in figuur 2A. Cellen worden geïncubeerd bij klonale dichtheid op dag -1, wordt FGF-2 in vers medium wordt toegevoegd op dag 0 en cellen worden gekweekt tot en met dag 6 als zij worden gekleurd en de kolonies worden geteld. Eventuele storingen aan het systeem toegediend op dag 3 in 100 gl volumes bij 10x eindconcentratie gewenst. Figuur 2B toont de typische uiterlijk teelt en slapende kolonies. Groeien kolonies bevatten> 30 cellen en slapende kolonies bevatten 12 of meer cellen die vele malen groter dan groeiende cellen met grote cytoplasma / celkern verhoudingen. Figuur 2C toont een typische experimentele resultaten uitgevoerd in viervoud. De overheersende verdeling van cellen zonder toevoeging van FGF-2 wordt weergegeven door groeiende klonen, terwijl in aanwezigheid van FGF-2, de meeste klonen slapende.
nhoud "> Figuur 3 is een voorbeeld van een experiment waarin verstoren middelen werden toegevoegd op dag 3. De figuur geeft de dosisafhankelijke inhibitie van slapende klonen door remmen van de familie Rho GTPases van een pan-Rho C3 transferase inhibitor en een Rho kinase (ROCK) inhibitor Y27632. De test kan de ED 50 van toegevoegde remmers op slapende klonen en de toenemende klonen te beoordelen. In dit experiment werd het effect op de groei klonen werd niet bepaald, aangezien daarmee slechts gepresenteerd om de werkwijze te illustreren.Figuren 4 en 5 tonen dat de test kan worden gebruikt om de gecombineerde effecten van remmers op de overleving van de slapende klonen te beoordelen. Onze eerdere studies hebben aangetoond dat de PI3K ondergaat een aanhoudende activatie in slapende cellen in dit model en remming van zowel PI3K en Akt gedeeltelijk remt de overleving van de slapende klonen 7. Hier, inleidende opmerkingen, aangetoond that-specifieke inhibitie van de familie Rho van kleine GTPases ook gedeeltelijk remt de overleving van slapende klonen. De gegevens in figuren 4 en 5 tonen aan dat de combinatie remming van PI3K en een van de downstream effectoren, AKT, met de remming van de Rho familie met C3 transferase en ROCK inhibitor de overleving van de slapende klonen in sommige gevallen bijna volledig kan verwijderen. We hebben eerder aangetoond dat slapende klonen overleven van de remming van PI3K maar niet van Akt bestaan uit cellen die niet langer vertonen slapende fenotype, maar lijken mesenchymale en distressed 7. Cellen in slapende klonen waarin de Rho-familie is grotendeels geïnhibeerd door C3 transferase en ROCK inhibitor verliezen ook de typische slapende uiterlijk aannemen fibrolastoid optredens en geplooide membranen alsook verschijnen verontrust (figuur 6). Deze experimenten tonen een model dat kan worden opgevraagd in een zeer brOAD manier om een goed begrip van de elementen die slaaptoestand en weerstand regeren de therapie te bereiken.
