Summary
रिसेप्टर की तस्करी ligands के लिए संकेतन और सेल जवाबदेही modulates और, खुद को, ligand प्रेरित सिगनल सहित सेल की स्थिति, के लिए उत्तरदायी है। यहाँ, हम मात्रात्मक immunolabeling और colocalizational विश्लेषण का उपयोग दवा प्रेरित रिसेप्टर की तस्करी का आकलन करने के लिए एक शक्तिशाली और लचीला तकनीक का वर्णन है।
Introduction
रिसेप्टर्स, विशेष रूप से जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs), नियमित रूप से करने के लिए और कोशिका की सतह से 1, intracellularly तस्करी कर रहे हैं। ये मिश्रित रूप से करवाया और कसकर नियंत्रित प्रक्रियाओं 'कोशिकाओं उपलब्ध रिसेप्टर पूरक हुक्म और रिसेप्टर लौकिक गतिविधि, desensitization, और resensitization 2 विनियमित - 4। महत्वपूर्ण बात है, इन प्रक्रियाओं दवा प्रेरित रिसेप्टर गतिविधि या निष्क्रियता सहित सेलुलर वातावरण के लिए उत्तरदायी हैं। यही कारण है, रिसेप्टर्स पर ligands के कार्यों जिससे सेल जवाबदेही फेरबदल, उन रिसेप्टर्स के intracellular की तस्करी बदल सकते हैं। इस तरीके में, बाहरी ligands के भी शास्त्रीय दूत करने वाली प्रेरक Cascades 5,6 से परे है, और अधिक प्रभाव सेल समारोह पर अभी तक डालती है।
प्रेरित रिसेप्टर की तस्करी में इस तरह के बदलाव की जांच करना मुश्किल है। सभी उपलब्ध तकनीकों सीमाओं को शामिल करना। बायोटिन संरक्षण assays के मोनी करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैटो सतह रिसेप्टर्स आबादी। इन रिसेप्टर्स biotinylated कर रहे हैं और immunoprecipitations के timecourse समय के साथ biotinylated रिसेप्टर्स में कमी यों के लिए किया जाता है। इस तकनीक को अनिवार्य रूप से रिसेप्टर्स 7 की एक शुरुआती, लेबल, जनसंख्या का क्रमिक गिरावट पर नज़र रखता है, और इस प्रक्रिया के समय पाठ्यक्रम के निर्माण में बहुत उपयोगी है। दुर्भाग्य से, इस परख ऐसे internalization, रीसाइक्लिंग, या नए रिसेप्टर्स के रूप में रिसेप्टर्स के मूल पूल की गिरावट के अलावा अन्य किसी भी प्रक्रिया की निगरानी करने में असमर्थ है। इसके अलावा, 50kDa रेंज में एक रिसेप्टर के लिए 150kDa रेंज में एक एंटीबॉडी के अलावा रिसेप्टर के अवैध व्यापार 8,9 बदल सकते हैं, और इस तकनीक को कम अभिव्यक्ति-स्तर रिसेप्टर्स के साथ उपयोग करने के लिए मुश्किल हो सकता है।
अन्य प्रक्रियाओं इंट्रासेल्युलर तस्करी के डिब्बों (जैसे, endosomes, आदि) की पहचान करने और ब्याज की रिसेप्टर्स के साथ उनके colocalization का आकलन करने के लिए विभिन्न तरीकों का उपयोग करें। यह हमें भी शामिलव्यक्त heterologous प्रणालियों के ई रिसेप्टर्स और डिब्बे मार्कर (जैसे, रब-परिवार GTPases) की काइमेरिक निर्माणों फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग किया। इस संभावित निर्धारण और permeabilization से संबंधित मुद्दों को हटाने, लाइव सेल इमेजिंग का उपयोग सक्षम बनाता है। अधिक physiologically प्रतिनिधि प्रकार की कोशिकाओं के साथ व्यवहार और असंगति तस्करी पर टैग और अभिव्यक्ति के स्तर प्रभाव: शक्तिशाली, वहीं ऐसी रणनीति heterologous सामान्य रूप में सिस्टम का एक ही सीमाओं से ग्रस्त है। और अधिक लोकप्रिय, रंग आसानी से intracellular डिब्बों लेबल करने के लिए उपयोग किया जाता है (उदाहरण के लिए, लाइसोसोम, जाहिरा तौर पर) 10। रंजक, तथापि, विशिष्टता (लाइसोसोम के लिए रंगों के मामले में सभी अम्लीय अंगों) की कमी कर सकते हैं और अन्य डिब्बों के माध्यम से की तस्करी का आकलन नहीं करते। फिर भी, इन तकनीकों प्रणाली और प्रयोगात्मक शर्तों पर काफी नियंत्रण की अनुमति है और नीचे, यहाँ प्रस्तुत colocalization विश्लेषण के तरीकों से लाभ हो सकता है।
