Abstract
Synthetische materialen zijn bekend aan klinische complicaties zoals ontsteking, vernauwing en infecties teweegbrengen wanneer geïmplanteerd vasculaire substituten. Collageen is uitgebreid gebruikt voor uiteenlopende biomedische toepassingen en als een alternatief voor kunststoffen vanwege de inherente biologische verenigbaarheid (bijv lage antigeniciteit, ontsteking, en cytotoxische responsen). Echter, de beperkte mechanische eigenschappen en de daarmee verband houdende lage hand-vermogen van collageen gels hun gebruik als scaffold materialen voor vasculaire tissue engineering bemoeilijkt. Daarom is de gedachte achter dit werk was de eerste die cellularized collageen gels in een buisvormige-vormige geometrie en tweede werktuigkundige op gladde spiercellen verbeteren gedreven reorganisatie van collageen matrix om weefsels stijf genoeg om te worden behandeld verkrijgen.
De hier beschreven strategie is gebaseerd op de directe montage van collageen en gladde spiercellen (construct) in een 3D-cilndrical geometrie met behulp van een vormgevingstechniek. Dit proces vereist een rijpingsperiode, waarin de constructen worden gekweekt in een bioreactor onder statische condities (zonder aangebrachte externe dynamische mechanische invloeden) gedurende 1 of 2 weken. De "statische bioreactor" biedt een bewaakte en gecontroleerde steriele omgeving (pH, temperatuur, gasuitwisseling, toevoer van voedingsstoffen en afvoer van afval) aan de constructies. Tijdens kweekperiode werden diktemetingen uitgevoerd om de cellen gedreven hermodellering van het collageen matrix evalueren en glucoseconsumptie en lactaatproductie werden gemeten volgen de cellen metabolische activiteit. Tenslotte werden de mechanische en visco-elastische eigenschappen beoordeeld voor de verkregen buisvormige constructen. Daartoe specifieke protocollen en concentratie kennis (manipulatie, grijpen, die in gehydrateerde milieu, etc.) ontwikkeld om het gemanipuleerde weefsel te karakteriseren.
Introduction
Vasculaire tissue engineering voorziet verschillende strategieën gericht op de fabricage van gemanipuleerde schepen, met inbegrip van enten op basis van synthetische steigers, cellaag-gebaseerde-tissue engineered bloedvaten (TEBVs), en de extracellulaire matrix (ECM)-componenten op basis TEBVs. Van deze benaderingen synthetische polymeren vertonen goede mechanische eigenschappen, maar een gemeenschappelijk nadeel als ze niet bioactiviteit 1. De cellaag gebaseerde werkwijze maakt de productie van technisch vasculaire substituten met hoge mechanische eigenschappen, maar de tijd die nodig is om dergelijke transplantaten te produceren ongeveer 28 weken 2. Natuurlijke biopolymeren van de ECM, zoals collageen, elastine, fibrine 3 of een combinatie daarvan, blijft de gouden standaard materialen voor tissue engineering scaffolds. Dit is vooral voor de reden dat deze materialen bezitten in het algemeen een goede biocompatibiliteit terwijl de mogelijkheid om functionele cellulaire responsen induceren 4-5. Onder deze biopolymeers, type I collageen is een van de meest voorkomende en overheersende dragende eiwit van de ECM in vele weefsels zoals huid, bloedvaten en pezen. Uitgebreide werk is uitgevoerd op de mechanische eigenschappen van collageen 6-8, maar er zijn slechts een paar studies over cellulaire verbouwing van collageen gels tijdens de statische rijping geweest. Cellulaire remodeling verwijst naar de structurele modificatie van de collageenmatrix geïnduceerd door cellen die de stabiliteit van de collageenvezels netwerk 9 kunnen beïnvloeden. Als natuurlijke scaffold, relatief grote hoeveelheden type I collageen geïsoleerd, gesteriliseerd en opgeslagen uit verschillende bronnen, zoals de rat-tail pezen 10. Inzicht cellulaire interacties met collageen en de bijbehorende globale mechanische gedrag van de cellularized collageen scaffolds (constructs) is een essentiële stap voor de opbouw van weefsels. Collageen gebaseerde TEBVs kan worden verwerkt door cellen direct mengen met collageentijdens gel voorbereiding en verdere gegoten in specifieke vormen zoals buisvormige en vlakke 11. Vasculaire cellen in de gels vermenigvuldigen en het type renovatie I collageen 12. Aldus is deze werkwijze omzeilt de noodzaak van specifieke macroporositeit dat een van de belangrijke problemen bij de ontwikkeling van scaffolds voor weefselregeneratie toepassingen vertegenwoordigt. De belangrijkste nadelen van collageen gelen zijn hun lage mechanische eigenschappen in vergelijking met synthetische materialen 13.
In deze studie levensvatbaar weefsel met een homogene verdeling van cellen werd ontwikkeld door direct mengen van collageen met cellen in een enkelvoudig proces. "Statische bioreactors" werden gebruikt voor 1 of 2 weken statische rijping van de cellularized collageengels (zonder aangezette externe dynamische mechanische invloeden). Tijdens de kweek, collageen matrix remodeling plaatsgevonden, waardoor structurele versterking aan de constructen. Bovendien zijn deze constructen waren ready worden overgebracht naar een roterende wand bioreactor en een homogene endothelium werd bereikt. Daarnaast is in het onderzoek een specifieke mechanische testprotocol wordt voorgesteld een geschikte nieuwe aanpak te waarborgen bij het karakteriseren van de mechanische eigenschappen van het buisvormige zachte weefsels.
Samenvattend, dit werk presenteert een werkwijze voor de in vitro snelle fabricage en rijping van vasculaire weefsels die sterk genoeg te behandelen niet alleen biologische en mechanische karakteristieken, maar ook voor verdere mechanische conditionering in een dynamische bioreactor, die als cruciaal zijn stap in de regeneratie van weefsels.