Figuur 1: Mechanismen die onze in vitro model rusttoestand (A) kweken en slapende MCF-7 klonen na 6 dagen incubatie bij klonale dichtheid op met fibronectine beklede platen met en zonder FGF2 10 ng / ml 7 (100X vergroting).. (B) Samenvatting schema waarin de gegevens die FGFR en integrine α5β1 parallel steady state signalering is vereist om te activeren en slaaptoestand 7 behouden. FGF-2 upreguleert cycline afhankelijke kinase-remmers resulteert in G1 arrestatie 21, activeert ERK 8 en PI3 kinase 7 dat initiatesurvival signalering en upregulate integrine α5β1 7, waarmee steady-state na enkele dagen bereikt. Dual signalering through FGFR tot PI3K en onafhankelijk tot ligatie van α5β1 integrine door fibronectine zijn vereist voor activatie van FAK en membraanlokalisatie en activering van de RhoA GAP GRAF 15. Dit resulteert in de inactivatie van RhoA en een tolerante steady state voor corticale herschikking van F-actine (-phalloidin gekleurd microfoto), epitheliale re-differentiatie en kiemrust 15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Elementen van de in vitro assay rusttoestand (A) Schema van de temporele componenten van het assay kiemrust.. De cellen worden geïncubeerd op fibronectine gecoate weefselkweek platen bij klonale dichtheid bij een maximale dichtheid van 1500 cellen / putje van een 24 putjes plaat in een incubator bij 37 ° C en 5% CO 2 op dag 1 wordt het medium vervangen op dag 0 met vers medium en vers medium dat FGF-2 10 ng / ml en de cellen worden opnieuw geïncubeerd. De cellen worden gekleurd met kristalviolet oplossing, zoals beschreven, op dag 6. remmers of verstoring middelen worden toegevoegd op dag 3 in 100 gl volumes bij 10x gewenste concentraties en de cellen worden opnieuw geïncubeerd tot en met dag 6 (B) Het uiterlijk van gekleurde groeien en slapende MCF-7 kolonies. Groeien kolonies bevatten> 30 cellen en slapende kolonies bevatten 12 of minder cellen. Slapende cellen pannekoek gevormd, vele malen groter dan groeiende cellen met grote cytoplasma / nucleus verhoudingen. (100X vergroting). (C) Graph waaruit het clonogene potentiaal van 1500 MCF-7 humane borstkankercellen geïncubeerd met en zonder FGF-2 10 ng / ml aan met fibronectine beklede platen met 24 putjes. Zonder FGF-2 wordt voornamelijk verdeling van cellen weergegeven door toenemende klonen terwijl in aanwezigheid van FGF- 2 de meeste klonen slapende. Experimenten werden uitgevoerd in viervoud. (Error bars + SD)
Figuur 3: Dosis-afhankelijke remming van slapende klonen door pan-Rho familie remmers C3 transferase en de ROCK inhibitor Y27632 T-47D-cellen werden bij de klonogene dichtheid van 1.000 cellen per putje op 24 goed fibronectine beklede platen met FGF-2. 10 ng / ml gedurende 6 dagen. Media, C3 transferase 3 of 5 ug / ml, en de ROCK inhibitor Y27632 0,1, 1 of 10 ug / ml werden op dag 3 en sluimerende klonen werden geteld op dag 6. De grafiek toont een remming van gekleurde slapende klonen dosisafhankelijk van dag 6. De ED 50 van C3 ongeveer 3 ug / ml, terwijl die van de ROCK inhibitor was tussen 1 en 10 uM in deze assay. Experimenten werden uitgevoerd in viervoud. (Error bars + SD)
Figuur 4:. Gecombineerde effecten van pan-Rho familie inhibitor C3 met Akt-remmer of een PI3 kinase remmer op de overleving van de slapende T-47D-klonen T-47D-cellen werden geïncubeerd bij het clonogene dichtheid van 1000 cellen per well op 24 zowel fibronectine beklede platen met FGF-2 10 ng / ml gedurende 6 dagen. Media, C3 transferase 5 ug / ml, Akt remmer 25 pM en 20 pM LY294002 werden afzonderlijk of in combinatie op dag 3 en sluimerende klonen toegevoegd werden geteld op dag 6. De gecombineerde effecten van C3 en AKT inhibitor lijken additief deze concentraties maar de gecombineerde effecten van C3 en de PI3K remmer weergegeven synergistisch deze experimenten op remming van slapende kloon overleven te zijn. Experimenten werden uitgevoerd in viervoud. (Error bars + SD)
= "Figuur 5" src = "/ files / ftp_upload / 52672 / 52672fig5.jpg" />
