Protocol
분석하기 전에 날에 대해 수행 할 1 단계
- 신선한 선충 성장 매체에 L4 무대 웜을 선택 (NGM) 판 OP50 E.의 잔디 파종 20 주 / N에서 대장균, 문화를. 각각의 분석 조건 (10) 웜이 필요합니다; 웜의 O / N 손실을 허용하는 웜의 과잉을 선택합니다.
- 첫날 성인들만 분석 동물; 많은 돌연변이가 야생형보다 느린 속도로 성장한다. 테스트 한 모든 동물이 처음 일 성인 있도록 발달 지연이 균주에 대한 따기의 타이밍을 조정합니다.
2 단계 분석의 날에 수행하는
- 분석을위한 준비 :
- 표준 시드 화 60 X 15mm NGM 판에 분석을 수행합니다. 판 모두 뚜껑 오프로, 2 시간 동안 37 ℃에서 사용하는 건조. 각각의 실험 시험의 경우, 네 건조 NGM 판을 사용한다; 이들은 0 mM의 400 mM의 에탄올 분석 플레이트 및 동반 적응 판을 것입니다.
참고 :NGM 플레이트의 사용은 여기에 중요하다 판의 조성의 차이가, 특히 그들의 삼투압에 강하게 행동에 에탄올 용량 반응에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 동물 (20)에 의해 축적 된 에탄올의 양의 변화에 적어도 부분적으로 기인한다. NGM 한천 160 mOsm입니다. - 건조 후에, 시드 화 NGM 판 각각이 분석에서 사용 중량을 유의하여야 무게. 빈 접시의 중량을 기준으로 번호판 미디어의 볼륨을 결정한다. 볼륨 한천의 중량의 변환을 근사, 미디어가 같은 부피의 물과 동일한 무게가 있다고 가정한다.
주 : 당점 일관된 결과가 원래의 10 ml의 용적이 8.3-8.9 ml이다 건조 후의 부피가 충분히 탈수했다 NGM 매체와 함께 밝혀졌다. 2 시간 건조 시간에 대한 대안은 플레이트 044의 차이를 설명하기 위해이 범위의 부피에 도달 할 때까지 건조한다. - 4 구리 반지 (1 내경 용융.6cm) 판의 표면은 약 3 염에 다른 유전자형 또는 worms.Grasp 각각의 집게 링, 열 치료 그룹에 대한 가축 우리 (분젠 버너에서 강한 불꽃이 잘 작동)로 작동으로 초. 여전히 '건너 뛰기'에서 그것을 방지하기 위해 집게로 반지를 잡고 즉시 접시에 반지를 배치합니다.
- 링 반지의 여러 지점에서 집게로 가볍게 아래로 눌러 한천의 표면에 평평하게 달려 있는지 확인합니다. 반지를 배치 할 때, 추가로 3 반지를위한 공간을 확보하기 위해주의해야합니다.
- 네 개의 모든 카메라의 시야가 맞춰 지도록 함께 가깝게 가능한 올려 놓으주의하면서 판의 표면에 구리 세 개의 추가 고리를 녹아.
참고 : 한천과 좋은 도장을 만드는 것은 분석하는 동안 링에 벌레를 유지하는 것이 필수적입니다. 접시에 건너 뛸 반지는 한천과 올바른 도장을 할 가능성이 있으며벌레가 파고 할 수 있으며 벌레를 시각화 방해 한천을, 흉터 수 있습니다. - 각 분석 판 건조한 시드되고 더 에탄올을받을 수 없습니다해야 첨부 "적응"판을 준비합니다. 이 판에 네 개의 구리 반지를 놓습니다.
- 링 자체의 시야 쓰지주의하면서 옆 링에 사용되는 웜 균주 각각 링 플레이트 하단 레이블. 그 동반 순응 플레이트 분석 플레이트에 레이블을 맞 춥니 다.
