Summary
Het doel van dit protocol is de detectie van de merker DNA oxidatie, 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo) HPLC-ED, in DNA van gekweekte cellen of dierlijke weefsels.
Abstract
Oxidatieve stress is geassocieerd met vele fysiologische en pathologische processen, alsmede xenobiotische metabolisme, wat leidt tot de oxidatie van biomacromoleculen, zoals DNA. Daarom efficiënte detectie van DNA oxidatie is belangrijk voor verschillende onderzoeksdisciplines, inclusief medicijnen en toxicologie. Een gemeenschappelijke biomarker oxidatief beschadigde DNA 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo; vaak verkeerd aangeduid als 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine (8-OH-dGuo of 8 oxo-dG)). Verschillende protocollen voor 8-oxo-dGuo meting door hogedruk vloeistofchromatografie met elektrochemische detectie (HPLC-ED) zijn beschreven. Deze werden echter voornamelijk toegepast op gezuiverde DNA behandeld met pro-oxidanten. Bovendien vanwege methodologische verschillen tussen laboratoria, voornamelijk vanwege het verschil in de analytische apparatuur, de toepassing van gepubliceerde werkwijzen voor detectie van 8-oxo-dGuo HPLC-ED vereist een zorgvuldige optimalisatie door elk laboratorium. EENuitgebreide protocol, beschrijft een dergelijk optimalisatieproces, ontbreekt. Hier, wordt een gedetailleerd protocol beschreven voor de detectie van 8-oxo-dGuo door HPLC-ED, in DNA van gekweekte cellen of dierlijke weefsels. Het illustreert hoe DNA monstervoorbereiding gemakkelijk en snel kan worden geoptimaliseerd om ongewenste DNA oxidatie die kunnen optreden tijdens monsterbereiding te minimaliseren. Dit protocol toont hoe 8-oxo-dGuo detecteren in gekweekte humane alveolaire adenocarcinoma cellen (bijv A549 cellen) behandeld met het oxidatiemiddel KBrO 3, en de milt van muizen die zijn blootgesteld aan de polycyclische aromatische koolwaterstoffen dibenzo (def, p) chryseen (DBC, voorheen bekend als dibenzo (a, l) pyreen, DalP). Kortom, dit werk illustreert hoe een HPLC-methode ED gemakkelijk kan worden geoptimaliseerd voor de detectie van 8-oxo-dGuo in biologische monsters.
Introduction
Reactive oxygen species (ROS), waarvan de steady-state niveaus kunnen verhogen gedurende vele pathologische condities en xenotoxic metabolisme, bijdragen aan een verhoogde frequentie van oxidatieve DNA-schade. Onder verschillende mogelijke nucleobasen oxidatieproducten, oxidatieve DNA schade gemakkelijk worden gemeten met de stabiele merker 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo), die een van de geoxideerde vormen van 2 ' -deoxyguanosine (dGuo) 1. 8-oxo-dGuo is het meest voorkomende DNA-laesie 2 en daarom is bestudeerd om meer detail als een DNA oxidatie biomarker ondanks het bestaan van meerdere DNA oxidatieproducten 3. Bij de mens, kan deze schade via base excisie reparatie worden gerepareerd door 8-oxoguanine glycosylase 1 (hOGG1) 4. Indien verlaten unrepaired, kan 8-oxo-dGuo bijdragen tot de vorming van basenparen-substitutie mutaties (bijv G tot transversies T) 4. Belangrijk, 8-oxo-dGuo is een gevestigde marker for DNA schade in verband met de initiatie en promotie van kanker 2. Daarom kwantificatie van 8-oxo-dGuo is een nuttig en wenselijk biomarker van oxidatieve DNA schade 5.
Algemeen wordt verwarring in de literatuur met betrekking tot de juiste namen voor oxidatief beschadigde vormen van 2-deoxyguanosine en bovendien de correcte naam van de verbinding (en) routinematig gemeten als een biomarker van oxidatieve DNA schade 6. De 6,8-diketo en 6-enol, 8-keto tautomere vormen van 8-oxo-dGuo (figuur 1) zijn de twee belangrijkste tautomeren besproken in de literatuur 5,7. De 6,8-diketo vorm is de belangrijkste vorm bij fysiologische pH van 7,4 en het meest prominente DNA-oxidatieproduct 7. Derhalve 8-oxo-dGuo plaats van 8-hydroxy-dGuo het meest geschikte naam voor dit oxidatieproduct 6. Het is ook belangrijk dat 2-deoxyguanosine (dGuo) op, in plaats nucleobase guanine (Gua) of ribonucleoside guanosine (Guo) respectievelijk gedetecteerd door de meeste methoden 6.
Nauwkeurige detectie en kwantificering van 8-oxo-dGuo is uitdaging omdat: i) variabiliteit in de digestie van het DNA-monster, ii) oxidatie van onvoorziene dGuo tot 8-oxo-dGuo die kunnen optreden tijdens de voorbehandeling, en iii) de behoefte voor een effectieve validatie van de analytische HPLC-ED-methode 8. In dit protocol, we gericht op i) het verschaffen van omstandigheden, die gunstig zijn voor volledige DNA digestie en ii) Door de opneming metaalchelator en chelator behandelde oplossingen en een speciale-DNA isoleren reagens, terwijl iii) slechts gedeeltelijk door het opnemen van geadresseerde positieve controles en waardoor de werkwijze kunnen worden gedetecteerd 8-oxo-dGuo in biologische monsters. Verdere validatie is buiten het bestek van dit artikel. Maar we zijn ervan overtuigd dat dit protocol zal helpen de aspirant-gebruikers bepalen de mate waarin zij nodig hebben om formeel te valideren van het protocol, afhankelijk van hun doelen. Een lijst met te doen voor de formele validatie van de werkwijze wordt verder verschaft. Tijdens de ontwikkeling en implementatie van een methode voor het 8-oxo-dGuo detectie, werden gepubliceerd methoden beoordeeld en geconsolideerd. Dus, deze methode elimineert de noodzaak om informatie te verzamelen uit verschillende gepubliceerde bronnen die vaak ontbreken belangrijke experimentele details, terwijl ook het verstrekken van een snelle en ongecompliceerde manier van testen als de methode voor de detectie en kwantificering van 8-oxo-dGuo met succes is aangenomen. Deze aangepaste methode werd gebruikt om DNA-monsters met succes analyseren van gekweekte cellen en muizen weefsel. Deze video levert andere groepen bij de vaststelling van een effectieve methode voor betrouwbare detectie en kwantificering van 8-oxo-dGuo HPLC-ED.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zorg ervoor dat alle veeteelt, huisvesting, de behandeling en experimenten zich aan lokale wet- en regelgeving en dat de experimenten protocollen worden vóór het begin van elke studie goedgekeurd. Voor de beschreven experimenten werden dierlijke zorg, behandeling, en de behandeling goedgekeurd door de Health Canada Animal Care Committee. Zie de "reagentia tafel" voor informatie van de leveranciers.
1. Het verzamelen van biologische monsters
- Cellen of dierlijke weefsels
- Kweek humane alveolaire adenocarcinoom A549-cellen in F12-K medium dat 10% foetaal runderserum, 100 eenheden / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine.
