Abstract
Isquemia e reperfusão (IR) lesão é conhecido por contribuir significativamente para a morbidade e mortalidade associadas com acidentes vasculares cerebrais isquêmicos. Acidentes vasculares cerebrais isquêmicos são responsáveis por 80% de todos os acidentes vasculares cerebrais. Uma causa comum de lesão de IR é o rápido ingresso de fluidos após uma oclusão crónica / aguda de sangue, os nutrientes, oxigénio ao tecido provocando a formação de radicais livres.
Acidente vascular cerebral isquémico é seguido pela barreira sangue-cérebro (BBB) e disfunção vasogénico edema cerebral. Estruturalmente, as junções apertadas (TJS) entre as células endoteliais desempenham um papel importante na manutenção da integridade da barreira sangue-cérebro (BBB). IR lesão é uma lesão secundária precoce conduz a uma resposta não específica, inflamatória. Estresse oxidativo e inflamação metabólica seguinte desencadeia dano cerebral secundário, incluindo a certificação permeabilidade e perturbação da junção apertado integridade (TJ).
Nosso protocolo apresenta in vitro </ Em> exemplo de privação de oxigênio-glucose e reoxigenação (OGD-R) em células endoteliais cérebro de rato integridade TJ e formação de fibras de stress. Actualmente, vários experimental em modelos in vivo são utilizados para estudar os efeitos da lesão de IR; no entanto eles têm várias limitações, como os desafios técnicos na realização de cirurgias, gene influências moleculares dependentes e dificuldade em estudar as relações mecanicistas. No entanto, em modelos in vitro pode ajudar a superar muitas destas limitações. O protocolo apresentado pode ser usado para estudar os mecanismos moleculares e várias relações mecanísticos para proporcionar potenciais estratégias terapêuticas. No entanto, os resultados de estudos in vitro pode ser diferente da padrão em estudos in vivo e deve ser interpretado com cautela.
Introduction
A isquemia-reperfusão (IR) é encontrada lesão a ser a causa frequente de diversas complicações debilitantes e mortes associadas com acidente vascular cerebral, enfarte do miocárdio, trauma, doença vascular periférica e lesão cerebral traumática 1,2. IR lesão em vasos cerebrais é uma lesão secundária precoce levando a inflamação e edema 3. Uma das complicações graves que ocorrem como um resultado de stress oxidativo e metabólica seguinte inflamação é a perda de equilíbrio homeostático que conduz à formação de radicais livres, alterações na barreira sangue-cérebro (BBB) junções apertadas (TJs) e permeabilidade microvascular 4,5.
Actualmente, em modelos in vivo utilizados para estudar os efeitos do dano por IR na certificação incluem a oclusão da artéria cerebral média (MCAO), microembolia, e animais transgénicos ou knockout. No entanto, cada um tem os seus inconvenientes e limitações como discutido por Hossmann 6. Modelo MCAO é usado para estudar o effecst de estresse redox, mudanças nas comunicações de junção da certificação e as interações entre o cérebro e as células do sistema imunológico. No entanto, eles apresentam vários desafios técnicos, tais como a necessidade de procedimentos microcirúrgicos precisas e as dificuldades das mesmas. Microembolismo instantaneamente quebra da BBB, enquanto o uso de animais transgénicos ou knockout para estudar a isquemia cerebral pode ter desafios como influências dependente de genes moleculares na formação de enfarte, alterações na anatomia vascular e diferentes pesos corporais 6. Portanto, modelos in vitro de isquemia ter encontrado um interesse crescente nos últimos tempos, principalmente devido à sua aplicabilidade na realização de estudos sobre os mecanismos de drogas. No entanto, os resultados de estudos in vitro podem não representar plenamente um estudo in vivo e deve ser interpretado com cautela 6.