- 최종 농도가 0 mm로부터 400 mM의 에탄올 (부피 중량)가되도록 각각의 분석 플레이트에 추가 100 % 에탄올의 양을 계산한다. 각각의 실험을 위해 (N = 1), 하나의 0 mM 내지 400 mM의 하나의 에탄올 플레이트있을 것; 순응 판은 에탄올을받지 않습니다. 판의 표면 주위를 피펫 팅, 에탄올을 추가합니다. 플레이트를 밀봉하기 위해 실험실 막을 사용하고 2 시간 동안 벤치 탑에서 평형을 허용한다.
- 1.5 시간이 경과하면, 상기 분석 단계 2.2 순응하는 단계를 시작한다.
- 표준 시드 화 60 X 15mm NGM 판에 분석을 수행합니다. 판 모두 뚜껑 오프로, 2 시간 동안 37 ℃에서 사용하는 건조. 각각의 실험 시험의 경우, 네 건조 NGM 판을 사용한다; 이들은 0 mM의 400 mM의 에탄올 분석 플레이트 및 동반 적응 판을 것입니다.
- 운동 분석을 수행 분석 판을
- 조심스럽게 순응 접시에 구리 반지의 중심에 각 실험군의 10 웜을 전송합니다. 웜 픽으로 조심스럽게 긁어서이 시점에서 한천에서 볼 수있는 모든 음식을 제거합니다. 동일한 시험 균주에서 동일한 순서로 플레이트 상에 배치되지 않도록 실험군은 실험에 걸쳐 시험 플레이트 상에 배치되는 순서를 다양하다.
주 : 목표 순응 접시에 식품 분석 플레이트에 전달되면 벌레 음식과 운동에 약물의 효과 가려한다 주위 응집되므로, 식품의 최소량으로 플레이트에 동물을 전송하는 것이다. - 이 벌레가 굴을 할 수 있도록하고, 분석을 방해하므로, 선택과 한천의 표면을 파괴하지 않도록주의하십시오. 실온에서 30 분 동안 인큐베이션 웜.
- 각 판의 입문 사이에 적절한 간격이 있는지 확인하십시오. 숙련 된 실험자 (40) 동물, 4 반지 <1.5 분 동안 10 / 반지를 이동할 수 있지만, 2 분까지의 간격은 허용됩니다. 표준 분석은 10 ~ 12 분 0 mM의 400 mM의 에탄올 모두 노출의 30 ~ 32 분에서 기록 영화가 있습니다.
- 0 mM의 노출에 대한 순응 판과 약 2 분 30 초 떨어져 두 번째 영화가 시작해야합니다 전에 첫 번째 동영상 파일의 저장이 가능하도록 400 mM의 노출에 대한 적응 판을 시작합니다.
- 30 분의 적응 기간 후, 분석 플레이트에 순응 판에서 벌레를 전송합니다. 그들은 각 플레이트의 사이 완료 타이밍을 추적, 순응 플레이트에 첨가하는 것과 동일한 순서로 분석 플레이트에 웜 (0 MM 또는 400 mM의 에탄올)를 전송합니다. 에탄올을 증발 손실을 최소화하기 위해 실험실 필름 : 봉쇄 판.
- 유평평해진 선택의 상단에 벌레를 수집하는 얇은 가장자리가 평평 웜 골라 함께 떠 운동을 SE는. 이 선택에 벌레를 붙 도움으로 일반적으로 웜을 전송에 사용되는 박테리아를 사용하지 않고 분석 플레이트에 시드 화 순응 플레이트 웜의 전송을 수행합니다.
주 : 접시에 제 웜이 플레이트에 첨가 마지막 웜 이상 에탄올에 노출되기 때문에, 동물이 단계에서 전달되는 속도가 매우 중요하고, 이전 시점이 약간의 시간 의존적 효과를 보여줄 수있다. 이 균주는 실험 반복 실험을 통해 처음으로 접시에 배치되는 회전의 주요 이유입니다.