- Zaad cellen op ongeveer 1 miljoen cellen per 10 cm plaat. Voor elk experiment gebruikt een set van 12 platen in totaal (drie plaatjes per één biologische herhaling x vier doses) voldoende DNA (80 ug) voor enzymatische digestie en HPLC-analyse.
- Wanneer celdichtheid groter wordt dan ca.nor- maal gesproken minstens 70% van de oppervlakplaat, verwijdert media en was de cellen tweemaal met 4 ml met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,4.
- Voor gekweekte diercellen, gebruikt KBrO 3 als positieve controle.
Opmerking: Een positief lineair verband tussen concentratie en KBrO 3 8-oxo-dGuo frequentie zijn gerapporteerd in de literatuur 9. - Los KBrO 3 in PBS. Zorg ervoor dat de eindconcentratie in het celcultuur medium meer dan 1 mM tot een statistisch significante toename van 8-oxo-dGuo opzichte van niet-blootgestelde cellen te verkrijgen. Voeg dezelfde concentratie KBrO 3 aan elke plaat in de reeks (bijvoorbeeld 12 10-cm platen).
- Incubeer de platen gedurende 3 uur bij 37 ° C. Verwijder het medium en eenmaal wassen met PBS.
- Voeg 1 ml trypsine-oplossing (stock concentratie 2,5 g / ml) en incubeer gedurende 3 min bij 37 ° C.
- Wassen met 4 ml PBS, verzamel de cellen van elke set in een 50 ml conische polystyrene centrifugebuis en centrifugeer bij 1000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Verwijder PBS en bewaar de celpellet bij -80 ° C tot verdere analyse. Kunstmatige DNA oxidatie kan verder worden geminimaliseerd door nucleaire isolatie, zoals elders 10 beschreven.
- Dierlijke weefsels
- Dosis dieren vereist. Voor dit protocol, volwassen (9 weken oud) te behandelen mannelijke Muta Muis door orale sondevoeding dagelijks gedurende drie opeenvolgende dagen met 20 mg DBC / kg lichaamsgewicht per dag opgelost in olijfolie.
LET OP: Deze transgeen dier havens gemanipuleerde λ-bacteriofaag en mutatie reporter gen lacZ van E. coli 11 wordt gebruikt voor transgene knaagdieren mutatieassays 12. - Voer dier necropsie bijvoorbeeld verdoofde muizen kan gebruikt isofluraan en vervolgens gedood via cervicale dislocatie vervolgens borstholte opening. Onmiddellijk flash bevriezen weefsel in vloeibare stikstof. WINKEL weefsels bij -80 ° C tot analyse.
OPMERKING: De timing van euthanasie na de behandeling kan een belangrijke variabele is (bijvoorbeeld DNA oxidatie was maximaal bij 72 uur na blootstelling aan lawaai in de rat hersenen en de lever 13).
- Dosis dieren vereist. Voor dit protocol, volwassen (9 weken oud) te behandelen mannelijke Muta Muis door orale sondevoeding dagelijks gedurende drie opeenvolgende dagen met 20 mg DBC / kg lichaamsgewicht per dag opgelost in olijfolie.
2. DNA-extractie, neerslag en Wash (Voor weefsels Ga direct naar 2,2)
- Homogeniseer de verzamelde cellen in een 50 ml conische centrifugebuis polystyreen met 1 ml DNA isoleren middel zoals DNAzol. Gebruik een 1000 ul pipetpunt om de celpellet te dispergeren tot de oplossing homogeen is. Overdracht homogenaat een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis. Incubeer op ijs gedurende 10-20 min. Ga naar 2.3.
- Homogeniseer 15-20 mg weefsel in een 1 ml handheld nonstick glashomogenisator met 500 ul DNA isoleren middel. Voorzichtig omhoog en omlaag homogenisator voor ongeveer 1 min; zachtere weefsels zal minder tijd vergen. Zachte behandeling zorgt voor minder scheren van DNA. Bewaar de homogenaat op ijs voor ongeveer 10-20 min.
- Kogeltjehet homogenaat door centrifugatie gedurende 10 min bij 10.000 xg en 4 ° C in een 1,5 ml conische microcentrifugebuis.
- De overdracht van de verkregen supernatant voorzichtig in een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis betalen zorgvuldige aandacht om te voorkomen dat contact opnemen met de pellet.
- Precipiteren DNA uit het homogene mengsel door toevoeging van 0,5 ml 100% ethanol per 1 ml homogenaat. Inverteer buisjes 10 keer te isoleren reagens waarborgen en EtOH voldoende gemengd.
- Op dit punt DNA precipitaat viskeus, spoel het op een plastic pipet tip (bijvoorbeeld met een maximale opnamecapaciteit van 200 pi) en vervolgens overgebracht naar een nieuwe 1,5 ml conische microcentrifugebuis.
OPMERKING: Korte centrifugeren kan worden gebruikt om alle resterende lysaat uit de geïsoleerde DNA te verwijderen.
(DNA Wash en Oplossen) - Voeg 1 ml 75% EtOH aan het geïsoleerde DNA. Suspendeer de pellet DNA grondig door het omkeren van de buizen 10 keer.
- Voorzichtig decanteren de ethanol uit de buis. Zorg ervoor dat the DNA pellet vast aan de zijkant van de buis. Bewaar de verticale buizen voor 1-2 minuten en gebruik van een pipet om overtollige EtOH vanaf de bodem van de buis te verwijderen.
- Herhaal het wassen DNA weer, en hetzij Het monster EtOH bij -20 ° C (stabiel gedurende enkele maanden) of onmiddellijk overgaan tot de spijsvertering.
- Los DNA in digestiebuffer (hieronder beschreven) en vervolgens gekwantificeerd met behulp van standaard spectroscopische werkwijzen (bijvoorbeeld, absorptie bij 260 nm met behulp NanoDrop spectrofotometer).
3. enzymatische afbraak
- Bereid "digestie buffer" met geschikte volumes gecombineerd (afhankelijk van het aantal monsters dat moet worden verteerd) van 50 mM monobasisch natriumfosfaat (bevattende 2,0 mM KCI, 1,0 mM desferal (DFO) en 200 mM MgCl2) met 50 mM dibasisch natriumfosfaat (ook bevattende 2,0 mM KCI, 1,0 mM DFO en 200 mM MgCl2). Elk monster moet 4,0 ul monobasische en 17,0 ul dibasisch fosfaat oplossing. <li> Verwijder alle overgebleven EtOH vanaf de bodem van de buis en drogen monsters gedurende 5 min. Zorg ervoor dat het DNA niet volledig uitdrogen.
- Los 80 mg geëxtraheerde DNA in 21,0 pl van de digestiebuffer, voeg 1 eenheid DNase I opgelost in 2,0 pl digestiebuffer.
- Vortex licht om een grondige menging te bereiken en incubeer gedurende 1,5 uur bij 37 ° C.
- Na afloop van de incubatieperiode voeg 216,4 ul 50 mM dibasisch natriumfosfaat oplossing die 2,0 mM KCI, 1,0 mM DFO en 200 mM MgCl 2.
- Bereid "digestiebuffer-2" Door één volume digestiebuffer negen volumina dibasische, 50 mM Na-fosfaat (met 2,0 mM KCI, 1,0 mM DFO en 200 mM MgCl2).