Figuur 5:. Gecombineerde effecten van ROCK inhibitor Y27632 met Akt-remmer of een PI3 kinase remmer op de overleving van de slapende T-47D-klonen T-47D-cellen werden geïncubeerd bij het clonogene dichtheid van 1000 cellen per well op 24 en fibronectine beklede platen met FGF-2 10 ng / ml gedurende 6 dagen. Media, ROCK inhibitor Y27632 3 ug / ml, Akt remmer 25 pM en 20 pM LY294002 werden afzonderlijk of in combinatie op dag 3 en sluimerende klonen toegevoegd werden geteld op dag 6. De gecombineerde effecten van Y27632 en AKT-remmer niet lijken additief bij deze concentraties maar de gecombineerde effecten van Y27632 en de PI3K remmer lijken meer dan additief in deze experimenten op remming van slapende kloon overleven. Experimenten werden uitgevoerd in viervoud. (Error bars + SD)
.jpg "/>
Figuur 6:. Het verschijnen van overlevende slapende T-47D klonen na behandeling met C3 transferase en ROCK inhibitor Y27632 in viervoud Kolonie assays werden gevestigd in 24 zowel fibronectine beklede weefselkweekplaten bij 1000 cellen / putje met FGF-2, zoals beschreven, inhibitors werden toegevoegd op dag 3 in de getoonde concentraties werden de cellen gekleurd en gefotografeerd op dag 6. Cellen behandeld met pan-Rho familie remmers verloren hun verspreiding verschijning, werd klein, dendritische en verscheen bedroefd. (100X vergroting).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ons model bestaat uit een aantal belangrijke onderdelen van latentie in het beenmerg. Het bestaat uit oestrogeen gevoelige cellen, waarbij de slapende soort dat in het merg langere tijd 10 tot overblijven, het bestaat uit fibronectine, een essentieel structureel element van het merg, FGF-2, een groeifactor overvloedig gesynthetiseerd door het beenmerg stroma en zwaar afgezet in de extracellulaire matrix van het beenmerg 31,32 en incubatie van cellen bij Monogene dichtheid waar hun interacties primair bij de ondergrond. Terwijl de beenmergmicromilieu veel complexer, kan deze eenvoudig systeem worden gebouwd met zoveel extra complexiteit behoefte om specifieke mechanistische vragen.
Het model kan worden gebruikt voor het vergelijken slapende met groeiende cellen in een aantal manieren, waaronder cel biologische technieken van moleculaire technieken en in vivo technieken. Cellulaire fenotypes kan worden getest door het opnieuw kloneren, motiliteiten de invasie bestudeert 35, nonadherent tumor-initiërende spherule vorming 36 of door functionele studies voor de interactie met de micro-omgeving met behulp van specifieke blokkerende antilichamen of peptiden 7.
De primaire uitvoer van de klonogene assay is een numerieke telling van de kolonies, hetzij groeien of slapend, wat zich vertaalt naar de groeiende of slapend clonogene potentiaal van de cellen. Zoals hierboven gesuggereerd, een groot aantal variabelen hebben het potentieel beïnvloeden deze uitkomst, die als streng moet worden bestuurd mogelijk om reproduceerbare resultaten op. Deze omvatten de bron van cellen, totale passage nummer, cryopreservatie techniek en de kwaliteit van de celkweken die gecryoconserveerd zijn, het aantal passages ontdooien, aangezien de samenvloeiing van culturen waar de enkele cel preparaten werden verkregen, de bron en de kwaliteit van de foetaal kalfsserum, de duur van behandeling met trypsine en de reproduceerbaarheid, de duurcellen bij kamertemperatuur, de beweeglijkheid van pipetteren gelijke celaantallen in elk putje, de beweeglijkheid of gelijkmatig verdelen cellen over het gehele oppervlak van een put, het aantal keren per plaat uit de incubator voor observatie, tussen tientallen anderen. In aanvulling op die algemeen aanvaarde weefselkweek kwaliteitscontroles, deze variabelen van invloed op de slapende Monogene potentieel van experiment om te experimenteren. Intra-experimentele variabiliteit is typisch minder dan 8-10%, maar resulteert in procenten van experiment tot experiment die zeer reproduceerbaar. Gewoonlijk begint de variantie van de gegevens af te nemen bij een directe correlatie van toegenomen ervaring van de onderzoeker met het systeem en de tijd uitvoeren van deze assay.