- 조심스럽게 순응 접시에 구리 반지의 중심에 각 실험군의 10 웜을 전송합니다. 웜 픽으로 조심스럽게 긁어서이 시점에서 한천에서 볼 수있는 모든 음식을 제거합니다. 동일한 시험 균주에서 동일한 순서로 플레이트 상에 배치되지 않도록 실험군은 실험에 걸쳐 시험 플레이트 상에 배치되는 순서를 다양하다.
- 로코 분석을 수행 얇은 껍질을
- 등으로 2048x2048 7.4와 0.5 배 현미경 목적, 0.8 배의 배율 카메라로 시야 (약 42x42 mm 2 광장)에서 네 개의 링을 동시에 이미징 할 수있는 현미경 / 카메라 조합을 사용하여81; m 화소 CCD.
- 강도 임계치 단계에서 물체 인식 에이즈 시야에 걸쳐 심지어 조명을 사용하여 (아래 참조). 3 "X3"백라이트가 잘 작동합니다.
- 이미지 광원 전송되는 기존의 현미경에 비해 백라이트를 사용하는 경우 손실 대비를 생성하는 판에 배치 미디어 측 최대의 벌레 (덮개 아래).
- 이동 벌레의 시간 경과 영화를 캡처 이미지 분석 소프트웨어를 준비합니다. 2 분 (120 프레임)의 동영상으로, 12 비트 그레이 스케일 이미지 1 초를 캡처 할 수있는 소프트웨어를 설정합니다. 여전히 충분한 이미지 해상도를 유지하면서, 출력 파일의 크기를 줄이기 위해, 1024 × 1024 화소의 이미지를 캡처하는 2 × 2 비닝 모드를 사용한다.
- 동영상을 기록합니다. 마지막 웜 후 10 분은 그 판에 배치 된 제 1 플레이트 (0 mM의 에탄올)의 120 프레임 동영상 촬영을 시작합니다. 동영상 파일을 저장합니다.
- 제 2 플레이트 (400 mM의 에탄올)을 기록한다. 이 과정을 반복마지막 웜 후 30 분부터 두 플레이트는 각각 노광용 30-32 분 시점을 캡처하는 제 1 플레이트 (0 mM의 에탄올)에 배치했다.
참고 : 분석 할 다음 판으로 녹음을 시작하기 전에 각 캡처 세션 후 이미지 파일을 저장하기에 충분한 시간을 준다. - 보관 된 영화의 미래 교정 및 8 비트 256 그레이 스케일 TIFF 파일에 각 영화의 사본을 변환,이 영화가 개방 및 ImageJ에 (28)와 같은 다른 공개 오픈 소스 이미징 소프트웨어 프로그램에 의해 분석 될 수 있도록.
주 : 여기에서 설명 된 이미지 분석 소프트웨어 독자적인 파일 포맷을 사용한다.
- ImagePro 소프트웨어를 사용하여 영화의 분석.
- 촬영 후에는 이미지-Pro 소프트웨어 또는 그와 동등한 Plus를 사용하여 영화를 분석 할 수 있습니다.
주의 : 다른 물체 추적 소프트웨어의 다양한 여러 성공적 C.을 추적하는 데 사용 된 것을 사용할 한 번에 29 등의 엘레소프트웨어는 합리적 오브젝트의 식별 단계가 유사한 원리에 기초하여 여기서 설명 된 바와 해당 대체 할 수있다. 설명하는 방법은 약간의 차이가있을 수 있습니다 이미지 - 프로 플러스 소프트웨어 버전 6.0-6.3 및 7.0, 이미지 - 프로 플러스 소프트웨어의 새 버전에 관한 것이다. - 2 분 (120 프레임) 세그먼트에서 영화를 분석 할 수 있습니다. 먼저, 배경 평탄화 및 웜 물체의 콘트라스트를 향상시키기 위해 화상에 필터를 적용한다. 다음과 같이 필터를 선택 : 메뉴> 프로세스> 필터> 향상>는 평평 : 매개 변수 : 배경 = 다크; 폭 = 20 픽스 기능이 있습니다.