- Voeg 0,025 eenheden van fosfodiesterase (PDE) I enzym in 16,3 gl digestiebuffer-2. Pipet op en neer enkele seconden en vortex licht om een grondige menging te bereiken en incubeer gedurende 1,5 uur bij 37 ° C.
- Voeg 00,4 eenheden van alkalische fosfatase (AP) in 8,0 pl digestiebuffer-2. Pipet op en neer enkele seconden en vortex licht om een grondige menging te bereiken en incubeer gedurende 1,5 uur bij 37 ° C. Voeg 33,0 ul HPLC-kwaliteit methanol.
- Run gedigereerde DNA monsters aan HPLC, zoals hieronder beschreven, onmiddellijk of bewaar bij -80 ° C tot gebruik om oxidatie te minimaliseren. LET OP: De 1.5-hr spijsvertering stappen hier voorgesteld worden op basis van dergelijke intervallen voorgesteld elders 9 en over de bevindingen die vergelijkbaar protocollen te bereiken volledige DNA-vertering 9. Daarom werd aangenomen dat de enige beperkende factor te bereiken volledige spijsvertering tijd was en dat enzymremming en sample inhomogeniteit waren verwaarloosbaar.
4. HPLC Run: Voorbereiding van de mobiele fase, Instrumentatie Setup en Onderhoud
- Gebruik ultrapuur water om alle buffer oplossingen te bereiden en behandeld met een hoge hechting hars (bijv Chelex 100: styreen divinylbenzene copolymeer met iminodiacetaat ionen die chelaat overgangsmetalen met hoge affiniteit) tijdens de voorbehandeling van metalen verontreiniging en DNA-oxidatie te minimaliseren.
- Bereid 250 mM Na-fosfaatbuffer, pH 6,2. Met een verhouding van 1: 3,6957 dibasisch natriumfosfaat (FW = 177,99 g / mol) natrium fosfaat (FW = 119,98 g / mol) monobasisch.
Voorbeeld: Daarom is voor een 3 L voorraadoplossing combineren 70,81 g monobasisch en dibasisch 28,43 g poeder en voeg water toe tot bijvoorbeeld 2,8 L en controleer of de pH van de oplossing is 6,2. Pas de pH met 250 mm mono of dibasisch natriumfosfaat oplossingen, afzonderlijk en niet bereid door geconcentreerde zuren of basen. Voeg 2,24 g KCl tot een concentratie van 10 mM KCl verkrijgen. - Bereid de mobiele fase in drie flessen, minstens 1 L per stuk, met daarin: oplosmiddel B - HPLC-kwaliteit methanol, oplosmiddel - B ultrapuur water, en oplosmiddel C - fosfaatbuffer vanaf stap 4.2. Plaats HPLC mobiele fase toevoer slang in de flessen; remaining buisjes moeten worden gedoopt in een van de flessen (bijv oplossing C) en primer ook wanneer zij niet nodig zijn voor het mengen.
- Tijdens de run, meng de mobiele oplossingen fase 6% oplosmiddel A, 74% solvent B en 20% solvent C tot de uiteindelijke oplossing van 50 mM natriumfosfaatbuffer (pH 6,2) met 2,0 mM KCl, en 6% MeOH bereiken.
- Maak de elektrode uit de elektrochemische detector, demonteren en schoon referentie en werken elektroden met de elektrode reiniging oplossingen en polijsten schijven die worden aanbevolen door de fabrikant. Spoel de gereinigde oppervlakken met ultrapuur water, veeg het water uit zacht en zorgen voor de detector droog is voordat u het systeem op is.
- Monteer de detector en sluit de mobiele fase inlaat van de elektrode. Schakel de stroom en laat de mobiele fase te vullen van de elektrode voor het bevestigen van de uitlaat mobiele fase buis. Installeer een nieuwe kolom vóór het begin van optimalisatie. Controleer installatie in de juiste richting en follows aanbevelingen alle fabrikant.
- Zet de HPLC instrumentatie goed vooruit (bijvoorbeeld 1 uur) van het monster analyses evenwicht mogelijk te maken en de baseline ruis te verminderen. Zie tabel 1 voor de aanbevolen instellingen; de tegendruk grens moet worden ingesteld op 3000 psi kolom voorkomen. Schakel de ontgasser. Ga verder met het vullen van de pompen en het opzetten van solventgradiënt.
- Droge prime de pompen volgens de instructies van de fabrikant. Doe dit om de lijnen nat als een mobiele fase is vervangen of de buis inlaat blootgesteld aan lucht.
- Zoek de priming schijf en plaats een 10-15 ml plastic spuit daar. Zorg ervoor dat de spuit volledig is voor de opening van de lijn geplaatst. Voor het openen van de lijnen zet u gewoon de schijf tegen de klok voor een beurt.
- Start de prime met de juiste HPLC-interface selectie. Trek de spuit om de vloeistof te trekken in de lijnen. Zodra vloeistof stroomt, de belangrijkste is voltooid; zodat het programmaafwerking van de run. Herhaal voor alle lijnen (meestal vier, afhankelijk van het instrument).
- Als alternatief, natte prime wanneer de lijnen al bevochtigd uit een eerder droge prime (zie hieronder).
Opmerking: Wanneer een grote hoeveelheid tijd verstreken tussen gebruikers (bijvoorbeeld 2 weken), wordt een droog prime aanbevolen. - Wijzig de samenstelling van de mobiele fase oplosmiddelbestanddelen tot 25% per volgens de HPLC user interface. Van de interface, selecteer de optie "Direct Function", selecteer vervolgens "Wet Prime" optie. Dit zal prime alle lijnen tegelijk.
- Zorg ervoor dat alle lucht uit het systeem door het observeren van de natte prime lijn als het de afvalcontainer binnenkomt. Na een goede eerste, ervoor zorgen dat er geen luchtbellen worden achtergelaten in de lijn. Als er bellen aanhouden, herhaalt priming.
- Zodra de pomp gevuld is, begint het verplaatsen van de HPLC mobiele fase. Met de HPLC-interface aan de samenstelling van de mobiele fase handmatig tot 6% methanol (oplosmiddel A) en 94%water (oplosmiddel B), en selecteer een debiet van 0,9 ml / min. Laat 5 min aan een methanol te verwijderen uit de kolom reiniging stap.
- Na 5 min, verandert de samenstelling 6% methanol (solvent A), 74% water (oplosmiddel B), 20% buffer (solvent C), verhoging van het debiet 1,0 ml / min. Instellen andere parameters zoals samengevat in tabel 1, en zet de back druklimiet naar 3.000 psi tot kolom voorkomen.
OPMERKING: Mogelijke problemen met HPLC setup onder driften basislijn, split piek en verminderde intensiteit van het signaal. Deze kan doorgaans worden opgelost door het schoonmaken van de kolom na elk gebruik, frequente elektrode reinigen, en ervoor te zorgen dat de buffer oplossingen zijn vrij van verontreiniging (bv deeltjes of microbiële groei). - Laat de mobiele fase gedurende 1-1,5 uur om een stabiele basislijn signaal bereiken.