Counteractive efeito de baixas concentrações de oxigênio em monocamadas de células endoteliais e de permeabilidade microvascular ter sidoestudados por Ogawa 7. Células endoteliais microvasculares cérebro de rato (RBMECs) foram utilizados para desenvolver in vitro a certificação. A privação de oxigênio-glucose e reoxigenação técnica (OGD-R) apresentado neste protocolo foi adaptado de estudos de Zulueta et al e Zhu et al 8,9. Nós expostas células endoteliais cerebrais a OGD-R, colocando-os numa câmara de hipoxia / anoxia contendo 0% de O2, 5% de CO 2 e 95% de N2. As células foram depois avaliadas para alterações na integridade e formação de fibras de stress TJ usando localização imunofluorescência e marcação com rodamina-faloidina respectivamente. Imunofluorescência para zonula occludens-1 (ZO-1) é realizada para determinar a integridade TJ, como ZO-1 é um importante membrana andaimes proteína ligada TJ. Rotulagem rodamina faloidina determina a actina filamentosa (F-actina) no citoesqueleto da célula e é uma clara indicação de formação de fibras de stress de actina em células endoteliais.
<p class = "jove_content"> O objetivo deste método é fornecer uma visão sobre o desenvolvimento de OGD-R como um modelo no IR vitro para estudar a certificação células endoteliais integridade TJ e formação de fibras de stress f-actina. Os resultados irão fornecer informações sobre o destino de proteína TJ, ZO-1 e formação de fibras de stress seguinte OGD-R. Compreender essas relações será uma oportunidade para determinar os mecanismos moleculares subjacentes que são acionados seguintes OGD-R e desenvolver potenciais estratégias terapêuticas para melhorar a interrupção certificação após o tratamento OGD-R.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plantio de células endoteliais
- Obter culturas primárias de RBMEC de adultos a partir de ratos Sprague Dawley (ou obtê-los comercialmente).
- Cultivar RBMECs em 100 centímetros fibronectina (50 ug / ml) placas de petri revestidas usando o cérebro de rato meio de crescimento de células endoteliais. Mudar a forma de dois em dois dias, até que seja atingida a confluência.
- Ao chegar a 80-90% de confluência, lavar suavemente as células em 5 ml de solução salina de fosfato tamponada (PBS), através de agitação. As células são, então, separado por expondo-os a um ml de solução quente de 0,25% tripsina ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), equilibrado a 37 ° C.
- Incubar as células a 37 ° C durante 2-5 min, até que as células são separadas e dispersas.
NOTA: Toque na placa de cultura para separar as células. Ver as células ao microscópio para confirmar a separação completa de células da superfície do prato. - Adicionar 5 ml de meios completo numa placa de Petri a fim de neutralizar a tripsina.Pipeta o meio contendo células destacadas e recolhê-la para um tubo de centrífuga de 15 ml. .
- Centrifuga-se o meio contendo as células endoteliais a 220 xg durante 5 min.
- Aspirar o sobrenadante e preservar o pellet contendo cells.Suspend o sedimento em 3-5 ml fresco cérebro de rato meio de crescimento de células endoteliais por misturando suavemente para cima e para baixo com células pipeta será, em seguida, ser contados utilizando um contador de células automatizado ou um hemocitômetro.
- Transferir a suspensão de células em fibronectina (50 ug / ml) pré-revestidas 8 sistema corrediça câmara bem estéril, 0,7 cm2 / poço com uma densidade de sementeira variando entre 10.000-15.000 células por poço. Crescer as células a 37 ° C até confluência é conseguido
NOTA: Para a realização de transferências de Western ou outros ensaios, as células podem ser cultivadas em placas de 10 cm de cultura de células ou pratos especiais como exigido pela experiência.
2. oxigênio e glicose Privação-reoxigenação In VitroModelo
NOTA: O protocolo a seguir foi adaptado de Zulueta et al. 1997; H Zhu et ai. 2012 8,9.