Genexpressie in slapende en groeiende cellen kan worden bepaald door RT PCR, Northern blot, Western blot, immunoprecipitatie / Western en functioneel complex precipitatie / Western, Immunofluorescentie of immunohistochemie, multiplexing van microfluidics, Raman spectroscopie, flowcytometrie en andere technieken. Deze technieken kunnen worden gebruikt om de rol van specifieke receptoren, andere membraaneiwitten, signaalroutes, transcriptiefactoren, histon modifiers, organellen en mitochondriale eiwitten, metabole wegen en energiegebruik, spanning en kracht en interactie met de micro talloze manieren voor het bepalen rol van kiemrust.
Onze eerdere studies hebben belangrijke rollen voor de PI3K trajecten in overleving van slapende klonen 7 en het handhaven van de slapende fenotype met epitheliale verdeling van corticale actine 15 aangetoond. We hebben ook aangetoond dat RhoA bepaald moet worden geremd zodat de slapende fenotype te activeren. Dit in tegenstelling tot de hier gepresenteerde gegevens, waarbij inactivering van de Rho familie van pan-remmers vermindert de overleving van de slapende klonen. Tzijn onderstreept het gevaar van het gebruik van chemische inhibitoren mechanismen ontleden en de noodzaak van het gebruik van genetische benaderingen remmen of activeren specifieke trajecten. Om dit te bereiken de methode leent zich voor genetische manipulatie van de cellen, hetzij permanent transfectie of transductie of door voorbijgaande transfectie 15, siRNA of nanodeeltjes. Aangezien de test 6 dagen duurt, transiënte genexpressie worden aangetast en zal leiden tot significante fenotypische effecten in 6 dagen die kan worden gemeten.
Herkennen van haar potentieel voor het bestuderen van de mechanismen van het invoeren evenals verlaten slaaptoestand, zijn we momenteel onderzoek naar mechanismen om deze cellen te slaaptoestand ontsnappen. Tijdens het invoeren van de slaaptoestand wordt slecht begrepen, een goed begrip van de mechanismen die de uitgang van de slapende toestand is nog ongrijpbaar. We hebben gemeld inleidende opmerkingen die ontstekingsreacties door gewonde stroma kan bijdragen aan het ontwaken van dormant MCF-7 cellen met behulp van dit model 37. Het model kan worden toegepast om T-47-cellen ook een andere ER + borstkanker cellijn. Terwijl ER- cellen niet slapende in reactie op FGF-2 worden, kan het mogelijk zijn om de werkwijze aan andere typen kankercellen met verschillende differentiatie middelen in toekomstige onderzoeken te passen.
Ondanks dat het een zeer bruikbare techniek voor het identificeren van belangrijke regulatorische mechanisme slaaptoestand, blijft het een in vitro model. Echter, cellen die latentie of in vitro manipulatie hebben ondergaan worden getest xenograft tumor vorming capaciteit. De belangrijkste potentiële voordeel van het systeem is echter de identificatie van mechanismen die de ontwikkeling van een hypothese die kunnen worden getest in zeer complexe in vivo modellen rusttoestand mogelijk maakt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ondersteund door het Ministerie van Defensie Grants DAMD17-01-C-0343 en DAMD17-03-1-0524, de New Jersey State Commissie over Cancer Research 02-1140-CCR-E0 en de Ruth Estrin Goldberg Memorial for Cancer Research (RW)
Acknowledgments
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCF-7 cells | ATCC | HTB-22 | |
| T47D cells | ATCC | HTB-123 | |
| BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Plate | Corning | 354411 | |
| BD BioCoat Fibronectin 60 mm Culture Dishes | Corning | 354403 | |
| BD BioCoat Fibronectin 100 mm Culture Dishes | Corning | 354451 | |
| BD BioCoat 22x22mm #1 Glass Coverslip with a uniform application of human fibronectin | Corning | 354088 | |
| 6 Well tissue culture plate | CellTreat | 229106 | |
| Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X Powder | Corning Life Sciences | 50-013-PB | |
| Heat Inactivated, Fetal Bovine Serum | Serum Source International | FB02-500HI | |
| 0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100X | Corning | 30-002-CI | |
| L-Glutamine, 100x, Liquid | Corning | 25-005-CI | |
| Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 234-FSE-025 | |
| Akt Inhibitor (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycerocarbonate) | CalBiochem | 124005 | |
| LY294002 | CalBiochem | 19-142 | Chenical PI3K inhibitor |
| C3 transferase | Cytoskeleton | CTO3 | Inhibits RhoA, RhoB, and RhoC, but not related GTPases such as Cdc42 or Rac1 |
| Y-27632 dihydrochloride | Santa Cruz Biotechnology | 129830-28-2 | |
| BODIPY FL-Phallacidin (green) | Molecular Probes | B607 | Fluorochrome for fibrillar actin staining |
| BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (red) | Molecular Probes | R415 | Fluorochrome for fibrillar actin staining |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Antibody, ReadyProbes Reagent | Molecular Probes | R37114 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Molecular Probes | P-36931 |
References
- Braun, S., et al. Cytokeratin-positive cells in the bone marrow and survival of patients with stage I, II, or III breast cancer. N Engl J Med. 342 (8), 525-533 (2000).