- Met behulp van het instrument software-interface, selecteer de parameters zoals aangegeven in tabel 1 en set looptijd tot 15 min. Spuit de sample. Gebruik verhoogde run tijden voor complexe monsters (bepalen dit empirisch door het observeren van de aanwezigheid of afwezigheid van pieken na 15-min interval).
OPMERKING: Instrument software maakt het programmeren van het monster voorwaarden run en setup voor autosampling. - Nadat de runs zijn voltooid, schakelt u de detector cel met behulp van de interface van de detector. Het is belangrijk om aanbevelingen van de fabrikant op te volgen ten aanzien van het uitzetten van de detector als onjuiste behandeling en stilleggen kan het instrument beschadigen. NIET uit de cel schakelen door de achterkant van de detector Dit kan het apparaat beschadigen.
- Handmatig de mobiele fase samenstelling tot 6% methanol en 94% water. Ren voor 5 min.
- Handmatig vermindering van de stroomsnelheid 0,7 ml / min, direct iets samenstelling MeOH 50% en 50% water. Run minstens 20 min. Niet deze stap voor de aanbevolen tijd zou kunnen leiden tot beschadiging van de kolom en de detector in werking. Schakel de stroom, eend zet de ontgasser.
5. Voorbereiding van de normen
- Bereid mobiele fase buffer zoals beschreven in stappen 4,1-4,3 hierboven. Het is belangrijk de HPLC mobiele fase gebruikt voor de bereiding van standaarden pieken verkregen door het mengen van ongelijksoortige oplossingen na monsterinjectie voorkomen.
- Verdun deze oplossing een op de vijf met ultrapuur water voorafgaand aan het gebruik en de uiteindelijke oplossing moet 6% MeOH bevatten.
- dGuo Standard
OPMERKING: High oxidatiepotentiaal vereist dGuo detectie kan het risico meten storende elektro verbindingen verhogen. Dit kan worden gecontroleerd door, bijvoorbeeld, een standaard curve van UV detectie van dGuo bij 260 nm en vergeleken met de standaardkromme die met EC detectie. Als beide goed uitlijnen (bijvoorbeeld aanvullend figuur 1) en de monstermatrix effecten zijn meegenomen, kan men overgaan tot dGuo detectie door UV bij 260 nm, in plaats van EC detectie.- Vortex op hoge snelheid tot dGuo lost helemaal. Dit is de primaire voorraad; bewaren bij -20 ° C gedurende enkele weken.
- Om de secundaire dGuo voorraad (0,5 mM) te maken, verdunnen 143 ul van de primaire dGuo voorraad in 857 ul van HPLC mobiele fase. Bewaar op ijs tot gebruik en dagelijks vers te bereiden.
- Verdere verdunningen van een standaard curve te maken (bijvoorbeeld, Tabel 2). Store oplossingen op ijs en bereiden dagelijks vers. Run normen in serie met experimentele monsters.
- Voorafgaand aan werking, variëren de detector voltage met de hoogste concentratie van de bouillon aan optimale voltage vinden.
- 8-oxo-dGuo Standard
- Meet 1,0 mg van 8-oxo-dGuo in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Voeg 0,1 ml HPLC kwaliteit methanol. Vortex op hoge snelheid tot 8-oxo-dGuo lost helemaal. Dit is de primaire voorraad van 8-oxo-dGuo. Bewaren bij -20 ° C voor sevmene weken.
- In een aparte buis, combineer 2,9 ul van de primaire voorraad en 997,1 pl HPLC mobiele fase buffer, vortex. Dit is de secundaire voorraad (10.000 nM).
- Om een werkende oplossing voor de standaard curve (250 nm) te creëren, combineren 24,4 ul van secundaire voorraad en 975,6 pl mobiele fase buffer.
- Voer verdere verdunningen om de vereiste om een standaardcurve te maken oplossingen (bijvoorbeeld tabel 3). Store oplossingen op ijs en bereiden dagelijks vers. Run normen met de experimentele monsters.
- Kwantificatie
- Integratie van het oppervlak onder de curve voor zowel 8-oxo-dGuo en dGuo behulp van standaard software (als onderdeel van HPLC-computer interface; zie aanvullende figuur 2A).
- Construct standaardkromme (bekende concentratie van elk analyt vs. oppervlakte onder de curve (aanvullend Figuur 2B). De vergelijking van de standaardcurve Bereken de verhouding van 8-oxo-dGuo / dGuo voor elk monster.
6. Agarosegelelektroforese
OPMERKING: Agarose gelelektroforese kan worden uitgevoerd om de volledigheid van DNA digestie controleren.
- Bereid 50x Tris-acetaat-EDTA (TAE) buffer, door het oplossen van 242 g Tris base (FW = 121,14) in 750 ml ultrapuur water. Voeg 57,1 ml ijsazijn en 100 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0, EDTA lost geheel wanneer de oplossing pH ingesteld op 8,0 met bijvoorbeeld NaOH) en voeg ultrazuiver water tot een eindvolume van 1 L. Store bij KT Deze verdunde oplossing 50x vóór gebruik.
- Weeg 1 g agarose en los het op in 100 ml 1x TAE buffer, verwarming in de magnetron voor 1-2 min. Draag een veiligheidsbril en beschermende uitrusting om contact met kokend agarose vermijden.
- Koel de oplossing naar beneden tot ongeveer 50 ° C, voeg 5 ul ethidiumbromide (let op: mutagene stof) en giet het in de agarosegel running apparaat. Plaats de kam.
- Wacht tot de oplossing stolt, giet TAE buffer over de gel en plaats de monsters (volume afhankelijk van de kam grootte, meestal, wordt 10-20 ul van DNA-monster geladen, gemengd met 6x lopen kleurstof om te visualiseren en het laden te vergemakkelijken).
- Laat de gel totdat de kleurstof migreert ongeveer 2/3 van de lengte van de gel (bijvoorbeeld 45 minuten bij 150 V). Visualiseer DNA-banden onder UV-licht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
dGuo werd waargenomen dat een retentietijd van 4,7 min, terwijl 8-oxo-dGuo had een retentietijd van ongeveer 6,4 min (figuur 2A en B) hebben. Er is ongeveer 1000-voudig verschil in de piekhoogten tussen de twee analyten, zoals in figuur 2C. Voltammogrammen van 8-oxo-dGuo en dGuo werden verkregen door het uitvoeren van normen in een werkende potentiaal in het gebied van 0,2-1,1 V. het optimale mogelijkheid van 8-oxo-dGuo werd bepaald op 0,5 V en 0,9 V voor dGuo (figuur 3). Deze mogelijkheden zijn in overeenstemming met andere glasachtige koolstof elektroden in de literatuur beschreven 14,15. De limiet van detectie en dynamisch bereik van 8-oxo-dGuo en dGuo elektrochemische detectie wordt gemeld om in de femtomol en nanomol range respectievelijk 8,9. Standaard curven voor dGuo en 8-oxo-dGuo moet dagelijks worden uitgevoerd om lineaire detectie zorgen over een geschikt concentratiegebied en de juiste uit te voerenkomstig van het instrument (figuur 4). Standaard krommen worden geconstrueerd door het uitzetten van het piekoppervlak als functie van bekende concentratie analyten (aanvullend figuur 2) waarmee men de analytconcentratie in de monsters berekend uit de vergelijking gegenereerd uit de standaard curves.