- Utilizar a hipóxia sistema de cultura celular para estudar os efeitos da de OGD-R em RBMECs (ver Figura 1). Configuração e calibração do sistema de cultura celular hipoxia antes de começar a experiência, de acordo com as instruções do fabricante.
- Retirar as lâminas de câmara confluente (passo 1.8) a partir do 37 ° C incubadora. Substituir o meio completo na corrediça câmara com desoxigenado, não glicose, Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) e colocados em câmara de hipoxia de 95%, N 2 e CO 2 a 5% durante 2 h a 37 ° C, para representar OGD condição.
- Mover as células de volta para a incubadora com 95% de O2, 5% de CO2 a 37 ° C e fornecidas com células endoteliais do cérebro de rato meio completo fresco e incuba-se durante mais 1 h a 37 ° C.
NOTA: Este passo representa uma situação reoxigenação. - Use os slides câmara para localização de imunofluorescência e rotulagem rhodamine phalloidin (ver secção 3).
3. Localização por imunofluorescência de ZO-1 e F-actina Etiquetagem Usando rodamina faloidina
- Expor as lâminas de câmaras contendo as monocamadas RBMEC a 100 ul de meio Opti-MEM / soro reduzida / poço durante 1 h. Lavam-se as lâminas de câmara 3 vezes em 100 ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,0-7,2).
- Fixar as células utilizando 100 uL de paraformaldeído a 4% em PBS (pH 7,0-7,2) durante 15 minutos e lava-se as lâminas de câmara por mais 3 vezes em PBS (pH 7,0-7,2).
- Permeabilizar as células utilizando 100 ul de 0,5% de Triton X-100 em PBS, (pH 7,0-7,2) durante mais 15 min. Bloquear com 100 ul de 2% de albumina de soro bovino (BSA) em PBS durante uma hora. Após este passo, quer células mancha / etiqueta quer para ZO-1 ou f- actina.
- Para imunofluorescência staining incubar as células com um anticorpo anti-coelho primário contra ZO-1 em 1: 150, preparado em 2% de BSA-PBS, durante O / N a 4 ° C. Lavam-se as células três vezes em PBS, (pH 7,0-7,2). Incubar com 100 ul de fluoresceína isotiocianato (FITC) tagged anticorpo secundário anti-coelho durante 1 h à TA.
- Para a etiquetagem Rodamina Faloidina, seguindo bloqueio, expor as células a 100 ul de rodamina faloidina na diluição 1:50, preparado em 2% de BSA-PBS, durante 20 min.
- Lavam-se as células de coloração por imunofluorescência e rodamina faloidina rotulagem em PBS, (pH 7,0-7,2). Monte as câmaras que usam meios de montagem contendo reagente anti-fade com DAPI.
- Visualizar as células utilizando uma lente de imersão em água e X 60 células são digitalizadas num plano óptico sob um microscópio confocal.
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Representative Results
Células cultivadas em pré-revestidas fibronectina lâminas de câmara Nunc II foram submetidos a OGD-R, colocando em um modelo de 110 câmara Biospherix ProOx. Após sujeitar as células a OGD-R, que foram processados para ZO-1 coloração juncional utilizando a técnica de imunofluorescência, conforme mostrado na Figura 2 e montagem do citoesqueleto indicando a formação de fibras de stress de actina F usando etiqueta mancha rodamina faloidina como mostrado na Figura 3. As células de controlo que eram não submetido a OGD-R mostrou integridade juncional contínua enquanto que as células endoteliais sujeitos a OGD-R mostrou junções descontínuas, que indica a perda de integridade TJ Figura 2. As células de controlo que não foram sujeitos a tratamento OGD-R não mostrou nenhuma ou mínima f fibra de stress -actina formação, enquanto as células endoteliais sujeitos a OGD-R f demonstrou formação de fibras de stress -actina aumento indicando as alterações no citoesqueleto de actina de montagem na figura 3; Rep rint com permissão de Referência # 13
Figura 1. Configuração Típica do Modelo Hypoxia Sistema ProOx 110. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Imunofluorescência Localização dos apertado Protein Junction (TJP) ZO-1 Demonstrando rompimento da junções apertadas seguintes OGD-R em RBMECs, como mostrado por setas brancas. Barra de escala = 10 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Rhodamine Phalloidin Labeling para f a formação da fibra estresse actina Demonstrando Mudanças na Assembleia Citoesqueletal Seguindo OGD-R em RBMECs, como mostrado por setas brancas. Barra de escala = 10 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
OGD-R como um modelo in vitro para a lesão de isquemia-reperfusão tem sido bem estabelecido para o estudo de neurónios 10,11. Existem também estudos que mostram o efeito de OGD em células endoteliais cerebrais e alterações na permeabilidade e TJ integridade 9. No entanto, o nosso estudo mostra o efeito de OGD, bem como reoxigenação, que é uma representação mais próxima da lesão de reperfusão isquémica em condições in vivo que ocorrem após acidente vascular cerebral isquémico.