विधि Wयहां उपस्थित ई colocalization के द्वारा रिसेप्टर की तस्करी की ट्रैकिंग को परिष्कृत। उपयुक्त मार्करों लेबल करने के लिए immunocytochemistry (आईसीसी) का उपयोग करना, यह कई अलग intracellular डिब्बों की पहचान करना संभव है। यह भी heterologous सिस्टम के स्थान पर physiologically प्रासंगिक प्राथमिक सेल संस्कृतियों के उपयोग की अनुमति देता है। यह आईसीसी प्रोटोकॉल लेबलिंग करने से पहले ब्याज की कोशिकाओं फिक्सिंग शामिल है; इस दवा उपचार (एस) के बाद एक विशिष्ट timepoint पर लेबलिंग परमिट। यह उस timepoint पर वैश्विक रिसेप्टर डिब्बे संघों की एक स्नैपशॉट 'पैदा करता है। एकाधिक timepoints के साथ, तस्करी के बदलाव की एक timecourse भी निर्माण किया जा सकता है।
संक्षेप में, कोशिकाओं को दवा इलाज, रिसेप्टर और ब्याज के intracellular कम्पार्टमेंट के लिए चिह्नित कर रहे हैं, confocally imaged, और photomicrographs गणितीय रिसेप्टर और डिब्बे 11 की colocalization यों के लिए विश्लेषण कर रहे हैं। हमारे प्रयोग में, हम रा के साथ एक रिसेप्टर की colocalization की जांच कीB5, Rab11, और झिल्ली प्रोटीन 1 (LAMP1) lysosomal जुड़े। इन मार्कर क्रमशः, जल्दी endosomes, रीसाइक्लिंग endosomes, और लाइसोसोम की पहचान। ये colocalization के उपायों internalization, रीसाइक्लिंग, और गिरावट 12 के व्यापक प्रक्रियाओं के लिए परदे के पीछे के रूप में काम करते हैं।
सभी तकनीकों के साथ के रूप में, कुछ सीमाएँ विचार किया जाना चाहिए। कारण हर व्यक्ति के न्यूरॉन का विश्लेषण किया छवि के लिए जरूरत के लिए, इस तकनीक को शामिल शर्तों और timepoints की संख्या के आधार पर काफी श्रम प्रधान बन सकता है। सभी immunolabeling भी निर्धारण और permeabilization के 13 की वजह से सेलुलर फैटी, प्रोटीन स्थानीयकरण, और मिलान पहुँच पर प्रभाव के साथ संघर्ष करना होगा।
मूल रूप से प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स के प्राथमिक संस्कृतियों के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित हालांकि, इस विधि अन्य monolayer चढ़ाया संस्कृति मॉडल के साथ मोटे तौर पर संगत है।
एक गणितीय मात्रा निर्धारित measur का उपयोगcolocalization की ई विशेष रूप से, कहीं अधिक methodologically, अक्सर ऐसे नेत्रहीन निरीक्षण किया मल्टी चैनल ओवरले 14 के रूप में अस्पष्ट, व्यक्तिपरक उपायों पर भरोसा किया है जो रिसेप्टर की तस्करी में परिवर्तन का आकलन करने के लिए इस्तेमाल पिछले तकनीकों की तुलना में कठोर है।
इस तकनीक में विवो हस्तक्षेप (पूर्व प्राथमिक संस्कृति पीढ़ी) के साथ अपने व्यापक अनुकूलता के लिए विशेष रूप से उपयोगी है, इन विट्रो हस्तक्षेप (संस्कृति के विकास के दौरान), और विभिन्न लेबलिंग 15 निशाना बनाता है। जैसे, यह कई अलग अलग अनुसंधान सवालों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
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Protocol