- 필터링 단계 후 영화를 다시 저장하지만 항상 필터링되지 않은 형태로 원본 동영상을 유지합니다.
- 배치 및 구리 반지와 중복 할 수있는 크기이자 (ROI)의 원형 영역과 별도로 각 링에 동물의 운동을 분석한다. 확인하고 메뉴> 측정과 벌레를 추적> 트랙 ... 명령 개체; 이 추적 D를 불러옵니다ATA는 표 창. 추적 옵션 버튼은 특정 트랙을 제외하고 모든 실험 유물을 제한 할 수 있습니다.
- 자동 추적 탭에서 다음 매개 변수를 사용 : 트랙 매개 변수 : 속도 제한 (검색 반경) = 400 μm의 / 프레임, 가속 한계 = 자동, 최소 총 트랙 길이 = 400 μm의, 우위 모션 유형 = 혼란; 트랙 매개 변수의 객체는 : 부분 트랙 = 예, 최소 길이 = 21 프레임, 추적 예측 깊이 = 1 프레임을 허용합니다.
- 추적 프로세스를 시작하려면, 자동으로 모든 트랙을 찾아 개수 / 크기 옵션 대화 상자와 추적 대화 상자를 표시하는 버튼을 기능을 클릭합니다. 분석 용 웜 오브젝트를 강조하고 밝은 배경 픽셀을 무시하도록 웜 화소의 계조 강도를 사용하는 중요한 임계 공정을 제공 개수 / 크기 대화 상자의 강도 범위 선택을위한 수동 옵션을 선택한다.
- 강도 임계 값을 조정 SLI폰더 모든 어두운 오브젝트를 강조 포괄적 범위를 만들기 위해 (하나의 하한을 설정하기 위해, 하나의 상한을 설정하기 위해). 0-4,095의 규모에 0-1,500의 범위는 미세한 튜닝을위한 좋은 출발점이 될 것입니다.
- 이러한 구리 링과 접시에 이물질 같은 단일 웜 개체보다 크고 작은 개체를 제외 할 크기의 필터를 적용합니다. 측정과 자세의 다양한 개별 웜에 대한 크기를 덮이 작업을 수행하는 두 개의 크기 매개 변수를 설정> 카운트 / 크기 옵션 대화 상자에서 선택 측정 메뉴 항목을 선택합니다. (지역 범위 : 28,000-120,000 μm의 2 및 경계 범위 : 600-2,500 μm의).
- 변이주가 분석 될 접시에 상당히 작거나 다른 동물보다 크면 설정을 변경할 필요가 없도록, 제 동물을 추적하기 전에 균주의 다른 크기를 수용하기 위해 객체 인식 용 필터 설정의 범위를 확장 중간 분석.
- 추적 대화 상자에서 계속을 클릭하여 추적 프로세스를 완료합니다. 시각적으로 자동 필터 설정에 따라이를 제외 할 타당한 이유가없는 한 모든 웜이 표시되어 있는지 확인하기 위해 영화의 각 웜의 진행과 출력 트랙을 비교합니다. 수동 필터 크기 기준을 만족 확인 비 웜 물체의 존재에 의해 생성 된 트랙을 삭제.
- 각 프레임 사이의 각각의 웜의 속도를 계산하는 소프트웨어를 사용하여 (거리는 프레임 간의 1 초당 물체의 무게 중심에 대해 이동) 및 웜의 인구 모든 트랙에 걸쳐 각 트랙에 대한 평균 속도와 평균 속도를 표시 구리 반지. 마지막 평균이 실험 시험의 관점에서 N = 1로 고려한다. 통계 분석 및 데이터 보관을위한 스프레드 시트 프로그램에 데이터를 보냅니다.
- 데이터가 플레이트에 제 1 링에 대해 기록 된 후, 그 다음에 링 ROI를 놓고매개 변수를 변경하지 않고도, 추적 처리를 반복한다.
