Abstract
Ischemie-reperfusie (IR) letsel is bekend dat het een belangrijke bijdrage leveren aan de morbiditeit en mortaliteit geassocieerd met ischemische beroerte. Ischemische cerebrovasculaire accidenten zijn goed voor 80% van alle beroertes. Een veelvoorkomende oorzaak van IR schade is de snelle instroming van fluïda na een acute / chronische occlusie van bloed, voedingsstoffen, zuurstof aan het weefsel triggering de vorming van vrije radicalen.
Ischemische beroerte wordt gevolgd door de bloed-hersenbarrière (BBB) dysfunctie en vasogeen hersenoedeem. Structureel tight junctions (TJS) tussen de endotheelcellen spelen een belangrijke rol bij het handhaven van de integriteit van de bloed-hersenbarrière (BBB). IR letsel is een vroege secondaire verwonding leidt tot een niet-specifieke, inflammatoire reactie. Oxidatieve en metabole stress na ontsteking veroorzaakt secundaire hersenschade waaronder BBB permeabiliteit en verstoring van de tight junction (TJ) integriteit.
Ons protocol presenteert een in vitro </ Em> voorbeeld van zuurstof-glucose deprivatie en reoxygenatie (OGD-R) op de hersenen van de rat endotheelcellen TJ integriteit en de vorming van stress vezels. Tegenwoordig worden meerdere in vivo experimentele modellen worden gebruikt om de effecten van IR letsel te onderzoeken; maar ze hebben verschillende beperkingen, zoals de technische problemen bij het uitvoeren van operaties, gen afhankelijke moleculaire invloeden en moeilijkheden bij het bestuderen mechanistische relaties. Toch kan in vitro modellen helpen overwinnen veel van deze beperkingen. Het gepresenteerde protocol kan worden gebruikt om de verschillende moleculaire mechanismen en mechanistische relaties bestuderen potentiële therapeutische strategieën. Echter, de resultaten van in vitro studies verschillen van de standaard in vivo studies en moeten met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd.
Introduction
Ischemie-reperfusie (IR) schade blijkt de frequente oorzaak van verschillende verzwakkende complicaties en sterfte geassocieerd met beroerte, myocardiaal infarct, trauma, perifere vaatziekte en hersentrauma 1,2 zijn. IR letsel in hersenvaten is een vroege secundaire verwonding leidt tot ontsteking en oedeem 3. Eén van de ernstige complicaties die optreedt als gevolg van oxidatieve en metabole stress na ontsteking verlies van homeostatische balans wat leidt tot vorming van vrije radicalen, veranderingen in de bloed-hersenbarrière (BBB) tight junctions (TJS) en microvasculaire permeabiliteit 4,5.
Momenteel in vivo modellen gebruikt om de effecten van IR schade aan de BBB studie omvatten middelste cerebrale arterie occlusie (MCAO), micro-embolie, en transgene en knockout dieren. Echter, elk heeft zijn nadelen en beperkingen zoals besproken door Hossmann 6. MCAO model wordt gebruikt om de effec bestuderents van redox stress, veranderingen in junctionele mededelingen van de BBB en de interacties tussen de hersenen en immuuncellen. Echter, presenteren zij diverse technische uitdagingen zoals de noodzaak voor nauwkeurige microchirurgische procedures en de moeilijkheden daarin. Micro-embolie breekt ogenblikkelijk beneden de BBB, terwijl het gebruik van transgene of knockout dieren cerebrale ischemie studeren uitdagingen zoals gen-afhankelijke moleculaire invloeden op infarct vorming, veranderingen in vasculaire anatomie en wisselende lichaamsgewicht 6 kunnen hebben. Vandaar dat in vitro modellen van ischémie gevonden toenemende belangstelling laatste tijd voornamelijk vanwege hun toepasbaarheid bij het uitvoeren mechanistische studies drugs. Echter, de resultaten van in vitro studies kunnen niet volledig een in vivo onderzoek vertegenwoordigen en moeten met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd 6.