Condições de hipóxico-isquémico são conhecidos para induzir a inflamação no sistema nervoso central, levando a bbb por ruptura aumentando a permeabilidade paracelular e edema vasogénico 4. A lesão de reperfusão é um processo muito complexo e dinâmico, em que há produção de espécies reactivas de oxigénio excessiva, depleção de ATP, subir em potássio extracelular, a libertação de neurotransmissores excitatórios, endoteliais e edema neuronal, a activação de células imunitárias. Este, por sua vez, causes activação de várias vias inflamatórias, levando à produção de citocina, a indução de nucleases e proteases, que conduz ao edema, todos os quais são mostrados para activar diferentes caspases, que conduz à ruptura da integridade da BHE 5,12. As células endoteliais são particularmente propenso à lesão isquémica, devido à presença de grande número de mitocôndrias. As células endoteliais vizinhas estão ligadas uma à outra por junções apertadas mantidos por proteínas de junções apertadas.
ZO-1 é mostrado desempenhar um papel importante na manutenção da integridade TJ pela sua interacção com outras proteínas de junção e apertado a montagem do citoesqueleto de actina. Além disso, a regulação precisa da actina do citoesqueleto é essencial para muitos processos fisiológicos, incluindo desenvolvimento e adesões célula-célula. Em células endoteliais, a formação de fibras de stress de actina se encontra a ser associado com uma disfunção da barreira e a hiperpermeabilidade 13,14. Rhodamine phalloidin técnica de marcação utilizado no presente estudo para observar a formação de fibras de stress de actina F é um estudo de ponto final. No entanto, imagens dinâmicas e ao vivo da formação de fibras de stress também pode ser realizado como mostrado por Doggett e Breslin 15.
O estudo atual majorly enfatiza a contribuição de ZO-1 para a certificação da integridade junção apertado. No entanto, outras moléculas de junção apertados como claudina-5, ocludina, moléculas de adesão de junção (JAM), etc, podem também ser utilizados como marcadores para estudar a certificação integridade junção apertado seguinte OGD-R. Neste estudo, utilizou-localização de imunofluorescência e marcação F-actina como uma técnica qualitativo para determinar a integridade de junção estanque. No entanto, também podemos estudar as outras características importantes da certificação como medição quantitativa de permeabilidade utilizando marcadores fluorescentes e resistência elétrica transendotelial (TEER).
A técnica OGD-R apresentada neste estudo, utilizando oBiospherix sistema só pode ser utilizado para estudos de hipoxia / anoxia, a uma concentração fixa de oxigénio; no entanto, não podemos utilizar este sistema para estudar o efeito de variar as concentrações de oxigénio nas células endoteliais. Para estudar os efeitos de várias concentrações de oxigénio nas células endoteliais é preciso empregar outros modelos disponíveis adequados para o efeito.