Volledig DNA digestie vereist voor nauwkeurige metingen van 8-oxo-dGua frequentie en aantal genomisch DNA digestie werkwijzen zijn voorgesteld 8,15,16. Indien nodig, kan de werkzaamheid van DNA extractie en digestie worden geverifieerd met agarosegelelektroforese (figuur 5A) en HPLC-ED (figuur 5B). Lanes met duidelijke DNA uitstrijkje in figuur 5A (bijvoorbeeld lanen 2, 4, 6, 9, 11 en 13) geven de aanwezigheid van onverteerd DNA terwijl monsters met gedigesteerde DNA fragmenten werking van de gel en waren dus onopgemerkt. Het plateau in figuur 5B geeft aan dat verdere incubatiop DNA met verteringsenzymen dan 1,5 uur niet tot grotere hoeveelheid dGuo gedetecteerd, wat suggereert bijna volledige digestie na 1,5 uur. Daarnaast werden zowel agarose gelelektroforese en HPLC-ED gebruikt om de bruikbaarheid van de fosfaathoudende DNA digestiebuffer hier toegepaste testen. Deze buffer is goed afgestemd op de HPLC mobiele fase en niet leidt tot ongewenste detector noise geven wijten aan het mengen van ongelijksoortige oplossingen (gegevens niet getoond). Daarom is de overgang van de buffer in de literatuur (bijvoorbeeld, Tris-HCl 8) aan natriumfosfaatbuffer wordt aanbevolen voor dit protocol (linker versus rechter zijde van figuur 5A). Houdt u er rekening mee dat de onderliggende veronderstellingen voor de optimalisatie van DNA de vertering waren dat enzymremming en sample inhomogeniteit waren verwaarloosbaar en de spijsvertering tijd was de enige beperkende factor, zoals hierboven vermeld. Een mogelijkheid dat onvolledige DNA spijsvertering resulteerde in fragmenten die te klein dete te zijncted op agarose gel overblijft. Hoewel dergelijke systematische fout zou ook gelden voor alle monsters verdere experimenten (bijv behandeling van gekweekte cellen met radioactief gemerkt pro-oxidant 10) worden uitgevoerd om volledig uit dergelijke mogelijkheid.
Unlike standaardoplossingen, het gedigereerde DNA, hetzij van geïsoleerde cellen of muisweefsels bracht meerdere additionele pieken (figuur 6A en 6B). Dit waren ver van de 8-oxo-dGuo en dGuo pieken, maar spiking experimenten als onderdeel van valideringsoefeningen die in de discussie nodig onderzoeken of additionele pieken (bijv sample onzuiverheid als gevolg van matrixeffecten, bijvoorbeeld) verstoren kwantificering . De 8-oxo-dGuo piek werd bevestigd door overeenstemming van de retentietijd van de standaard; en bovendien, verhoging van de 8-oxo-dGuo piek voor monsters uit cellen of dieren die pro-oxidant behandeling onderging (figuur 7). Pro-oxidant KBrO 3 participeert in één-electron abstractie van guanine die leidt tot 8-oxo-dGuo formatie 17. Het is opmerkelijk dat bij afwezigheid van de pro-oxidatieve stress, 2,4 moleculen van 8-oxo-dGuo per 10 7 dGuo in A549-cellen (Figuur 7A) gedetecteerd. Dit is vergelijkbaar met 4,5 moleculen van 8-oxo-dGuo / 10 7 dGuo gedetecteerd in A549-cellen waargenomen onder toepassing van een alternatieve, massa spectrometrische aanpak om mogelijke tekortkomingen van de HPLC-ED-methode 9 pakken. DBC behandeling (dwz dagelijks 20,0 mg DBC / kg lichaamsgewicht per dag gedurende drie dagen) steeg met 8-oxo-dGuo levels in de muis milt DNA. Dit is ook een verwachte resultaat, omdat ROS bekend bij het metabolisme van polycyclische aromatische koolwaterstoffen in vivo 8 te produceren. De relatieve niveaus van 8-oxo-dGuo in de milt van onbelaste dieren waren 8,3-9,4 8-oxo-dGuo / 10 6 dGuo (figuur 7B), die in uitstekende overeenkomst tert met gepubliceerde waarden van vier 8-oxo-dG moleculen / 10 6 dGuo gemeten murine miltcellen onder standaardomstandigheden door HPLC-ED 18. Figuren 6 en 7 tonen dat het niveau van 8-oxo-dGuo boven de basislijn zijn erg klein . Dus als DNA wordt geoxideerd tot een lager niveau dan hier waargenomen, kunnen de niveaus van 8-oxo-dGuo niet te onderscheiden van de uitgangswaarde, die in het achterhoofd moeten worden gehouden door potentiële protocol gebruikers.
Figuur 1. Structuur van 8-oxo-dGuo en zijn tautomeer 8-OH-dGuo. Let 8-oxo-dGuo plaats van 8-OH-dGuo is grote tautomeer bij pH 7,4.
Figuur 2. De retentietijden voor dGuo (A) en 8-oxo-dGuo (B). HPLC-ED chromatogrammen werden verkregen uit een 10,0 pl injectie van ofwel dGuo, (1,0 nmol totaal) of 8-oxo-dGuo (1000 fmol totaal) en gedetecteerd bij 0,9 V (A) of 0,5 V (B). De retentie piek van dGuo ongeveer 4,7 min (A) en die van 8-oxo-dGuo ongeveer 6,4 min (B). De brede piek bij 2-3 min wordt waarschijnlijk veroorzaakt door injectie stoornissen en wordt niet beïnvloed (dat wil zeggen steeds aanwezig vergelijkbare intensiteit) door de concentratie van 8-oxo dGuo. (C) Op elkaar geplaatste chromatogrammen van twee afzonderlijke injecties (A) beschreven en (B) gedetecteerd met UV (260 nm). De normen werden uitgevoerd op dezelfde dag met dezelfde run voorwaarden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
es / ftp_upload / 52.697 / 52697fig3.jpg "/>
Figuur 3. optimaliseren detector voltage. (A) voltamogram van dGuo (eindconcentratie 1 nmol) gedetecteerd door HPLC-ED-analyse op een afstand van 0,7-1,1 V. (B) voltamogram van 8-oxo-dGuo (eindconcentratie 500 fmol) gedetecteerd door HPLC-analyse op ED verschillende 0,3-0,7 V. Wijze van drie onafhankelijke experimenten (N = 3) ± standaard- deviatie getoond. In sommige gevallen foutbalkjes kleiner dan de symbolen plotten.
Figuur 4. Standaard curve dGuo (A) en 8-oxo-dGuo (B). Tien microliter van ofwel dGuo of 8-oxo-dGuo geïnjecteerd en gemeten met HPLC-ED bij 0,9 V (A) of 0,6 V (B ). Via drie onafhankelijke experimenten (N = 3) ± standaard- deviatie getoond. In sommige gevallen fout bars zijn smAller dan het plotten symbolen.