- 운동을 통해의 상대 속도를 계산 :
- 상대 속도 (%) = 처리 치료 (400 mM의) 속도 / (0 mM의) 속도 × 100.
참고 : 다른 유전 적 조작은 종종 동물의 기저 운동 속도를 변경. 동물의 운동 속도에 대한 에탄올의 효과를 결정하는 다른 유전자형 또는 증상에 걸쳐 이러한 효과를 비교할 수 있도록하기 위해, 상대 속도를 계산한다.
- 촬영 후에는 이미지-Pro 소프트웨어 또는 그와 동등한 Plus를 사용하여 영화를 분석 할 수 있습니다.
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Representative Results
여러 가지 유전자형과 짝을 컨트롤에서 대표 데이터 (그림 1)는 8,24을 제시; 데이터는 구체적으로 분석 동물에서 그 하이라이트 차이를 선정 하였다. 노출 10 분으로 영향 정도는도 1B-G의 좌측 축 상에 도시되어 균주의 초기 감도 여겨진다. 10 분으로 제어보다 큰 상대 속도와 변이주가, 에탄올 (도 1F, G) 내성 인 것으로 간주되는 반면 (도 1D 에탄올 과민 것으로 간주 제어보다 작은 상대 속도 변이주, E). 도 1의 오른쪽 축 10 및 30 분 사이의 시간주기의 회수 속도의 정도를 나타낸다. 이것은 급성 내성 기능의 개발 (AFT)의 속도의 측정치를 나타내고, 상대 SPE로부터 감산 10 분으로 상대 속도로서 계산된다30 분에 에디션. 큰 복구 값 균주 (도 1C 대조 동물은 AFT 개발의 낮은 속도를 갖는 것으로 간주되는보다 낮은 복구 값 대조 동물 (도 1D, F) 및 균주와 비교 AFT 개발의 더 빠른 속도를 갖는 것으로 간주된다 , E). sbp1에 대한 측정 AFT는 (ep79) (그림 1G)이 (N2 복구에 대한 비교를 위해 P = 0.08)으로 인해 큰 변화에 부정적인 회복으로 추세하지만 야생 형에서 통계적으로 차이가 없었다되어 있습니다. 욕조-1 둔한 소리가 나는 상동를 인코딩 ; BBS-1은 인간 BBS1에 상 동체를 코딩; 입술 -7-는 트리 아실 글리세롤 리파제를 인코딩; 지방 1 오메가 -3 지방산 아실 불포화 화 효소를 코딩, 지방 3 델타 -6 지방산 불포화 화 효소를 코딩, SBP-1에 상 동체를 코딩 단백질 (SREBPs)를 바인딩 인간 스테롤 조절 요소.
의 몇 가지 중요한 특성이있다데이터 유의할 : 첫째, N2 (야생형)의 제어 데이터는 실험에 걸쳐 상이; 이는 실험실에서 이러한 절대 수분량 또는 건조 매체의 염 농도 및 온도의 제어가 곤란하다 환경 요인으로 될 가능성이있다. 통상적으로, 400 mM의 외인성 에탄올 미처리 컨트롤의 약 30 % N2의 속도 누른다; 그러나 우울증의 절대 정도는 실험 실험에 따라 다릅니다. N2에서 30 분에 걸쳐 식 이동 속도의 약 12 %를 회복은 보통 예상되는 동안 또한, 여기에 다시 번호가 변화한다. 중요한 것은, 감도와 AFT 전시 일상 변화의 절대 수준은 유전자형이나 조건 사이의 비교는 일반적으로 다르지 않다있다. 즉, 야생형과 돌연변이가 서로에 대해 유사한 효과를 항상있을 것이다; 돌연변이는 야생형 AFT 상대적으로 저하되어있는 경우, 그 감소에 의해 입증 야생형 AFT의 양에 따라 확장한다. 이 하이라이트행하는 중요성이 비교되는 균주 또는 조건 동시에 동일한 플레이트 제어 페어링.