Tegenwerkende effect van lage zuurstofconcentraties op endotheliale celmonolagen en microvasculaire doorlaatbaarheid geweestbestudeerd door Ogawa 7. Rattenhersenen microvasculaire endotheelcellen (RBMECs) werden gebruikt om de in vitro BBB ontwikkelen. De zuurstof-glucose deprivatie en reoxygenatie (OGD-R) techniek in dit protocol is aangepast van studies van Zulueta et al en Zhu et al 8,9. We blootgestelde hersenen endotheelcellen OGD-R door ze in een hypoxia / anoxia cupje met 0% O2, 5% CO2 en 95% N2. De cellen werden later onderzocht op veranderingen in TJ integriteit en stress vezelvorming middels respectievelijk immunofluorescentie lokalisatie en rhodamine phalloidin labeling. Immunofluorescentie kleuring voor zonula-occludens 1 (ZO-1) wordt uitgevoerd TJ integriteit te geven, aangezien ZO-1 is een belangrijke scaffolding membraangebonden TJ eiwit. Rhodamine Phalloidin labeling bepaalt de filamenteus actine (F-actine) in de cel cytoskelet en is een duidelijke indicatie van actine spanning vezelvorming in endotheelcellen.
<p class = "jove_content"> Het doel van deze methode is om inzicht te geven in de ontwikkeling van OGD-R als een in vitro IR model voor het bestuderen van BBB endotheelcellen TJ integriteit en f-actine stress-fiber vorming. De resultaten zullen informatie verschaffen over het lot van TJ eiwit, ZO-1 en stress fiber vorming na OGD-R. Inzicht in deze relaties gelegenheid om de onderliggende moleculaire mechanismen die in werking treden na OGD-R te bepalen en potentiële therapeutische strategieën om de verstoring BBB volgende OGD-R behandeling te bevorderen ontwikkelen.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Het zaaien van endotheelcellen
- Verkrijgen van primaire kweken van RBMEC's uit volwassen Sprague Dawley ratten (of in de handel te verkrijgen hen).
- Ontwikkel RBMECs in 100 cm fibronectine (50 ug / ml) beklede petrischaaltjes met ratten hersenen endotheelcel medium. Verander het medium elke twee dagen tot confluentie bereikt.
- Bij het bereiken van 80-90% confluentie voorzichtig wassen van de cellen in 5 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) door zwenken. De cellen worden vervolgens losgemaakt door ze bloot te stellen aan 1 ml van 0,25% trypsine warme ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) -oplossing, geëquilibreerd tot 37 ° C.
- Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 2-5 minuten totdat de cellen losgemaakt en verspreid.
OPMERKING: Tik op de cultuur schotel naar de cellen los. Uitzicht cellen onder de microscoop om volledige loslating van cellen bevestigen van het oppervlak van de schaal. - Voeg 5 ml compleet medium aan de petrischaal om trypsine te neutraliseren.Pipetteer het medium dat losgemaakte cellen en het verzamelen in een 15 ml centrifugebuis. .
- Centrifugeer het medium dat endotheelcellen bij 220 xg gedurende 5 minuten.
- Zuig het supernatant en het behoud van de pellet met cells.Suspend de pellet in 3-5 ml vers rattenhersenen groei endotheelcellen medium door voorzichtig te mengen op en neer met pipet cellen worden vervolgens geteld met behulp van geautomatiseerde cel balie of een hemocytometer.
- Breng de celsuspensie in fibronectine (50 ug / ml) vooraf beklede steriele kamer 8 en geleidingssysteem, 0,7 cm 2 / putje met een zaaidichtheid varieert tussen 10.000-15.000 cellen per putje. Groeien de cellen bij 37 ° C tot confluentie bereikt
Opmerking: Voor het uitvoeren van Western blots of andere experimenten kunnen cellen worden gekweekt in 10 cm celcultuurschalen of speciale gerechten zoals vereist door het experiment.
2. Zuurstof en glucose beroving-reoxygenation In VitroModel
OPMERKING: De volgende protocol is aangepast van Zulueta et al. 1997; Zhu H et al. 2012 8,9.