Figuur 5. Optimalisatie van DNA digestie. (A) Tachtig microgram zalm testes-DNA werd gedigereerd zoals beschreven 8 in Tris-HCl, glycine-acetaatbuffer (links) of natriumfosfaatbuffer (rechts). Agarose gel-elektroforese (1,0%) werd uitgevoerd bij 150 V gedurende 45 minuten. Laan 1 en 8: DNA ladder; lanen 2, 4 en 6: onverteerd DNA; lanen 3, 5 en 7: gedigereerd DNA; lanen 9, 11 en 13: gedigereerde DNA (fosfaatbuffer); lanen 10, 12 en 14. gedigereerd DNA (fosfaatbuffer) (B) Salmon testes-DNA (80 ug) werd gedigereerd hierin door incubatie met DNase I, PDE I en AP 0,5-2,5 uur per elke stap, in 50 mM fosfaatbuffer bevattende magnesiumchloride en DFO. Vijftig microliter van elk monster gemaakt met 7,3 ug gedigereerd DNA werd geanalyseerd met HPLC (dwz 0,9 V en 1 ml / min flow) te detecteren dGuo. Figuur toont middel van drie onafhankelijke experimenten (N = 3) ± standaardafwijking van het gemiddelde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Chromatogrammen van 8-oxo-dGuo detectie in gekweekte cellen (A) of dierlijk weefsel (B). (A) gedigereerde DNA uit A549-cellen, behandeld of onbehandeld met KBrO 3. (B) gedigereerde DNA van de milt van DBC behandelde muizen. Pieken naar links verschoven als gevolg van de verwijdering van voorkolom (door drukopbouw in het apparaat; hun positie werd bevestigd normen). Standaarden en monsters werden op dezelfde dag met behulp van identieke run condities en 10 ml injectie volumes van 1 ml / minuut stroomsnelheid en 0,5 en 0,9 V voor dGuo en 8-oxo-dGuo resp. Klik hier voor een grotere versie van het paneel A, hier voor het panel B.
Figuur 7. Kwantificering van 8-oxo-dGuo in biologische monsters. Pieken werden geïntegreerd en vergeleken met standaard curves (zie aanvullende figuur 2 voor meer details) om 8-oxo-dGuo levels in DNA verkregen uit A549-cellen, behandeld met KBrO 3 ( A) of 8-oxo-dGuo levels in DNA van de milt van DBC-behandelde muizen (B). Sterren (*) geven de statistische significantie (p <00,05, één-factor variantieanalyse (ANOVA) (A) t-toets (B)). Via drie (A) of vijf (B) onafhankelijke experimenten ± standaardfout van het gemiddelde wordt weergegeven. Monsters werden verzameld 4 of 24 uur na de 3-daagse behandeling.
| Mobiele fase | 50,0 mM Na-fosfaatbuffer, pH 6,2, met 6% MeOH en 2,0 mM KCl |
| Mobiele fase debiet | 1,0 ml / min |
| Kolomtype | YMC-BASIC met gebonden sferische silica |
| Kolomlengte | 15 cm |
| Column binnendiameter | 3,5 mm |
| Kolomtemperatuur | 35 ° C |
| Detector temperatuur | 29 ° C |
| Voltage instelling voor 8-oxo-dGuo | 0,5 V |
| Voltage instelling voor dGuo | 0,9 V |
| Injectievolume | 10,0 ml |
Tabel 1. Instrument parameters voor detectie en kwantificering van 8-oxo-dGuo HPLC-ED.
| nmol | 100 nM standaard, gl | HPLC Mobiele fase, ui | Verdunning, vouw |
| 5 | 300 | 0 | 1 |
| 2.5 | 150 | 150 | 2 |
| 1 | 60 | 240 | 5 |
| 0.5 | 30 | 270 | 10 |
| 0.25 | 15 | 285 | 20 |
| 0.1 | 6 | 294 | 50 |
Tabel 2. </ Strong> Voorbereiding van de standaard curve voor dGuo.
| fmol | 250 Nm standaard, ui | HPLC Mobiele fase, ui | Verdunning, vouw |
| 2500 | 300 | 0 | 1 |
| 1000 | 120 | 180 | 2.5 |
| 500 | 150 | 150 | 5 |
| 250 | 150 | 150 | 10 |
| 100 | 120 | 180 | 25 |
| 50 | 150 | 150 | 50 |
Tabel 3. Bereiding van standaardcurve voor 8-oxo-dGuo.
Sup complementaire Figuur 1. Vergelijking elektrochemische (EC) en UV-gebaseerde detectie van dGuo. Standaard curve werd gemaakt voor dGuo detectie door elektrochemische detectie (EC) of UV-detectie (260 nm). Peak gebieden werden geïntegreerd voor dGuo piek bij ongeveer 4,7 min van beide methoden. N = 3, gemiddelde ± standaardafwijking worden weergegeven.
Aanvullende Figuur 2. Kwantificering van dGuo uit de standaardcurve. Een voorbeeld van het gebruik van de standaardcurve voor het gehalte aan dGuo wordt weergegeven. (A) piekoppervlakte kan worden bepaald door integratie met standaard software. (B) Deze informatie wordt gebruikt een standaard curve te construeren om de vergelijking van de lijn om de onbekende analytconcentratie in het monster uit.52.697 / 52697fig9large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel de 8-oxo-dGuo is gerapporteerd als nuttig biomarker van DNA oxidatie, kan de betrouwbare kwantificering uitdaging vormen. Hoewel een aantal gepubliceerde methoden bestaan, is er behoefte aan een alomvattend, beschrijvende overzicht protocol voor onderzoekers mogelijk de werkwijze in het laboratorium te zetten. Hier presenteren we een gedetailleerd overzicht van een HPLC-gebaseerd protocol dat nieuwe gebruikers toe om een effectieve werkwijze voor 8-oxo-dGuo detectie en kwantificering stellen.
Drie belangrijke methoden die zijn beschreven voor het kwantificeren van 8-oxo-dGuo. Deze omvatten enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA) -gebaseerde commerciële kits 19, vloeistofchromatografie / massaspectrometrie (MS) (bijvoorbeeld zoals elders 9 en HPLC-ED werkwijzen zoals die hierin beschreven. ELISA methoden lijden aan storingen bepaalde stoffen in biologische monsters 19. In het algemeen resultaten verkregen met Chromatographic technieken betrouwbaarder geacht voor 8-oxo-dGuo kwantificatie ten opzichte van ELISA-gebaseerde methoden 20. Bij vergelijking van de HPLC-ED methoden MS-gebaseerde methoden, het voordeel van de eerste is relatief goedkoop materiaal (bijvoorbeeld ongeveer een orde van grootte minder kostbaar dan Voorzieningen voor MS-gebaseerde werkwijzen). Bovendien, HPLC-MS superieur HPLC-ED inhouden het eerstgenoemde niet gevoelig zijn voor potentiële interferenties met elektro-actieve verbindingen en ondubbelzinnige kwantitatieve metingen met 21 isotopen.