둘째, 초기 감도와 AFT의 표현형 유전자 분리합니다. 그 초기 감도와 함께 또는 개별적으로 다를 수 있습니다 급성 기능 허용을 참고; 예는 초기 감도와 AFT는 독립적으로 차이가있는 표현형의 다양한 포함되어 있습니다. 표현형 중 하나로 변경이 다른 표현형의 변화를 예측하지 않으며,이 제 표현형의 변화의 방향을 예측 않는다 (증가 또는 에탄올에 대한 응답을 저하 중).
그림 1. 초기 에탄올 감도 및 급성 기능적 공차 (AFT)의 성장 속도는 세퍼 행동 반응이다. 대 (A) 요약표에탄올 및 AFT의 성장 속도로 초기 감도 수준이라는 유전자 돌연변이의 효과의 방향은 모두 (각 경우에 N2) 야생형 컨트롤과 비교된다. (B-G) 급성 운동 응답 400 mm로 외생 에탄올은 10 ~ 12 분 연속 에탄올 노출의 30 ~ 32 분으로 측정하고 있습니다. 상대 속도 (치료 속도 %)이 왼쪽 축에 표시됩니다. 속도의 회복 정도는 오른쪽 축에 도시되고 그 20 분 간격 동안 AFT 속도의 측정치를 나타내는된다. 다음과 같은 비교 실험의 수이다 : B, C, E : N = 6; G : N = 7; D : N = 9; F : N = 11 통계적으로 유의 한 비교 (쌍 t-테스트)가 표시됩니다 : *, P <0.05; **, P <0.01. 8,24에서 수정이 그림에서 제시 8,24 데이터를. P임대이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
C.에서 사용할 수있는 간단한 신경 생물학 및 유전 적 도구 엘레 웜 행동에 에탄올의 효과의 분자 기초를 공부하는 우수한 모델합니다. 여기서는 8,10,20,24,25을 에탄올 급성 행동 반응의 여러 환경 매개체 분자를 식별하는 데 사용 된 분석법을 설명한다. 이 방법은 함께 포유 동물에서 응답의 수준의 복합 표현형 모델, 분화 및 두 개의 서로 다른 에탄올 응답 행동 표현형, 초기 감도와 급성 기능 관용의 개발을 동시에 검사 할 수 있습니다. 동일한 분석을 용이하게함으로써, 다른 약물의 행동 효과의 평가에서 여러 균주를 동시에 시험을 이용하는 다른 약리학 적 제제를 연구하기 위해 적응 될 수있다.
10-12 분의 시간 창에 변형 등의 초기 감도를 측정하는 데 유용한 시각을 제공한다한올. 노출의 처음 10 분에 걸쳐 400 mM의 에탄올 효과의 분석은 노출되지만 실제로 초 분의 정상 상태 속도부터 효과 에탄올 노광 (20)의 일곱 번째 분까지 도달하지 나타낸다. 인해 식 이동 속도에서이 시간 의존적 효과에 특정 균주 플레이트 상에 배치되는 순서가 여덟째 또는 아홉 분 전에 어떤 속도 측정에 중요하다 (가정 이는 웜 모두 배치 미만 2 분 소요 에탄올 접시에). 이러한 이전 시점에서 일부 웜은이 판 이전에 배치했다 간단하기 때문에 에탄올에 의해 더 영향을받을 것입니다. 에탄올 안정된 초기 효과 일곱째 분에 의해 달성된다하더라도, 그것은 인해 에탄올이 시간 의존적 효과 균주 플레이트 상에 배치되는 순서 균주 걸쳐 체계적인 효과를 최소화하기 위해 복제 실험에 걸쳐 변화 될 것을 권장하고 작은지면에 웜을 이동하는 데 소요되는 시간전자.