Protocol
1. fabricage en assemblage van de statische Bioreactor
- Fabricage van de Reservoir
- Bereid 50 ml centrifugebuizen als kweekmedium reservoir voor de bioreactor.
- Maak twee poorten door het boren van twee 5 mm diameter gaten 20 mm van de onderkant en de bovenkant van het reservoir resp. Steek vervolgens twee luer fittings in 5 mm lengte siliconen buizen. Press-fit deze luer fittings door de gaten, en sluit alle verbindingen met medische siliconen lijm.
- Plaats een 0,22 urn filter in de bovenopening van het reservoir (figuur 1A).
- Plaats een luer septum in de onderste poort van het reservoir (Figuur 1A).
- Doorn-cap Assembly
- Boor een 4,5 mm diameter opening in het midden van de geventileerde dop van het reservoir buis zonder de filter membraan dat het beluchten gaten bedekt.
- Bereid een roerstaafje (diameter = 4,5 mm, lengte = 100 mm) Als een doorn voor het construct.
- Bereid twee silicone conische stoppers (lengte = 10 mm, diameter middelste gat = 4,5 mm).
- Monteer de doorn en de kap (as-cap complex) op de in figuur 1B.
- Press-fit de doorn in het gat. Plaats de 2 stoppers over de doorn zodat de dop is aangebracht tussen hen. Pas de positie van de doorn zodat de nuttige lengte is 78 mm.
- Breng een primer en vervolgens medische kwaliteit siliconen lijm op de oppervlakken die in contact zal komen voordat hij de dop en de siliconen conische stoppers samen. Verwijder de overtollige lijm op de dop.
- Laten drogen bij kamertemperatuur gedurende 1-3 dagen.
- Fabricage van de gaas-handgrepen
- Bereid 3 siliconen buizen (buis 1: inwendige diameter = 6,4 mm, lengte = 5 mm; buis 2: diameter = 6,4 mm, lengte = 10 mm en buis 3: diameter = 3,1 mm, lengte = 12 mm).
- Monteer het gaas-handgrepen als beschrijvend in figuur 1C.
- Cut buis 1 in de lengte, en open het dan buis 2. Plak ze samen met de silicone lijm.
- Knip steriele chirurgische gaas tot 5 cm x 7 cm vel en rol vervolgens strak het gaas over de buis 3 langs de langste zijde van het gaas. Plaats de buis 1-tube 2 complex op het gaas.
- Toevoegen siliconenlijm bij elkaar blijven het gaas, de buis 1-tube 2 complex en de buis 3. Snijd het gaas over een lengte van 8 mm.
- Montage en Sterilisatie
- Monteer de doorn-cap complex en het gaas-handgrepen op de in figuur 2.
- Coat de doorn met medische kwaliteit vet (Figuur 2A). Plaats de gaas-handgrepen over de doorn (Figuur 2B). Afstand van de grepen vaste waarde van 35 mm van elkaar.
- Bereid een buisvormige vorm door het verwijderen van het onderste gedeelte van een 10 ml spuit met een tafelzaag (uiteindelijke lengte = 8 mm) (
- Plaats de mal over de gaas grepen uitgeruste doorn-cap assemblage (huisvesting-schimmel complex), snap-aanbrengen van de schimmel op de silicone stopper (figuur 2C).
- Autoclaaf het reservoir en de behuizing-mal complex.
Opmerking: Wees voorzichtig om strak te houden op de siliconen stop bij het plaatsen van de mal om zijn onthechting te voorkomen.
- Monteer de doorn-cap complex en het gaas-handgrepen op de in figuur 2.
2. Techniek van gladde spiercellen Collageen gel-gebaseerde constructen en statische rijping
- Constructs
- Vouw varkens aorta gladde spiercellen (pSMCs) in 175 cm 2 kolven gevuld met 20 ml compleet cultuurmedium, bestaande uit Dulbecco's gemodificeerd Eagle Medium aangevuld met 10% (v / v) porcine serum (PS), 10% (v / v ) foetaal runderserum (FBS), 1% (v / v) penicilline-streptomycine (pen-strep).
- Bij ≈90% samenvloeiing, los pSMCs (passage 2-4) door het verwijderen van het kweekmedium van defles pSMCs, het toevoegen van 5 ml trypsine-oplossing (1 x in met fosfaat gebufferde zoutoplossing, PBS), en incubatie gedurende 10 min (t = 37 ° C, 5% CO2, 100% vochtigheid).
- Resuspendeer de pSMCs bij een concentratie van 4 x 10 6 cellen / ml in compleet cultuurmedium.
- Bereid collageenoplossing zoals eerder beschreven 10.
- Extract en het verzamelen van collageen bundels van rat-staart pezen in een PBS-oplossing.
- Breng de collageenvezels vervolgens in aceton (5 min), 70% isopropanol (v / v) (5 min) en azijnzuur (0,02 N, 48 uur, 4 ° C) oplossing.
- Meng de viskeuze oplossing en bevriezen bij -20 ° C gedurende 3 dagen.
- Lyofiliseren van de bevroren oplossing collageensponzen verkrijgen.
- Oplosbaar collageen sponzen in azijn- zuuroplossing (0,02 N) bij een concentratie van 4 g / l en centrifugeer bij 29.581 g gedurende 45 minuten werking.
- Steriliseer het collageen oplossing door dialyse proces tegen de daaropvolgende solutions azijnzuur (0,02 N, 1 uur), chloroform 1% (v / v, 1 uur) en azijnzuur (0,02 N, steriele oplossing veranderde elke 2 dagen 1 week).
- Verzamel de steriele collageenoplossing (4 g / l) in een steriele celkweek kap.