- Benoy, I. H., et al. Relative microvessel area of the primary tumour, and not lymph node status, predicts the presence of bone marrow micrometastases detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction in patients with clinically non-metastatic breast cancer. Breast Cancer Res. 7 (2), R210-R219 (1186).
- Wapnir, I. L., Barnard, N., Wartenberg, D., Greco, R. S. The inverse relationship between microvessel counts and tumor volume in breast cancer. Breast J. 7 (3), 184-188 (2001).
- Wyckoff, J. B., et al. A critical step in metastasis: in vivo analysis of intravasation at the primary tumor. Cancer Res. 60 (9), 2504-2511 (2000).
- Phadke, P. A., et al. Kinetics of metastatic breast cancer cell trafficking in bone. Clin Cancer Res. 12 (5), 1431-1440 (2006).
- Braun, S., et al. Lack of an effect of adjuvant chemotherapy on the elimination of single dormant tumor cells in bone marrow of high risk breast cancer patients. J Clin Onc. 18 (1), 80-86 (2000).
- Korah, R., Boots, M., Wieder, R. Integrin α5β1 promotes survival of growth-arrested breast cancer cells: an in vitro paradigm for breast cancer dormancy in bone marrow. Cancer Res. 64 (13), 4514-4522 (2004).
- Najmi, S., Korah, R., Chandra, R., Abdellatif, M., Wieder, R. Flavopiridol blocks integrin-mediated survival in dormant breast cancer cells. Clin Cancer Res. 11 (5), 2038-2046 (2005).
- Braun, S., et al. A pooled analysis of bone marrow micrometastasis in breast cancer. N England J Med. 353 (8), 793-802 (2005).
- Dent, R., et al. Triple-negative breast cancer: clinical features and patterns of recurrence. Clin Cancer Res. 13 (15 Part 1), 4429-4434 (2007).
- Kim, R. S., et al. Dormancy signatures and metastasis in estrogen receptor positive and negative breast cancer. PLoS One. 7 (4), e35569 (2012).
- Hanin, L. Seeing the invisible: how mathematical models uncover tumor dormancy, reconstruct the natural history of cancer, and assess the effects of treatment. Adv in Exp Med & Biol. 734, 261-282 (2013).
- Wilkie, K. P. A review of mathematical models of cancer-immune interactions in the context of tumor dormancy. Adv in Exp Med & Biol. 734, 201-234 (2013).
- Barkan, D., Green, J. E. An in vitro system to study tumor dormancy and the switch to metastatic growth. J Vis Exp. (54), e2914 (2011).
- Barrios, J., Wieder, R. Dual FGF-2 and intergrin α5β1 signaling mediate GRAF-induced RhoA inactivation in a model of breast cancer dormancy. Cancer Microenvironment. 2 (1), 33-47 (2009).
- Ganapathy, V., et al. Luminal breast cancer metastasis is dependent on estrogen signaling. Clin & Exp Metastasis. 29 (5), 493-509 (2012).
- Barkan, D., et al. Inhibition of metastatic outgrowth from single dormant tumor cells by targeting the cytoskeleton. Cancer Res. 68 (15), 6241-6250 (2008).
- Ghajar, C. M., et al. The perivascular niche regulates breast tumour dormancy. Nat Cell Biology. 15 (7), 807-817 (2013).