특정 매개 변수를 반복적으로 구리 링 또는 다른 벌레와 충돌 웜 바이어스를 최소화하는 물체 추적 단계에서 선택되었다. 객체 크기 필터 단계는 두 개의 접촉 웜을 포함한 하나의 웜보다 큰 추적에서 어떤 개체를 제거해야합니다. 웜은 다른 웜이나 구리 링에 닿으면 다음 트랙이 종료하고 접촉을 유지하면서 더 이상 유효한 개체로 인식 될 수 없습니다. 웜이 다른 물체와의 접촉을 상실 할 때, 새로운 객체가되어 새로운 트랙을 시작합니다. 웜에 의해 트랙의 길이가 20 초 미만의 경우는, 자동 21 프레임들의 최소 트랙 길이를 정의에 의해 제외된다. 이 필터는 웜의 인스턴스가, 다시 그 물체를 만지하기 위해 앞으로 다음, 다른 객체 (웜이나 링)으로 전진 후진 및 방지 빠른 역전의 짧은 관찰 바이어스 동물의 인구의 전체 평균 속도를 할 수있다. 이러한 설정을 사용하여, 나는t이 가능하고 전체 평균 길이보다 큰 20 초 (미만 99 초) 더 이상의 트랙에 기여하는 하나의 웜 드문 일이 아니다. 각각의 웜은 단지 (120 초의 총 중) 최소 트랙 길이의 61 초를함으로써 하나의 트랙에 기여하도록 설정이 변경 될 수 있지만, 경험적 관찰이 트랙의 상당한 수를 제거하고 느리게 한 것으로 판단 다른 벌레와 충돌 벌레는 자주를 통해 표현 된 것입니다. 다르게는, 새로운 트랙은 초기 2 분 기간이 분석에서 제거되고 유용한 데이터가 손실 될 충돌 웜 동영상의 최초 프레임 이후에 시작하지만, 허용 할 수있다. 마지막으로, 구리 반지 당 10 웜의 사용은 평균 너무 많은 웜 충돌의 문제에 기여하는 여러 대표 트랙을 갖는 사이 좋은 타협을 나타냅니다.
이 행동 분석은 중요한 몇 가지가 있습니다웜 에탄올 응답 행동의 연구에 장점. 같은 접시에 여러 유전자형의 동시 테스트 ". 가축 우리"구리의 사용을 통해 가능하다 이러한 혁신은 몇 가지 뚜렷한 장점이 있습니다. 먼저, 본 분석에서, 상기 제어 조건은 항상 또는 균주 또는 균주 실험 조건, 직접 비교를 동시에 테스트 만 동물로 동시에 동일한 플레이트에서 테스트된다. 행동 분석은 종종 환경에 의해 영향을 받고, 그리고 행동 반응의 일일 변동이 분석에서의 노이즈가 증가하고 신호를 검출하는 능력을 감소시킬 수 있기 때문에 특히 중요하다. 동일한 조건에서 실험군의 비교표 실질적으로이 방법의 주요한 이점이며 일상적인 환경 변화의 영향을 감소시킨다. 둘째, 구리 가축 우리의 사용은 식 이동 분석법이 수행 될 수 있도록 시야에 동물을 포함음식의 bsence. 음식을 박탈하는 경우, 웜 빠르게 이동하고 박테리아의 검색에 분산하는 경향이있다; 링없이, 웜이 검정 과정 동안 시야를 떠날 것이다. 또한, 웜은 시각화 쉽 만들기, 구리에 의해 격퇴과 고리의 중간에 가깝게 유지하는 경향이있다. 웜이 분석 조건에서 빠르게 이동하는 것이 사실 실질적 에탄올 우울증 효과를 검출하는 해상도를 증가시킨다; 웜 천천히 움직일 때, 속도는 이전이를 감지하는 능력의 바닥에 도달한다. 구리 벌레에 독성이 있습니다; 반지는,이 프로토콜에 분석 (몇 시간 이상) 링에서 동물의 배양을 확장 에탄올 급성 반응에 영향을 나타나지 않는 상태에서 사용하지 않는 것이 좋습니다. 셋째,이 실험적인 디자인으로, 하나의 분석에는 최대 4 개의 서로 다른 실험 그룹의 행동 반응을 평가할 수 있습니다. 따라서, 시간은 통계적으로 의미있는 데이터가 축적 감소 찍은. additi에서단일 디지털 동영상이 이루어지기 때문에,에,이 주 데이터의 장기 보존에 메모리 공간 요구 사항을 감소시킨다. 마지막으로, 각 실험에서, 각 실험군의 10 개별 동물의 동작이 검사된다. 그 (10) 개인의 속도는 하나의 분석을위한 복합 속도를 생성하기 위해 평균, 그래서 N = 1 재판된다. 많은 동물의 행동이 평균화 더욱 민감한 이들 행동 분석에서 변동을 감소 시키며, 상기 에탄올 응답 행동에 미묘한 영향을 감지 해상도를 증가시킨다.