- Bereid cellularized collageen gels zoals getoond in figuur 3.
- Bereid 50 ml steriele bufferoplossing door het mengen van 35 ml DMEM (5x), 4 ml HEPES (1 N), 3 ml NaOH (1 N) in 8 ml steriel gedeïoniseerd water.
- Bereid cellen en collageen gel mengsel in een container geplaatst in ijs door 50% (v / v) steriele collageenoplossing (4 g / l azijnzuur 0,02 N) bij 25% (v / v) bufferoplossing en 25% (v / v) van de suspensie van pSMCs in volledige cultuurmedium.
- Meet de pH van het mengsel en zorgen dat het tussen 7,0 en 7,4.
- Giet langzaam 9 ml-cellen en collageen mengsel in bovengenoemde behuizing / matrijs complex (stap 1.4.3, figuur 3A-B
- Laat het gel bij kamertemperatuur gedurende 1 uur onder celcultuur kap (figuur 3B).
- Rijping in Statische Bioreactor
- Verwijder de mal (figuur 3C) en breng voorzichtig het construct in het reservoir, die 35 ml kweekmedium (Figuur 3D).
- Incubeer de construct (T = 37 ° C, 5% CO2, 100% vochtigheid) in verticale positie 1 of 2 weken statische rijping.
- Installeer een webcam (verzegeld teneinde isolatie te waarborgen) in de incubator voor het construct.
- Verander het kweekmedium om de 2 dagen door afzuigen het oude medium uit de luer poort septum en opnieuw vullen van het reservoir met een equivalente hoeveelheid vers kweekmedium.
- Diktemeting en metabole activiteit van SMC-collageen gel-gebaseerde constructen Tijdens statische kweek
- Plaats de scanning laser interferometer in de cel culture motorkap en spiegelen van de verticale naar de horizontale positie met behulp van een waterpas.
- Breng de bioreactor in de celcultuur motorkap en verwijder de constructie van het reservoir.
- Breng de construct (nog steeds gemonteerd op de as) in het pad van de laserbundel, en plaats deze strikt orthogonaal ten opzichte van de bundelas (zie figuur 4).
- Lees de waarde op het scherm van de scanning laser interferometer, die overeenkomt met de buitendiameter van het construct.
- Bereken de wanddikte van het construct op basis van de uitwendige en inwendige diameter (de doorn diameter).
Opmerking: Herhaal de stappen 2.3.1 tot 2.3.5 elk uur voor de eerste 12 uur en vervolgens elke 24 uur. - Met 1 ml van het oude kweekmedium (gesampled bij het veranderen van kweekmedium, stap 2.2.4) voor het meten van lactaat en glucose concentraties met bloedgasanalysator.
- Met 1 ml van devers kweekmedium als een basisniveau voor de glucose en lactaat concentraties metingen 14.
Opmerking: Herhaal de stappen 2.3.6 en 2.3.7 om de 2 dagen na kweekmedium veranderen.
- Construct Oogsten voor verdere mechanische en biologische Ccharacterizations
- Na 1 of 2 weken van statische rijpingsperiode, breng de statische bioreactor in de celkweek kap.
- Breng voorzichtig de rijpe construct van de doorn (Supplemental Video 1) tot 100 mm diameter petrischaal met 40 ml vers kweekmedium (figuur 5 en figuur 7A).
3. mechanische karakterisatie van de constructen in de Longitudinal en Omtrekafname Routebeschrijving
- Installeer de experimentele opstelling bestaande uit de micromechanische tester uitgerust met een 5 of 10 N laadcel en een bad met PBS bij 37 ° C aan de monsters een levensonderhoudt pseudo-fysiologische omstandigheden (figuur 6).
- De balans van de load cell en de extensometer.
Opmerking: Balancing is een functie geïntegreerd in de micromechanische tester bestaat in het resetten van de weergegeven extensie waarde en de weergegeven lading waarde, terwijl er geen monster op de machine is gemonteerd. Deze functie maakt het definiëren van de referentie voor beide metingen. - Montage van de buisvormige constructies op de mechanische apparaten: lengterichting.
Opmerking: Voer longitudinale vermoeiingstesten rechtstreeks op het gehele buisvormige constructies. Gebruik in-house gebouwde grijpinrichtingen het gaas greep van de constructen te sluiten op de meetcel en de bodem van het bad PBS.- Monteer de buis te bouwen op de aangrijpende apparaten (Figuur 7B), na het oogsten procedure (paragraaf 2.4).
- Wikkel de grijpinrichtingen en het gaas grepen met teflon band tijdens de test te voorkomen dat slippen van het gaas handgrepen.Monteer het monster op de micromechanische tester (figuur 7C).
- Montage van de ringvormige constructen op de mechanische inrichting: omtreksrichting.
Opmerking: Voer omtrek vermoeiingstesten op ringvormige exemplaren doorsnede van de buisvormige constructies. Gebruik twee roestvrij stalen staven als grepen om de monsters te houden.- Monteer de buis te bouwen op een plastic buis als steun gemarkeerd met 5 mm gaten (Figuur 7B), na het oogsten (paragraaf 2.4).
- Snijd 10 mm ringen van de buisvormige constructie.
- Meet de lengte van het monster met behulp van een schuifmaat voor verdere analyse.
- Monteer de ringvormige exemplaar op de roestvrij stalen staven van de micromechanische tester (figuur 7C). Zorg ervoor dat het monster in het middelpunt van de bars.
Opmerking: De kunststof pijp in stap 3.4.1 en snijsysteem zoals getoond in figuur 7B
- Fatigue test constructen in de lengterichting en omtreksrichting.
- Strek het construct naar de oorspronkelijke meetlengte.
- Handhaving van het construct in deze positie gedurende 10 min in pseudo-fysiologische omgeving.