- Marshall, J. C., et al. Effect of inhibition of the lysophosphatidic acid receptor 1 on metastasis and metastatic dormancy in breast cancer. J Nat Cancer Inst. 104 (17), 1306-1319 (2012).
- Almog, N. Genes and regulatory pathways involved in persistence of dormant micro-tumors. Adv in Exp Med & Biol. 734, 3-17 (2013).
- Wang, H., et al. Basic FGF causes growth arrest in MCF-7 human breast cancer cells while inducing both mitogenic and inhibitory G1 events. Cancer Res. 57 (9), 1750-1757 (1997).
- Fenig, E., et al. Role of transforming growth factor beta in the growth inhibition of human breast cancer cells by basic fibroblast growth factor. Breast Cancer Res Treat. 70 (1), 27-37 (2001).
- Fenig, E., et al. Basic fibroblast growth factor confers growth inhibition and Mitogen-activated Protein Kinase activation in human breast cancer cells. Clinical Cancer Research. 3 (1), 135-142 (1997).
- Coleman-Krnacik, S., Rosen, J. M. Differential temporal and spatial gene expression of fibroblast growth factor family members during mouse mammary gland development. Molecular Endocrinology. 8 (2), 218-229 (1994).
- Plath, A., et al. Expression and localization of members of the fibroblast growth factor family in the bovine mammary gland. J Dairy Science. 81 (10), 2604-2613 (1998).
- Lavandero, S., Chappuzeau, A., Sapag-Hagar, M., Oka, T. In vivo and in vitro evidence of basic fibroblast growth factor action in mouse mammary gland development. FEBS letters. 439 (3), 351-356 (1998).
- Sinowatz, F., Schams, D., Plath, A., Kolle, S. Expression and localization of growth factors during mammary gland development. Adv in Exp Med & Biol. 480, 19-27 (2000).
- Korah, R., Sysounthone, V., Scheff, E., Wieder, R. Intracellular FGF-2 promotes differentiation in T47-D breast cancer cells. Biochem Biophys Res Comm. 277 (1), 255-260 (2000).
- Korah, R., Das, K., Lindy, M. E., Hameed, M., Wieder, R. Co-ordinate loss of FGF-2 and laminin 5 expression during neoplastic progression of mammary duct epithelium. Human Pathology. 38 (1), 154-160 (2007).
- Wieder, R., et al. Overexpression of basic fibroblast growth factor in MCF-7 human breast cancer cells: lack of correlation between inhibition of cell growth and MAP kinase activation. J. Cellular Physiology. 177, 411-425 (1998).
- Brunner, G., Gabrilove, J., Rifkin, D. B., Wilson, E. L. Phospholipase C release of basic fibroblast growth factor from human bone marrow cultures as a biologically active complex with a phosphatidylinositol-anchored heparan sulfate proteoglycan. J Cell Biol. 114 (6), 1275-1283 (1991).
- Wilson, E. L., Rifkin, D. B., Kelly, F., Hannocks, M. J., Gabrilove, J. L. Basic fibroblast growth factor stimulates myelopoiesis in long-term human bone marrow cultures. Blood. 77 (5), 954-960 (1991).
- Gupta, P., McCarthy, J. B., Verfaillie, C. M. Stromal fibroblast heparan sulfate is required for cytokine-mediated ex vivo maintenance of human long-term culture-initiating cells. Blood. 87 (8), 3229-3236 (1996).
- Chatterjee, M., van Golen, K. L. Farnesyl transferase inhibitor treatment of breast cancer cells leads to altered RhoA and RhoC GTPase activity and induces a dormant phenotype. Int J Cancer. 129 (1), 61-69 (2011).
- Korah, R., Sysounthone, V., Golowa, Y., Wieder, R. Basic fibroblast growth factor confers a more differentiated phenotype in MDA-MB-231 human breast cancer cells. Cancer Res. 60 (3), 733-740 (2000).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Tivari, S., Lu, H., Dasgupta, T., Wieder, R. Reactivation of dormant estrogen-dependent breast cancer micrometastases by bone marrow stromal injury in an in vitro model of dormancy. Proceedings of the 105th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research. , AACR. San Diego, CA. Philadelphia (PA). (2014).