Er is bezorgdheid geuit over het gebruik van traditionele fenol extractie werkwijzen voor de extractie van genomisch DNA te gebruiken voor 8-oxo-dGuo kwantificering 22. Verschillende onderzoekers hebben geconstateerd dat de voorwaarden in verband met de standaard fenolextractie ongewenste dGuo oxidatie kan dus introduceren toenemende uitgangswaarde 1,9. Om dit probleem, mobiele en anima pakkenl genomisch DNA kan worden geëxtraheerd en gezuiverd onder toepassing van een gemodificeerd protocol DNAzol 22. DNAzol bevat hoge concentraties van guanidinethiocyanaat, en eerdere studies 9 hebben lagere basaal niveau 8-oxo-dGuo formatie wanneer DNAzol wordt gebruikt in vergelijking met traditionele fenol en NaI gebaseerde extractie methoden genoteerd. De ijzerchelaterende verbinding DFO werd gebruikt voor de productie van ROS en DNA-oxidatie te minimaliseren tijdens de voorbehandeling. Zoals hierboven opgemerkt, de 8-oxo-dGuo niveaus in onbelaste A549-cellen (Figuur 7A) waren zeer vergelijkbaar met wat werd gemeten door MS-gebaseerde methode 13. Dit suggereert dat de integratie van de voorzorgsmaatregelen beschreven voor de MS-gebaseerde methoden 13 toegestaan minimalisatie van ongewenste DNA-oxidatie tijdens de voorbehandeling en analyse om nauwkeurige 8-oxo-dGuo kwantificering door middel van HPLC-ED bereiken. Timing van de autopsie of oogsten cultuur cellen na pro-oxidant behandeling kan een belangrijke factor zijn, zoals hier te zien door de dalende 8-oxo-dGuo levelsin de milt van 24 uur versus 4 uur na de laatste behandeling (Figuur 7B). Dit kan te wijten zijn aan de activering van de base excisie reparatie van DNA-schade te elimineren.
De twee duidelijke beperkingen van de beschreven werkwijze zijn: (1) het vereiste van vrij grote hoeveelheden DNA (ongeveer 80 ug per monster drie technische replicaten bereiken), en (2) mogelijke interferentie van co-elutie verbindingen. Gebleken is dat slechts een zeer klein (bijvoorbeeld ongeveer 15 mg) stuk milt (ongeveer 15% van het totale gewicht weefsel) was voldoende te zijn om 80 ug DNA, waardoor een voldoende hoeveelheid weefsel voor andere (bijv genexpressie) analyses. De hoeveelheid onttrokken DNA is een kritische parameter die kunstmatig DNA oxidatie 23,24,25 beïnvloedt. Daarom werken met vrij grote (~ 80 mg / monster) die we stellen hier is in overeenstemming met eerdere aanbevelingen van het gebruik van> 30 mg tot artefactuele DNA oxidatie 25 te minimaliseren.Voor kleinere weefsels (bijvoorbeeld de hippocampus), zou men schaal brengen van het protocol te beginnen met 20-30 ug DNA, omdat deze moet voldoende voor 2-3 runs. Grotere hoeveelheden DNA zou waarschijnlijk vergemakkelijkt het oplossen van toppen boven achtergrondruis, maar dit blijft experimenteel geverifieerd De aanwezigheid van mogelijk storende stoffen kunnen van geval per geval aangepakt worden, en is het noodzakelijk om altijd omvatten DNA-monster van gelijktijdig in vitro of in vivo behandelingen met een positieve controle waarvan bekend is dat oxidatieve DNA schade induceren (zie figuur 7).
Hoewel het fosfaat in fosfaatbuffer is vermeld dat de activiteit van alkalische fosfatase verminderen werkwijze optimalisatie experimenten (figuur 5) is bevestigd dat fosfaatbuffer gemakkelijk kan worden gebruikt. Aangezien fosfaatbuffer aanwezig is in de mobiele fase, het gebruik ervan bij monsterbereiding verminderd detector ruis als gevolg solvent mengen. Zo voltage, buffer samenstelling, DNA-extractie en de spijsvertering werden geoptimaliseerd en positieve controles werden opgenomen. Bovendien wordt een overzicht geven hoe deze variabelen verder kan worden geoptimaliseerd door elk laboratorium voorzien. Ons doel was om een werkwijze die bruikbaar is voor een gespecialiseerd laboratorium voor het ontwikkelen van een test voor 8-oxo-dGuo detectie en kwantificering kon produceren.
Wij constateren echter dat de formele validatie van de methode vereist is, zoals uiteengezet onder de validaties stappen aanbevolen door de Internationale Conferentie voor Harmonisatie van de technische voorschriften voor de registratie van Geneesmiddelen voor Menselijk Gebruik (ICH) voor de validatie van analytische procedures (dwz, ICH Q2 ( R1) 26). In het kort, zouden de belangrijkste ingrediënten van kwantitatieve validatie van de assay te onderzoeken: 1) nauwkeurigheid (die kan worden bereikt door het opnemen van monsters met verschillende hoeveelheden van 8-oxo-dGuo spiked-in, 2) bereik en de lineariteit (lineaire respons over extended analytconcentratie; 3) de precisie (herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid); 4) aantoonbaarheidsgrens (algemeen, het punt waarop het signaal-ruisverhouding groter of gelijk is 03/02, kan matrix-afhankelijke) zijn; 5) kwantificeringslimiet (concentratie waarbij de reactie aan bepaalde voorafbepaalde niveaus zoals 2 x standaarddeviatie van de controle, kunnen matrix-afhankelijke) zijn; 6) selectiviteit / specificiteit (het vermogen om de analyt in complexe monsters versus nette oplossingen) op te sporen; 7) reproduceerbaarheid (het vermogen om hetzelfde resultaat in verschillende laboratoria met verschillende operators) krijgen; en 8) kracht en systeem geschikt. Aangezien het doel van de validatie aanbevolen door de ICH kan worden aangetoond dat het "geschikt voor het beoogde doel" en veel laboratoria zullen waarschijnlijk verschillende doeleinden, zou de potentiële gebruikers van deze assay te valideren dit voor zover nodig wordt geacht. Nauwkeurige kwantificering van 8-oxo-dGuo wenselijk in de toxicologie en moleculaire geneeskunde zonde isce kan het begrip van hoe oxidatieve stress, en meer specifiek DNA oxidatie verbeteren, is mechanistisch en empirisch gekoppeld aan nadelige effecten op de gezondheid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door de Health Canada Genomics Research en Development Initiative (GRDI) en de Canadese regelgeving strategie voor Biotechnologie (CRSB). De auteurs hebben geen belangenconflict.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-oxo-dGuo standard | Cayman Chemical Company | 89320 | Inappropriately referred to as "8-hydroxy-2'-deoxy Guanosine"; see Fig. 1 and text for details. |
| Alkaline phosphatase | Sigma-Aldrich | P5931 | From E. coli |
| Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | Chelates heavy metals |
| Desferoxamine mesylate | Sigma-Aldrich | D9533 | |
| dGuo standard | Sigma-Aldrich | D7145 | |
| Dibasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| DNA from salmon sperm | Sigma-Aldrich | D1626 | Sodium salt |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4527 | TypeII, from bovine pancreas |
| DNAzol | Invitrogen | 10503-27 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | The compound would not completely dissolve until solution pH is adjusted to 8.0 (e.g. with NaOH) |
| F12-K media | ATCC | 30-2004 | |
| Foetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | |
| Guard column | Chromatographic Specialties | YBA 99S03 0204GC | Protects colum from contamination; may also lead to pressure build-up |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Monobasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline | Invitrogen | 15190-250 | |
| Phosphodiesterase I enzyme | Sigma-Aldrich | P3243 | Type II from Crotalus adamaneus venom |
| Teflon homogenizer | Thomas Scientific | 7724T-1 or 7724T-5 for 1 or 5 mL, respectively | Volume (holding capacity) depends on the amount of sample to be processed. |
| Trypsin | Invitrogen | 15050-065 | |
| YMC-BASIC column with bonded spherical silica | Chromatographic Specialties | YBA 99S03 1546WT |
References
- Helbock, H. J., Beckman, K. B., Shigenaga, M. K., Walter, P. B., Woodall, A. A., Yeo, H. C., Ames, B. N. DNA oxidation matters: The HPLC-electrochemical assay of 8-oxo-deoxyguianosine and 8-oxo-guanine. Proc. Natl. Acad. Sci. 95 (1), 288-293 (1998).
- Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, C. 8-hydroxy-2' -deoxyguanosine (8-OHdG): A critical biomarker of oxidative stress and carcinogenesis. J. Environ. Sci Health C Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 27 (2), 120-139 (2009).
- Cadet, J., Bellon, S., Douki, T., Frelon, S., Gasparutto, D., Muller, E., Pouget, J. P., Ravanat, J. L., Romieu, A. Radiation-induced DNA damage: formation, measurement, and biochemical features. J Environ Pathol Toxicol Oncol. 23 (1), 23-23 (2004).
- Weiss, J. M., Goode, E. L., Ladiges, W. C., Ulrich, C. M. Polymorphic variation in hOGG1 and risk of cancer: a review of the functional and epidemiologic literature. Mol. Carcinog. 42 (3), 127-141 (2005).
- Culp, S. J., Cho, B. P., Kadlubar, F. F., Evans, F. E. Structural and Conformational Analyses of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine. Chem. Res. Toxicol. 2 (6), 416-422 (1989).
- Cooke, M. S., Loft, S., Olinski, R., Evans, M. D., Bialkowski, K., Wagner, J. R., Dedon, P. C., Møller, P., Greenberg, M. M., Cadet, J. Recommendations for standardized description of and nomenclature concerning oxidatively damaged nucleobases in DNA. Chem. Res. Toxicol. 23 (4), 705-707 (2010).
- Jang, Y. H., Goddard, W. A. 3rd, Noyes, K. T., Sowers, L. C., Hwang, S., Chung, D. S. First principles calculations of the tautomers and pKa values of 8-oxoguanine: implications for mutagenicity and repair. Chem. Res. Toxicol. 15 (8), 1023-1035 (2002).
- Park, J. -H., Gopishetty, S., Szewczuk, L. M., Troxel, A. B., Harvey, R. G., Penning, T. M. Formation of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo) by PAH o-quinones: involvement of reactive oxygen species and copper(ii)/copper(i) redox cycling. Chem. Res. Toxicol. 18 (6), 1026-1037 (2005).
- Mangal, D., Vudathala, D., Park, J. H., Lee, S. H., Penning, T. M., Blair, I. A. Analysis of 7,8-dihydro-8-oxo-2'-deoxyguanosine in cellular DNA during oxidative stress. Chem. Res. Toxicol. 22 (5), 788-797 (2009).
- Ravanat, J. L., Douki, T., Duez, P., Gremaud, E., Herbert, K., Hofer, T., Lasserre, L., Saint-Pierre, C., Favier, A. Cellular background level of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine: an isotope based method to evaluate artefactual oxidation of DNA during its extraction and subsequent work-up. Carcinogenesis. 23 (11), 1911-1918 (2002).
- Gossen, J. A., De Leeuw, W. J. F., Tan, C. H. T., Zwarthoff, E. C., Berends, F., Lohman, P. H. M., Knook, D. L., Vijg, J. Efficient rescue of integrated shuttle vectors from transgenic mice: A model for studying mutations in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (20), 7971-7975 (1989).
- Test No. 488: Transgenic Rodent Somatic and Germ Cell Gene Mutation Assays. , Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD). Available from: http://www.oecd-ilibrary.org (2015).
- Van Campen, L. E., Murphy, W. J., Franks, J. R., Mathias, P. I., Toraason, M. A. Oxidative DNA damage is associated with intense noise exposure in the rat. Hear Res. 164 (1-2), 164-161 (2002).
- European Standards Committee on Oxidative DNA Damage (ESCODD). Measurement of DNA oxidation in human cells by chromatographic and enzymic methods. Free Radic. Biol. Med. 34 (8), 1089-1099 (2003).
- Rebelo, I. A., Piedade, J. A., Oliveira-Brett, A. M. Development of an HPLC method with electrochemical detection of femtomoles of 8-oxo-7,8-dihydroguanine and 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine in the presence of uric acid. Talanta. 63 (2), 323-331 (2004).
- Ravanat, J. -L., Turesky, R. J., Gremaud, E., Trudel, L. J., Stadler, R. H. Determination of 8-oxoguanine in DNA by gas chromatography-mass spectrometry and HPLC-electrochemical detection: overestimation of the background level of the oxidized base by the gas chromatography-mass spectrometry assay. Chem. Res. Toxicol. 8 (8), 1039-1045 (1995).
- Kawanishi, S., Murata, M. Mechanism of DNA damage induced by bromate differs from general types of oxidative stress. Toxicology. 221 (2-3), 172-178 (2006).
- Tahara, S., Kaneko, T. Susceptibility of mouse splenic cells to oxidative DNA damage by x-ray irradiation. Biol. Pharm. Bull. 27 (1), 105-108 (2004).
- Garratt, L. W., Mistry, V., Singh, R., Sandhu, J. K., Sheil, B., Cooke, M. S., Sly, P. D. Interpretation of urinary 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine is adversely affected by methodological inaccuracies when using a commercial ELISA. Free Radic. Biol. Med. 48 (11), 1460-1464 (2012).
- Cooke, M. S., Collins, A., Olinski, R., Rozalski, R., Loft, S. Harmonising measurements of 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine in cellular DNA and urine. Free Radic. Res. 46 (4), 541-553 (2012).
- Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. L. Measurement of oxidatively generated base damage in cellular DNA. Mutat Res. 711 (1-2), 3-12 (2011).
- Chomczynski, P., Mackey, K., Drews, R. DNAzol: a reagent for the rapid isolation of genomic DNA. Biotechniques. 22 (3), 550-553 (1997).
- Collins, A. R., Cadet, J., Möller, L., Poulsen, H. E., Viña, J. Are we sure we know how to measure 8-oxo-7,8-dihydroguanine in DNA from human cells. Arch Biochem Biophys. 423 (1), 57-65 (2004).
- Badouard, C., Ménézo, Y., Panteix, G., Ravanat, J. L., Douki, T., Cadet, J. Determination of new types of DNA lesions in human sperm. Zygote. 16 (1), 9-13 (2008).
- Cadet, J., Douki, T., Gasparutto, D., Ravanat, J. L. Oxidative damage to DNA: formation, measurement and biochemical features. Mutat Res. 531 (1-2), 1-2 (2003).
- Validation of analytical procedures: text and methodology Q2(R1). International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH), 2015 Mar 1, San Diego, CA, , Available at: http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q2_R1/Step4/Q2_R1__Guideline.pdf (2015).