- Breng 10% cyclische spanning van de eerste meter lengte (30 cycli) naar het construct bij 5% / sec reksnelheid.
- Herhaal stap 3.5.3 in stapjes van 10% cyclische belasting tot falen van het monster.
Opmerking: het gebruik van de pseudo-fysiologische omgeving nodig gezien de drijfvermogen en de traagheid van de grijpende systeem dat het meten van de uitgeoefende belasting beïnvloeden. - Noteer de achtergrond als volgt:
- Beweeg de belasting kader om de eerste meter lengte.
- Herhaal de stappen 3.5.3 en 3.5.4, zonder een monster gemonteerd, en het houden van de aangrijpende apparaten die op de load cell (slechts 1 cyclus is requirood).
4. Luminal endothelialisatie van Constructs
Opmerking: Nadat na het oogsten protocol (paragraaf 2.4), de constructen weerstaan behandeling in de roterende wand bioreactor voor de verdere endotheel te monteren.
- Roterende-wall Bioreactor Ontwerp
- Boor een 4,5 mm diameter opening in het midden van de geventileerde dop van het reservoir buis zonder de filter membraan dat het beluchten gaten bedekt.
- Press-fit een doorn (diameter = 4,5 mm, lengte = 40 mm) in het gat en bevestig de doorn zoals beschreven in stap 1.1.2.
- Bereid twee C-vormige siliconen steun voor de construct uitwendige diameter = 14 mm; inwendige diameter = 8 mm).
- Plaats een draaiende motor in één einde van de roterende wand bioreactor en van invloed zijn op andere uiteinde (figuur 8B).
- Lumen endothelialisatie
- Expand mens umbilical ader endotheliale cellen (HUVEC's) in 25 cm2 kolven met 5 ml M199 kweekmedium gesupplementeerd met 10% (v / v) PS, 10% (v / v) FBS, 1% (v / v) pen-strep petrischaal in een incubator (T = 37 ° C, 5% CO2, 100% vochtigheid) tot 90% confluentie.
- Bereid 1,5 ml van het eiwit bekledingsoplossing per construct vereist voor optimale celhechting door het verdunnen van het concentraat proteïnemengsel tot 10,5 ng / ml in serumvrij kweekmedium endotheelcellen.
- Meet de lengte van het construct met behulp van een schuifmaat.
- Bereken het luminale volume V en het luminale oppervlak A van het construct zoals: V = D in 2 L / 4 en A = D respectievelijk L (waarbij D de binnendiameter overeenkomt met de doorn diameter is en L de lengte van het construct).
- Plaats de construct in het midden van het reservoir volgens de oogstprocedure (paragraaf 2.4).Met C-vormige silicone ondersteuning aan de constructie vast aan beide uiteinden aan het reservoir (figuur 8A).
- Vul het reservoir met 35 ml kweekmedium.
- Voer 75% van de berekende luminale volume van de construct (V) met het eiwit bekledingsoplossing bereid in stap 4.2.2. Sluit beide uiteinden van het construct om lekkage van het eiwit bekledingsoplossing (figuur 8A) te vermijden.
- Monteer de roterende-wand bioreactor systeem in de cel cultuur kap.
- Plaats de bioreactor in een 37 ° C incubator en start de rotatie van de bioreactor bij 4,02 x 10 -5 gravitatiekracht gedurende 1 uur aan de luminale bekleding toe zoals getoond in figuur 8B.
- Open het bovenste uiteinde van het construct en de zuig proteïne coatingoplossing van het lumen.
- Maak HUVECs (passage 2-3) door het cultuurmedium uit de kolf van HUVECs en het toevoegen van 3 ml trypsine-oplossing (1 x in PBS). Ikncubate gedurende 5 min (T = 37 ° C, 5% CO2, 100% vochtigheid).
- Resuspendeer de HUVEC's bij een concentratie van 4 x 10 6 cellen / ml in aangevuld M199-cultuurmedium.
- Binnen de celkweek kap, zaad HUVEC in het lumen van het construct met een dichtheid van 1000 cellen / cm 2 15. Sluit de bovenste uiteinden van het construct om lekkage van de HUVEC oplossing voorkomen.
- Incubeer de constructen (T = 37 ° C, 5% CO2, 100% vochtigheid) gastheer in de roterende wand bioreactor (figuur 8B) en kweek gedurende 2 dagen bij een constante rotatie van 4,02 x 10 -5 g force.
- Oogst de constructie na 2 dagen van de cultuur in steriele omstandigheden en voor te bereiden voor verdere biologische karakterisering zoals beschreven in paragraaf 2.4.
Representative Results
Dit werk beschrijft de fabricage van gemanipuleerde buisvormige collageen gebaseerde constructen met vasculaire cellen. Reeds na 1 uur vroegtijdige gelering was-cellen en collageen mengsel geassembleerd in een 3D buisvormige geometrie, waarbij de uitwendige diameter gelijk aan de diameter van de bijbehorende matrijs (ongeveer 14 mm). Langs statische rijping metingen bleek de snelle vermindering van de buitendiameter van het buisvormige cellularized structuren, zoals weergegeven in tabel 1. De diameter van de cellularized collageen gels afgenomen van ongeveer 60% van de beginwaarde na 1 dag statische kweek en van bijna 85% binnen 7 dagen (Supplemental Video 2). SMC's in de constructen zijn verantwoordelijk voor de waargenomen krimpen en de verwante mechanische versterking, omdat dit verschijnsel treedt niet op bij niet-cellularized collageen scaffolds. Merk op dat geen verloop van type (thermisch, biochemische, mechanische of andere) toegepast. De cellen-aandrijvingn verdichting tot een materiaal met een grotere collageendichtheid die kunnen worden behandeld en onderworpen aan mechanische verzoeken (Supplemental's 3 en 4).