어떤 돌연변이 동물의 행동 분석에 적용 중 일부는 여기에 설명 된 방법에 제한이 있습니다. 이 방법의 하나의 중요한 한계는 측정 된 속도 번째 값으로 감소하기 때문에 매우 크게 기인 협응 장애 또는 마비 근처 기저 속도를 감소 돌연변이 벌레, 에탄올의 효과에 대한 내성 위양성으로 식별 될 수 있다는AT는 특정 설정을위한 촬상 정확한 검출의 임계 값 이하이다. 가장 물체 추적 소프트웨어 프로그램이 거리는 프레임 간의 이동 측정하는 위치로서 무게 중심 (질량 중심)을 사용함에 따라, 그 머리를 움직 고정 웜 여전히 무게 중심의 위치 변화를 생성 할 수 있고 그 변화를 검출 할 것이다 운동으로. 따라서 웜은 참으로 운동을 측정하기 위해 신체 자세의 미묘한 변화에 의한 것보다 더 빠르게 이동 될 필요가있다. 에탄올에 노출 된 웜은 마비되지 않고는 에탄올 노출이 기술적 바닥 효과 이하 속도의 요금을 감소 할 가능성이 이미 운동의 적자가 벌레와 그래서 그들은 매우 조정되지 않은 있습니다. 프레임 간의 시간은 O가 더 어려워지고 더 장 1보다 길게되면 프레임 간의 시간을 늘리면 몸체 위치에 큰 변화는이 문제를 해결하지 못한다 중심 위치에 미묘한 변화로부터 분리가되도록bject 소프트웨어를 추적하는 것은 같은 웜 트랙보다는 가깝지만 닿지 않도록 웜 사이의 트랙 점프에 기여하고 있음을 확인합니다.
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Acknowledgments
R01AA016837 (JCB)와 P20AA017828 (AGD와 JCB) :이 연구는 국립 보건원, 국립 알코올 중독과 알코올 남용 연구소에서 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. elegans strains | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| 60 x 15 mm Petri plates, triple vented | Greiner Bio-One | 628161 | Other plate brands will suffice. |
| NGM agar | Various | NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), peptone (2.5 g/L), 1 ml cholesterol (5 mg/ml in ethanol), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O | |
| Forceps | Various | e.g., Fisher Scientific #10300 | |
| 37 °C Incubator | Various | For drying agar | |
| Digital balance | Various | For determining plate weights and agar volume | |
| Copper rings | Plumbmaster | STK#35583 (48 cap thread gasket) | 1.6 cm inner diameter, 1.8 cm outer diameter copper rings |
| 100% ethanol | Various | ||
| Parafilm M | Bemis | PM996 | |
| CCD camera | QImaging | RET-4000R-F-M-12 | This camera has a large field of view. |
| Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective | Leica | MZ6 | Discontinued model, M60 is current equivalent. |
| Light source | Schott | A08923 | 3”x3” backlight for even illumination across the field of view |
| Imaging and tracking software | Media Cybernetics | ImagePro-Plus v6.0-6.3 | Newer versions of the software have tracking functions. |
References
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