- Gebruik de hypoxia celcultuur systeem om de effecten van van OGD-R RBMECs in (zie figuur 1) te bestuderen. Instelling en kalibreer de hypoxia cel kweeksysteem voor aanvang van de proef, volgens de instructies van de fabrikant.
- Verwijder de confluente kamer slides (stap 1,8) vanaf de 37 ° C incubator. Vervang het volledige medium in de kamer dia met gedeoxygeneerd, zonder glucose Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) en geplaatst in hypoxie kamer met 95% N2 en 5% CO2 gedurende 2 uur bij 37 ° C, bij OGD toestand wordt nagebootst.
- Beweeg de cellen terug naar de incubator met 95% O2, 5% CO2 bij 37 ° C en voorzien van verse rattenhersenen endotheelcellen volledig medium en incubeer gedurende nog 1 uur bij 37 ° C.
OPMERKING: Deze stap betekent een reoxygenatie situatie. - Gebruik de kamer dia's voor immunofluorescentie lokalisatie en rhodamine phalloidin etikettering (zie paragraaf 3).
3. Immunofluorescentie lokalisatie van ZO-1 en F-actine Labeling behulp Rhodamine Phalloidin
- Expose de kamer slides met RBMEC monolagen tot 100 pi Opti-MEM / verminderde serum media / goed voor 1 uur. Was de kamer slides 3 maal in 100 ui met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,0-7,2).
- Fixeer de cellen met 100 pi 4% paraformaldehyde in PBS (pH 7,0-7,2) gedurende 15 min en de kamer objectglaasjes wassen 3 keer in PBS (pH 7,0-7,2).
- Permeabilize de cellen met 100 pl 0,5% Triton X-100 in PBS (pH 7,0-7,2) voor nog eens 15 min. Blokkeer met 100 gl 2% runderserumalbumine (BSA) in PBS gedurende een uur. Na deze stap ofwel vlek / label cellen hetzij voor ZO-1 of f- actine.
- Voor immunofluorescentie staining incuberen van de cellen met anti-konijnen primair antilichaam tegen ZO-1 in 1: 150, bereid in 2% BSA-PBS O / N bij 4 ° C. Was de cellen 3 keer in PBS (pH 7,0-7,2). Incubeer met 100 pl fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) gemerkte anti-konijn secundair antilichaam gedurende 1 uur bij KT.
- Voor Rhodamine Phalloidin labeling, na blokkering, blootstellen van de cellen aan 100 gl rhodamine phalloidin in 1:50 verdunning bereid in 2% BSA-PBS, gedurende 20 min.
- Was de cellen van immunofluorescentie kleuring en rhodamine phalloidin labeling in PBS (pH 7,0-7,2). Monteer de kamers met behulp van montage media met anti-fade reagens met DAPI.
- Visualiseren cellen met behulp van een 60 X water immersie objectief en cellen worden gescand in een enkel optisch vlak onder een confocale microscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cellen gekweekt op fibronectine voorbeklede Nunc II kamer dia's werden OGD-R onderworpen door het plaatsen in een Biospherix ProOx model 110 kamer. Na het onderwerpen van cellen aan OGD-R, werden ze bewerkt voor ZO-1 junctionele kleuring middels immunofluorescentie techniek zoals getoond in figuur 2 en cytoskelet samenstel aangeven F-actine vorming stress-vezels gebruikt rhodamine label phalloidin vlek zoals in figuur 3. Controle cellen die waren niet onderworpen aan OGD-R toonde voortdurende junctionele integriteit terwijl endotheelcellen blootgesteld aan OGD-R vertoonden discontinue kruispunten, wat aangeeft verlies van TJ integriteit figuur 2. controle cellen die niet werden onderworpen aan OGD-R behandeling toonde geen of minimale f-actine stress-vezels vorming terwijl endotheelcellen blootgesteld aan OGD-R aangetoond van f-actine stress-vezels vormen waarin de veranderingen in het actine cytoskelet samenstel Figuur 3; Rep rint met toestemming van Reference # 13
Figuur 1. Typische Configuratie van de Hypoxie System ProOx Model 110. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Immunofluorescentie lokalisatie van Tight Junction Protein (TJP) ZO-1 Demonstreren Verstoring van de Tight Knooppunten volgende OGD-R in RBMECs, zoals weergegeven door White Arrows. Schaal bar = 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze foto figuur.