Om de cellen gedreven hermodellering de algehele mechanische en visco-elastische eigenschappen betreffen, werden vermoeiing tests op de constructen (Supplemental's 5 en 6). Deze tests bestonden in fietsen de constructen (30 maal) bij verschillende constante stammen (10%, 20% en 30% van de oorspronkelijke meetlengte) en de belasting opnemen als de reactie van de constructen aan de mechanische verzoek tijd. De representatieve resultaten één construct zijn weergegeven in figuur 9. Het construct doorstaan hogere spanningen in de langsrichting (75 kPa) dan in de omtreksrichting (16 kPa) indien onderworpen aan dezelfde stam range (30% spanning). Ondertussen, bij elke cyclus, de stress piekwaarde bereikt de targeted maximale belasting daalde in de tijd. Dit gedrag is typisch voor de hoge visco-elastische eigenschappen vertoond door deze op collageen gebaseerde constructen.
De biologische activiteit van de cellularized constructen werd beoordeeld in statische rijping. Derhalve metabole activiteit van gladde spiercellen werd geëvalueerd door meting van de glucose consumptie en lactaat productie in statische kweek. Kweekmedium werd elke 2 dagen en glucose bemonsterd en lactaat concentraties werden gemeten met een bloedgasanalysator. De voortdurende toename van glucoseconsumptie en lactaatproductie gecombineerd om de belangrijke krimpen van de constructen bevestigen de SMC activiteit langs statische kweek (Figuur 10).
De verhoogde mechanische stabiliteit door de cel gedreven hermodellering toegestane manipulatie van de constructen en daaropvolgende endothelialisatie proces. Masson's trichroomkleuring uitgevoerd op het endotheel constructenvertoonde een zeer homogeen endotheel. SMC's vertoonden een spindel-achtige vormige morfologie en bleek homogeen gedispergeerd door de wand, terwijl HUVEC bleek goed verspreid in de luminale zijde (Figuur 11).
Figuur 1:. Componenten van het statische bioreactor De statische bioreactor bestond uit een gemodificeerde 50 ml centrifugebuis (A) en een doorn voorzien kap (B). De buis diende als medium reservoir, en is uitgerust met een poort voor een 0,22 urn filter, voor gasuitwisseling en een septum voor het medium bemonstering en veranderen. Een doorn die in de geventileerde kap kon de vervaardiging van constructen in buisvorm. Het gaas-handgrepen (C) werden ontworpen en vervaardigd volgens de gelering van de constructen op de doorn steunen. Bovendien zijn dezegrepen konden de constructen worden behandeld nadat de statische rijping en te worden bevestigd aan de mechanische inrichting. De uitwendige diameter van de doorn was 4,7 mm.
Figuur 2: Het assembleren van de statische bioreactor Montage fasen van de bioreactor voor de sterilisatie.. Het gaas-handgrepen werden op de doorn (A) op een vaste afstand gemonteerd. Een mal werd geplaatst (B) en stevig vastgemaakt aan de siliconenstop (C). De uitwendige diameter van de doorn was 4,7 mm.
Figuur 3:. Fabricatie van de constructen in steriele omstandigheden De cellen en collageen werd in de behuizing matrijs complex gegoten (A), en laat gel gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (B). Daarna werd de mal verwijderd (C), werd de statische bioreactor gemonteerde (D) en overgebracht in een reservoir voor de statische rijping van het construct in incubator (T = 37 ° C, 5% CO2, 100% vochtigheid). De uitwendige diameter van de doorn was 4,7 mm.
Figuur 4:. Meting van de dikte / buitendiameter van de constructen A laser scanning interferometer werd gebruikt voor het meten van de uitwendige diameters van de constructen te voeren. Het construct werd in het pad van de laserstraal gebracht en genereerden een schaduw. De breedte van de schaduw, die overeenkomt met de buitendiameter van het construct werd vervolgens gemeten en weergegeven op het scherm.
Figuur 5:. Morfologische weergave van de geoogste construct (A) direct na gelering en (B) na cellen aangedreven remodellering tijdens de statische rijping gedurende 2 weken.
Figuur 6: Experimentele opstelling voor mechanische karakteriseringen Dit bestond uit het micromechanische tester uitgerust met een 5 of 10 N laadcel en een bad met PBS bij 37 ° C om de monsters in pseudo-fysiologische omstandigheden..
Figuur 7: Monstervoorbereiding f of mechanische karakteriseringen. Monster harvesting (A) en voorbereiding (B) voor vermoeiing tests in de langs- en omtreksrichting (C). De uitwendige diameter van de doorn was 4,7 mm.
Figuur 8: Roterende-wall bioreactor (A) Het buisvormige constructen werden in het midden van het reservoir met behulp van C-vormige silicone support geassembleerd.. Zowel van de uiteinden van het construct werden gesloten om lekkage van de HUVECs oplossing te voorkomen. (B) De constructen werden gekweekt in incubator (T = 37 ° C, 5% CO2, 100% vochtigheid) in rotatie bij 4,02 x 10 -5 gravitatiekracht gedurende 2 dagen.
2 / 52812fig9highres.jpg "width =" 700 "/>
Figuur 9:.. Mechanische karakteriseringen Resultaten van vermoeidheid testen uitgevoerd op constructies in de lengterichting (A) en de omtrek (B) aanwijzingen na-cel gedreven remodeling Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 10:. Metabole activiteit van SMC binnen de collageengels Metingen van glucose verbruik en lactaat productie snelheid werden uitgevoerd met het bloed gas analyzer om de 2 dagen na het kweekmedium veranderen. Vers kweekmedium werd gebruikt als basisniveau voor glucose en lactaat metingen concentraties.