Esta técnica pode ser utilizada para estudar as relações entre as várias mecanicistas eventos celulares e moleculares que regulam a certificação hiperpermeabilidade e integridade TJ. Compreendê-los irá fornecer uma visão para o desenvolvimento de várias estratégias moleculares para atenuar a certificação ruptura e permeabilidade microvascular.
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Acknowledgments
Reconhecemos Scott and White Hospital Auxílio à Pesquisa Programa de apoio financeiro e Texas A & M Health Science Center College of Medicine Laboratório Integrado Imaging para o uso do microscópio confocal a laser. Reconhecemos o Sr. Glen Cryer para obter ajuda com a edição do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Proox model 110 | Biospherix | Model 110 | |
| DMEM, no glucose | Gibco, Life technologies | 11966-025 | |
| Rhodamine Phalloidin | Life technologies | R415 | |
| ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody | Life technologies | 617300 | |
| Nunc Lab Tek II-CC 8 well sterile, glass slides | Thermo scientific | 177402 | |
| FITC-tagged anti-rabbit secondary antibody | Santa cruz | sc-2090 | |
| DPBS 1X | Thermo scientific | SH 30028.03 | Any other PBS available can be used |
References
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J.
- Yang, X., et al. Lycium barbarum polysaccharides reduce intestinal ischemia/reperfusion injuries in rats. Chem Biol Interact. 204 (3), 166-172 (2013).
- Kaur, C., Ling, E. A.
- Khatri, R., McKinney, A. M., Swenson, B., Janardhan, V. Blood-brain barrier, reperfusion injury, and hemorrhagic transformation in acute ischemic stroke. Neurology. 79 Suppl 1. (13), S52-S57 (2012).
- Hossmann, K. A. Experimental models for the investigation of brain ischemia. Cardiovasc Res. 39, 106-120 (1998).
- Ogawa, S., Gerlach, H., Esposito, C., Pasagian-Macaulay, A., Brett, J., Stern, D. Hypoxia modulates the barrier and coagulant function of cultured bovineendothelium. Increased monolayer permeability and induction of procoagulant properties. J Clin Invest. 85 (4), 1090-108 (1990).
- Zulueta, J. J., Sawhney, R., Yu, F. S., Cote, C. C., Hassoun, P. M. Intracellular generation of reactive oxygen species in endothelial cellsexposed to anoxia-reoxygenation. Am J Physiol. 272 (5 Pt 1), L897-L902 (1997).
- Zhu, H., et al. Baicalin reduces the permeability of the blood-brain barrier during hypoxia in vitro by increasing the expression of tight junction proteins in brain microvascular endothelial cells. J Ethnopharmacol. 141 (2), 714-720 (2012).
- Abramov, A. Y., Scorziello, A., Duchen, M. R. Three distinct mechanisms generate oxygen free radicals in neurons and contribute to cell death during anoxia and reoxygenation. J Neurosci. 27 (5), 1129-1138 (2007).
- Gundimeda, U., et al. Green tea polyphenols precondition against cell death induced by oxygen-glucose deprivation via stimulation of laminin receptor, generation of reactive oxygen species, and activation of protein kinase Cepsilon. J Biol Chem. 287 (41), 34694-34708 (2012).
- Mehta, S. L., Manhas, N., Raghubir, R. Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics. Brain Res Rev. 54 (1), 34-66 (2007).
- Alluri, H., et al. Reactive Oxygen Species-Caspase-3 Relationship in Mediating Blood-Brain Barrier Endothelial Cell Hyperpermeability Following Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation. Microcirculation. 21 (2), 187-195 (1111).
- Sun, H., Breslin, J. W., Zhu, J., Yuan, S. Y., Wu, M. H. Rho and ROCK signaling in VEGF-induced microvascular endothelial hyperpermeability. Microcirculation. 13 (3), 237-247 (2006).
- Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP actin. J Vis Exp. (57), (2011).