Figuur 3. Rhodamine Phalloidin Labeling voor f-actine Stress Fiber Formation Demonstreren Veranderingen in het cytoskelet Assembly Na OGD-R in RBMECs, zoals weergegeven door White Arrows. Schaal bar = 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
OGD-R als een in vitro model voor ischemie-reperfusie schade is goed vastgesteld voor het bestuderen neuronen 10,11. Er zijn ook studies die het effect van OGD op de hersenen endotheelcellen en veranderingen in permeabiliteit en TJ integriteit 9. Echter, onze studie toont het effect van OGD en reoxygenatie, hetgeen nader weergave van ischemische reperfusieschade bij in vivo omstandigheden die na herseninfarct optreden.
Hypoxische-ischemische aandoeningen bekend ontsteking induceren in het centrale zenuwstelsel, wat leidt tot ontwrichting BBB van toenemende paracellulaire permeabiliteit en vasogeen oedeem 4. Reperfusieschade is een zeer complex en dynamisch proces, waarbij er overmatige productie van reactieve zuurstof, ATP depletie, stijging extracellulair kalium, uitzetten van prikkelende neurotransmitters, endotheliale en neuronale zwelling, immuuncelactivatie. Dit, op zijn beurt causes activatie van verschillende ontstekingsreacties, wat leidt tot de productie, inductie van nucleasen en proteasen cytokine, wat leidt tot oedeem, die allemaal aangetoond dat verschillende caspases te activeren, wat leidt tot ontwrichting van de BBB integriteit 5,12. Endotheliale cellen zijn bijzonder gevoelig voor ischemie, door de aanwezigheid van grote aantallen mitochondria. De naburige endotheelcellen zijn met elkaar verbonden door tight junctions onderhouden door tight junction eiwit.
ZO-1 is aangetoond dat het een belangrijke rol speelt bij het handhaven van de integriteit TJ door zijn wisselwerking met andere tight junction eiwitten en het actine cytoskelet montage. Ook, nauwkeurige regeling van actine cytoskelet is essentieel voor veel ontwikkelings- en fysiologische processen, waaronder cel-cel adhesie. In endotheelcellen wordt actine vorming spanning vezel in verband gebracht met barrière disfunctie en hyperpermeabiliteit 13,14. Rhodamine phalloidin labeling techniek die in de onderhavige studie om F-actine stress-vezelvorming observeren een eindpunt studie. Echter, dynamische en live beeldvorming van de formatie spanning vezel worden uitgevoerd zoals getoond door Doggett en Breslin 15.
De huidige studie benadrukt majorly de bijdrage van ZO-1 naar de BBB tight junction integriteit. Echter, andere tight junction moleculen zoals claudin-5, occludin, junctionele adhesiemoleculen (JAM) etc. kunnen ook worden gebruikt als markers voor de BBB tight junction integriteit na OGD-R bestuderen. In deze studie, gebruikten we immunofluorescentie lokalisatie en f-actine labeling als een kwalitatieve techniek om de tight junction integriteit te bepalen. Echter, kunnen we ook de studie van de andere belangrijke kenmerken van de BBB als kwantitatieve meting van de permeabiliteit met fluorescerende stiften en transendotheliale elektrische weerstand (TEER).
De OGD-R-techniek in dit onderzoek met behulp van deBiospherix kan alleen worden gebruikt voor hypoxie / anoxie studie aan een vaste concentratie van zuurstof; we kunnen echter niet het veiligheidssysteem toegepast voor het bestuderen van het effect van variërende concentraties van zuurstof aan endotheelcellen. Voor het bestuderen van de effecten van variërende concentraties van zuurstof aan endotheelcellen moeten we andere beschikbare modellen voor dit doel geschikt te gebruiken.