Figuur 11: Lumen endothelialisatie Histologische beelden van de radiale dwarsdoorsneden van buisvormige constructies.. Masson kleuring Trichome buisvormige constructen statisch gekweekt gedurende 1 week (A) en 2 weken (B). H & E kleuring van een buisvormige constructie (C).
| Tijd | Dikte (mm) | Verdichting (%) |
| 0 hr | 4.83 ± 0.02 | 0 ± 0 |
| 2 hr | 4.26 ± 0.02 | 12 ± 0 |
| 4 hr | 4.21 ± 0.03 | 13 ± 1 |
| 6 hr | 4,06 ± 0,10 | 16 ± 2 |
| 12 hr | 3.16 ± 0.07 | 35 ± 1 |
| 1 dag | 2,08 ± 0,11 | 57 ± 2 |
| 1 week | 0,68 ± 0,07 | 86 ± 1 |
| 2 weken | 0.36 ± 0.00 | 93 ± 0 |
Tabel 1: Snelle verdichten van construct diameter tijdens de statische rijping wanddikte van de constructen en de verdichting als functie van de tijd van statische kweek.. Verdichting werd gemeten door de uitwendige diameter van het buisvormige constructen met een aftastende laser interferometer (Series 183B, LaserMike 136). Na 24 uur werd de constructen samengeperst tot 57% ± 2% van de gevormde dimensies. De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD (n = 3). De aanwezigheid en de activiteit van levende gladde spiercellen was alleen verantwoordelijk voor dergelijke wezenlijke veranderingen.
Supplemental Video 1:. Het oogsten van de niet-vernieuwde buisvormige collageengels Klik hier om deze video te bekijken.
Aanvullende Video 2:. Cells-driven verdichting van buisvormige collageengels Klik hier om deze video te bekijken.
Aanvullende Video 3:. Manipulatie van de niet-vernieuwde buisvormige collageengels Klik hier om deze video te bekijken.
Aanvullende Video 4:. Manipulatie van de cellen-vernieuwde buisvormige collageengels Klik hier om th bekijkenis video.
Aanvullende Video 5:. Longitudinal vermoeidheid-test (30%) op cellen-gerenoveerd buisvormige collageengels Klik hier om deze video te bekijken.
Aanvullende Video 6:. Omtrekafname vermoeidheid-test (30%) op cellen-gerenoveerd buisvormige collageengels Klik hier om deze video te bekijken.
Discussion
Onder de gemeenschap van vaatweefsel ingenieurs, zijn enorme inspanningen gedaan om de tunica media layer verantwoordelijk voor de mechanische stabiliteit van bloedvaten 16 te reproduceren. Aangezien het pionierswerk van Weinberg Bell 17, is collageen op grote schaal gebruikt als een matrix voor vasculaire tissue engineering vanwege zijn biologische verenigbaarheid, niet-immunogene eigenschappen en mogelijkheden. Het gebruik van collageen vormt een grote uitdaging voor onderzoekers, aangezien dit materiaal niet gemakkelijk te hanteren, vanwege de intrinsieke gebrek aan mechanische stijfheid. Manipulaties tijdens scaffold preparaat kan de steigers beschadigen compromitteren ze voor verder gebruik.
De in dit werk beschreven techniek kan: i) cellularized collageen gels ingenieur een buisvormige geometrie, ii) biologische weefsel engineering sterk genoeg na korte static rijpingsduur (1 of 2 weken) worden behandeld, iii) alssess mechanische en visco-elastische eigenschappen van dergelijke buisvormige biologische weefsels in 2 richtingen. Cellen in de gel spelen een belangrijke rol bij de collageen matrix remodeling. Tijdens de rijpingsperiode, contractiele SMC's leidde tot de verdichting van de gels waardoor een constructie met een hogere mechanische stabiliteit dat zou kunnen worden beoordeeld in de lengterichting en de omtrek richtingen. Daarna HUVEC geënt in de luminale kant van de constructen gegenereerde homogene en levensvatbare endotheel, waardoor de geschiktheid van de collageen gels vasculaire tissue engineering toepassingen demonstreren.
De in dit werk bioreactor is speciaal ontworpen om een optimale omgeving voor celgroei bieden tijdens statische rijping. Bovendien werden de inrichtingen ontwikkeld voor het karakteriseren van de mechanische en visco-elastische eigenschappen van de constructen ontworpen met het doel om mogelijke beschadiging inherent aan de manipulatie van verminderingdergelijke delicate materialen. Daarom werd de statische bioreactor voorzien van een 0,22 urn filter en een filtermembraan op de dop (stap 1.1.2, figuur 1A en B) dat toegestaan gasuitwisseling tussen cultuur medium in het reservoir en de incubator, terwijl het houden van een steriele cultuur omgeving. De luer septum onderin werd gebruikt als een poort voor cultuurmedium bemonstering en veranderen in statische kweek. Kritische stappen tijdens construct fabricage en kenmerken worden beschouwd. Alle manipulaties (uitgevoerd in stap 2.1.1 en de daaropvolgende stappen) de steriliteit van het systeem kunnen veranderen werden uitgevoerd in een steriele biologische kap. Cellen en collageengel mengsel preparaat werd behandeld op ijs om het geleringsproces vertragen (stappen 2.1.4 tot 2.1.7). Bij stap 2.1.7, geen luchtbellen ingesloten in het mengsel voorafgaand aan de gelering zijn potentiële stress-concentratie gebieden die in gevaar kunnen brengen van de swinstgevendheid van de constructen. Daarom is het verwijderen van dergelijke luchtbellen vereist lichtjes schudden van de montage of het gebruik van medische vacuum gedurende 3 min voor ontgassing in steriele omstandigheden. Tenslotte werden de handgrepen speciaal ontworpen voor het handhaven van de as van de doorn in het centrale buisvormige mal tijdens gelering en voor het nemen delicate manipulatie van de constructen tijdens het oogsten (verwijdering van de doorn, sectie 2.4) voor endotheel en voor het vergemakkelijken van de montage op het mechanische systeem (longitudinaal tests).