Deze techniek kan worden gebruikt voor het bestuderen van mechanistische verbanden tussen verschillende cellulaire en moleculaire gebeurtenissen die BBB hyperpermeabiliteit en TJ integriteit regelen. Het begrijpen van hen zal inzicht voor het ontwikkelen van verschillende moleculaire strategieën om BBB verstoring en microvasculaire doorlaatbaarheid verzwakken bieden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
We erkennen Scott en White Ziekenhuis Research Grants Program voor financiële steun en de Texas A & M Health Science Center College of Medicine Geïntegreerde Imaging Laboratorium voor het gebruik van de confocale laser microscoop. Wij erkennen Mr Glen Cryer voor hulp bij manuscript uitgeven.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Proox model 110 | Biospherix | Model 110 | |
| DMEM, no glucose | Gibco, Life technologies | 11966-025 | |
| Rhodamine Phalloidin | Life technologies | R415 | |
| ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody | Life technologies | 617300 | |
| Nunc Lab Tek II-CC 8 well sterile, glass slides | Thermo scientific | 177402 | |
| FITC-tagged anti-rabbit secondary antibody | Santa cruz | sc-2090 | |
| DPBS 1X | Thermo scientific | SH 30028.03 | Any other PBS available can be used |
References
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J.
- Yang, X., et al. Lycium barbarum polysaccharides reduce intestinal ischemia/reperfusion injuries in rats. Chem Biol Interact. 204 (3), 166-172 (2013).
- Kaur, C., Ling, E. A.
- Khatri, R., McKinney, A. M., Swenson, B., Janardhan, V. Blood-brain barrier, reperfusion injury, and hemorrhagic transformation in acute ischemic stroke. Neurology. 79 Suppl 1. (13), S52-S57 (2012).
- Hossmann, K. A. Experimental models for the investigation of brain ischemia. Cardiovasc Res. 39, 106-120 (1998).
- Ogawa, S., Gerlach, H., Esposito, C., Pasagian-Macaulay, A., Brett, J., Stern, D. Hypoxia modulates the barrier and coagulant function of cultured bovineendothelium. Increased monolayer permeability and induction of procoagulant properties. J Clin Invest. 85 (4), 1090-108 (1990).
- Zulueta, J. J., Sawhney, R., Yu, F. S., Cote, C. C., Hassoun, P. M. Intracellular generation of reactive oxygen species in endothelial cellsexposed to anoxia-reoxygenation. Am J Physiol. 272 (5 Pt 1), L897-L902 (1997).
- Zhu, H., et al. Baicalin reduces the permeability of the blood-brain barrier during hypoxia in vitro by increasing the expression of tight junction proteins in brain microvascular endothelial cells. J Ethnopharmacol. 141 (2), 714-720 (2012).
- Abramov, A. Y., Scorziello, A., Duchen, M. R. Three distinct mechanisms generate oxygen free radicals in neurons and contribute to cell death during anoxia and reoxygenation. J Neurosci. 27 (5), 1129-1138 (2007).
- Gundimeda, U., et al. Green tea polyphenols precondition against cell death induced by oxygen-glucose deprivation via stimulation of laminin receptor, generation of reactive oxygen species, and activation of protein kinase Cepsilon. J Biol Chem. 287 (41), 34694-34708 (2012).
- Mehta, S. L., Manhas, N., Raghubir, R. Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics. Brain Res Rev. 54 (1), 34-66 (2007).
- Alluri, H., et al. Reactive Oxygen Species-Caspase-3 Relationship in Mediating Blood-Brain Barrier Endothelial Cell Hyperpermeability Following Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation. Microcirculation. 21 (2), 187-195 (1111).
- Sun, H., Breslin, J. W., Zhu, J., Yuan, S. Y., Wu, M. H. Rho and ROCK signaling in VEGF-induced microvascular endothelial hyperpermeability. Microcirculation. 13 (3), 237-247 (2006).
- Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP actin. J Vis Exp. (57), (2011).