Het onderhavige protocol stelt een origineel eenvoudig te verwerken alternatieve benadering wapening van collageen gels constructen gebaseerd op de natuurlijke inherente contractiele vermogen van SMC. Algemene technieken van collageen matrices wapening gebruik worden gemaakt van fysische en chemische verknopingsmiddelen die nadelige effecten op cellen-matrix interacties 18 kunnen hebben - 20. De fabricagetechniek gepresenteerddit werk staat regisseren deze cellen gedreven remodeling proces om een tissue-engineered constructie met gerichte mechanische eigenschappen opleveren zonder fysieke of chemische behandeling.
Karakterisering van de mechanische en visco-elastische eigenschappen van gehydrateerde collageen gels is een grote uitdaging. In dit perspectief is het huidige protocol beschrijft een originele eenvoudige en efficiënte methode voor het bepalen van de mechanische eigenschappen van buisvormige zachte weefsels. Deze karakterisering kan worden uitgevoerd niet alleen in de omtrekrichting maar ook in de langsrichting, aan de gehele buisvormige structuur. Tijdens mechanische karakterisatie, temperatuur, waterig milieu, pH en ionsterkte zijn enkele van de omgevingsfactoren waarvan bekend is dat het mechanisch gedrag van het gemanipuleerde weefsel 21 grote invloed. Vandaar dat de huidige werk suggereert een originele set-up en protocol voor de mechanische karakterisering van biologische weefsels in een zeerreproduceerbare pseudo-fysiologische omgeving (zoutoplossing bij 37 ° C en pH 7.4). Om het beste van onze kennis, dit soort karakterisering is nooit elders gemeld.
Samenvattend, de in dit werk voorgesteld techniek toont het grote potentieel van directe mengen van cellen met collageen voor vasculaire tissue engineering toepassingen. Deze methode samen met de mechanische karakterisering en endotheelvorming proces vormen hoge polyvalent protocollen. Vandaar dat, door middel van lichte wijzigingen van de set-ups en protocollen terwijl het dezelfde reden, de belangrijkste eisen voor engineering vaatweefsel equivalenten kunnen worden zoals aangepakt als een snelle en eenvoudige verwerking, waaronder endotheelvorming, en de mogelijkheid om te worden toegepast op een breed scala van zachte weefsels met verschillende lengtes en diameters. Voorts verschillende hechtende celtypen, ECM eiwitten en gevormde geometrieën kunnen worden onderzocht op een aantal gerichte applications, zoals engineering pezen, huidtransplantaties, cardiale patches, zenuwen, onder anderen. Hoewel de mechanische eigenschappen van de constructen zijn bemoedigend, ze nog steeds lager dan die van cellen. In deze context, we ervan overtuigd dat een zeer korte statisch gerijpt is een belangrijke stap naar de dynamische stimulatie in een bioreactor, hetgeen leidt tot een hogere structurele integriteit en mechanische sterkte. Echter, de mogelijkheid om snel te produceren-tissue engineered cellularized collageen-gebaseerde constructen geschikt voor mechanische en histologische analyses maakt de statische bioreactor hierin beschreven een nuttig en veelbelovend hulpmiddel om inzicht te krijgen in de wisselwerking tussen cellen en ECM te bieden tijdens de groei en verbouwen, of zelfs worden gebruikt als model voor therapieën en geneesmiddelafgiftesystemen.
Disclosures
Geen financiering ontvangen van organisaties of instanties met potentiële belangenconflicten.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door de Natural Science and Engineering Research Council van Canada, de Canadese Institute for Health Research en de CHU de Québec Research Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CellTreat 50 ml Bio-Reaction tubes | CELLTREAT Scientific Products | 229-475 | Centrifuge tube |
| Male luer with lock ring x 1/8" hose barb. PP. 25/pk | Cole Parmer | RK-45503-04 | Luer fittings for "gas-exchange port" |
| Female luer x 1/8" hose barb adapter. PP. 25/pk | Cole Parmer | RK-45500-04 | Luer fittings for the "medium sampling port" |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing L/S 17. 25 ft. | Cole Parmer | RK-96410-17 | Tube 1 and 2 for the gauze grippers |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing L/S 16. 25 ft. | Cole Parmer | RK-96410-16 | Tube 3 for the gauze grippers |
| Silastic Medical adhesive silicone, type A | Dow Corning | - | Silicon glue for the fabrication of the static bioreactor |
| Polyvent 4 Vessel venting filters | Whatman | 6713-0425 | Filter for "gas exchange port" |
| Rod. PP. stirring. 8’’ | Scienceware | 377660008 | Mandrel |
| Stopper silicone rubber 00 PK12 | VWR | 59590-084 | Stopper for the insertion of the mandrel to the vented cap of the centrifuge tube |
| Krytox PFPE/PTFE Greases | Dupont | GPL 202 | Medical grade grease for covering the mandrel |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 | Cell culture |
| Xiameter RTV-4130-J base and curing agent | Dow Corning | - | C-shaped silicone support for endothelialization |
| Dulbecco’s modified Eagle medium, DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco (Life Technology) | 11995-065 | Cell culture |
| Pure acetone (99%) | Laboratoire Mat Inc. | AP0102 | Chemical for collagen extraction |
| Isopropyl alcohol (HPLC grade, 99.9%) | Fisher Scientific | AC610080040 | Chemical for collagen extraction |
| 0.02 N acetic acid (glacial acetic acid, HPLC grade, 99%) | Fisher Scientific | FL070494 | Chemical for collagen extraction |
| Chloroform solution (99%) | Laboratoire Mat Inc. | CR 0179 | Chemical for collagen extraction |
| Hepes | Sigma-Aldrich | 163716 | Chemical for construct preparation |
| NaOH | Laboratoire Mat Inc. | SR-0169 | Chemical for construct preparation |
| LaserMike 136 | LaserMike | Series 183B | Scanning laser interferometer |
| ElectroPulse MicroTester | Instron Corporation | - | Micromechanical Tester |
| HyClone Media M199/EBSS, 500 ml | GE Healthcare Life Sciences | SH30253.01 | Component of cell culture medium |
| Fetal bovine serum HI - 500 ml | Gibco | SH 30396.03 | Component of cell culture medium |
| Porcine serum (PS) | Sigma-Aldrich | P9783 | Component of cell culture medium |
| Penicillin-Streptomicin | Gibco | 15140-122 | Component of cell culture medium |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP661-50 | Saline solution |
| Tissue culture flask T17CN Vent Cap Red | Sarstedt Inc. | 83.1812.002 | Cell culture |
| ColorpHast- pH-indicator strips (pH = 6.5-10.0) | EMD | 9583 | pH measurements |
| Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5 ml vial | BD Biosciences - Discovery Labware | 356230 | Concentrate protein mixture for endothelialization process |
| LifeCam VX-3000 | Microsoft | - | Thickness measurement |
| Biochemical analyzer, DxC600 | Beckman Coulter Unicell Synchron | - | Glucose and lactate concentrations measurements |
| Collagen fibers | Rat tails | - | Collagen was extracted in the laboratory |
| Porcine smooth muscle cells (pSMCs) | Porcine aortas | - | pSMCs were isolated in the laboratory |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Human umbilical veins | - | HUVECs were isolated in the laboratory |
References
- Kim, B. S., Nikolovski, J., Bonadio, J., Smiley, E., Mooney, D. J. Engineered smooth muscle tissues: regulating cell phenotype with the scaffold. Experimental cell research. 251, 318-328 (1999).
- Heureux, N., McAllister, T. N., de la Fuente, H. L. Tissue-engineered blood vessel for adult arterial revascularization. The New England journal of medicine. 357 (14), 1451-1453 (2007).
- Syedain, Z. H., Meier, L. A., Bjork, J. W., Lee, A., Tranquillo, R. T. Implantable arterial grafts from human fibroblasts and fibrin using a multi-graft pulsed flow-stretch bioreactor with noninvasive strength monitoring. Biomaterials. 32 (3), 714-722 (2011).
- Lee, C., Singla, A., Lee, Y.
- Couet, F., Rajan, N., Mantovani, D. Macromolecular biomaterials for scaffold-based vascular tissue engineering. Macromolecular bioscience. 7 (5), 701-718 (2007).
- Christiansen, D. L., Huang, E. K., Silver, F. H. Assembly of type I collagen: fusion of fibril subunits and the influence of fibril diameter on mechanical properties. Matrix Biology. 19 (5), 409-420 (2000).
- Eppell, S. J., Smith, B. N., Kahn, H., Ballarini, R. Nano measurements with micro-devices: mechanical properties of hydrated collagen fibrils. Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 3 (6), 117-121 (2006).
- Lai, V. K., Lake, S. P., Frey, C. R., Tranquillo, R. T., Barocas, V. H. Mechanical behavior of collagen-fibrin co-gels reflects transition from series to parallel interactions with increasing collagen content. Journal of biomechanical engineering. 134 (1), 011004 (2012).
- Seliktar, D., Nerem, R. M., Galis, Z. S. The Role of Matrix Metalloproteinase-2 in the Remodeling of Cell-Seeded Vascular Constructs Subjected to Cyclic Strain. Annals of Biomedical Engineering. 29 (11), 923-934 (2001).
- Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nature protocols. 1 (6), 2753-2758 (2006).
- Kumar, V. A., Caves, J. M., et al. Collagen-Based Substrates with Tunable Strength for Soft Tissue Engineering. Biomaterials science. 1 (11), 1193-1202 (2013).
- Li, S., Van Den Diepstraten, C., D’Souza, S. J., Chan, B. M. C., Pickering, J. G. Vascular smooth muscle cells orchestrate the assembly of type I collagen via alpha2beta1 integrin, RhoA, and fibronectin polymerization. The American journal of pathology. 163 (3), 1045-1056 (2003).
- Badylak, S. F., Freytes, D. O., Gilbert, T. W. Extracellular matrix as a biological scaffold material: Structure and function. Acta biomaterialia. 5 (1), 1-13 (2009).
- Engbers-Buijtenhuijs, P., Buttafoco, L., et al. Biological characterisation of vascular grafts cultured in a bioreactor. Biomaterials. 27 (11), 2390-2397 (2006).
- Cheung, A. L. Isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Current protocols in microbiology. 4, 4B (2007).
- Seifu, D. G., Purnama, A., Mequanint, K., Mantovani, D.
- Weinberg, C., Bell, E. A blood vessel model constructed from collagen and cultured vascular cells. Science. 231 (4736), 397-400 (1986).
- Meghezi, S., Chevallier, P., Mantovani, D. Why Mechanical Properties of Collagen Scaffolds Should Be Tested in a Pseudo-Physiological Environment. Advanced Materials Research. 409, 158-163 (2011).
- Tirella, A., Liberto, T., Ahluwalia, A. Riboflavin and collagen: New crosslinking methods to tailor the stiffness of hydrogels. Materials Letters. 74, 58-61 (2012).
- Madhavan, K., Belchenko, D., Tan, W. Roles of genipin crosslinking and biomolecule conditioning in collagen-based biopolymer: Potential for vascular media regeneration. Journal of biomedical materials research. Part A. , 16-26 (2011).
- Meghezi, S., Couet, F., Chevallier, P., Mantovani, D. Effects of a pseudophysiological environment on the elastic and viscoelastic properties of collagen gels. International journal of biomaterials. 2012, 319290 (2012).