नोट: इस प्रोटोकॉल विभिन्न monolayer चढ़ाया सेल / टिशू कल्चर मॉडल, दवा उपचार परहेज, और लेबलिंग लक्ष्य के साथ मोटे तौर पर संगत है। इस प्रकार वास्तविक प्रयोग में, कई विशिष्ट मानदंडों प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर अलग अलग होंगे। इधर, इन उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित मापदंडों के लिए संदर्भ सामान्य हैं। प्रतिनिधि परिणाम प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है के रूप में उदाहरण शर्तों, इटैलिक में शामिल किए गए हैं।
1. समाधान
- 0.1M Tris बफर Hypertonic (300 मिमी) खारा और 0.05% Polysorbate 20 के मिश्रण से धोने बफर तैयार; आरटी पर 7.4 पीएच।
- अवरुद्ध बफर तैयार करें। 0.05 एम Tris बफर Hypertonic करने के लिए (300 मिमी) खारा 0.05% Polysorbate 20, 3% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) और 0.1% ठंड मछली त्वचा जिलेटिन जोड़ने और आरटी पर 7.4 पीएच को समायोजित करें।
- 0.05 एम Tris बफर Hypertonic (300 मिमी) खारा को 0.05% Polysorbate 20, 1% बीएसए, 0.1% ठंड मछली त्वचा जिलेटिन जोड़कर एंटीबॉडी मंदक को तैयार है और 4 ओ सी में 7.4 पीएच को समायोजित
नोट: Tris बफ़र्स के पीएच तापमान पर निर्भर है। यही कारण है कि तापमान में एक परिवर्तन के समाधान के पीएच बदल जाएगा, है। स्थिरता के लिए, इन बफ़र्स हमेशा वे का उपयोग किया जाएगा, जिस पर तापमान पर पीएच-समायोजित किया जाना चाहिए।
2. सेल संस्कृति
नोट: उचित सेल संस्कृति प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया प्रकार की कोशिका (एस) के आधार पर अलग अलग होंगे। इन प्रक्रियाओं को अलग से अनुकूलित किया जाना चाहिए। विस्तृत सेल संस्कृति के तरीके में 16 सहित, आसानी से उपलब्ध हैं। एक समान प्रक्रिया उल्लेखनीय मतभेदों के साथ प्रतिनिधि परिणाम प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया था:
- वयस्क जानवरों से संस्कृति पृष्ठीय रूट ganglia न्यूरॉन्स 12 वर्णित है। संस्कृति के लिए कोशिकाओं वयस्क न्यूरॉन मध्यम विकास का प्रयोग करें। बल्कि ग्लूटामेट, की तुलना में preplating द्वारा glial सेल घनत्व कम करें। इस approximat हो गई कम से कम 30-60 प्रति प्लेट न्यूरॉन्स और साथ glial कोशिकाओं के साथ 12 दौर कांच coverslips पर हो एक मिश्रित न्यूरॉन glial संस्कृति में यह परिणामइली 40% confluency। यह glia जरूरत से ज्यादा विकसित करने के लिए अनुमति दी जाती है अगर एक प्राथमिक संस्कृति में न्यूरॉन्स की नकल नहीं करेंगे और सह सुसंस्कृत glia द्वारा थाली से दूर धकेल दिया जाएगा कि ध्यान दिया जाना चाहिए। न्यूरॉन्स को प्रभावित करने से बचने के क्रम में, glial संख्या की शारीरिक कमी रासायनिक / औषधीय तरीकों के लिए बेहतर है।
नोट: इस प्रोटोकॉल के प्रयोजनों के लिए, हम ब्याज की कोशिकाओं के लिए बड़े हो रहे हैं मान लेते हैं कि उनकी प्रयोगात्मक-वांछित राज्य और monolayer चढ़ाया। हम 24 अच्छी तरह से प्लेट में 12 गोल कांच coverslips पर चढ़ाना सबसे सुविधाजनक हो सकता है कि लगता है। वर्णित सभी संस्करणों और प्रक्रियाओं के एक 24 अच्छी तरह से थाली में से एक कुएं में एक coverslip के लिए उपयुक्त हैं।
संवर्धित कोशिकाओं 3. औषध उपचार
नोट: एकाधिक अनुक्रमिक, या अतिव्यापी, दवा उपचार संभव हो रहे हैं। विशिष्ट प्रयोग पर निर्भर करेगा इस्तेमाल लोगों तक पहुंचाने के लिए दवाओं, खुराक / सांद्रता, और durations।
- मूल मध्यम विकास निकालें 16 नोट: यह एक स्वतंत्र दोहराने (आम तौर पर एक एकल 24 अच्छी तरह से थाली संस्कृति) एक ही आम नियंत्रण हालत में होते हैं कि महत्वपूर्ण है। इस अंतर परीक्षण परिवर्तनशीलता के लिए सही है जो प्रतिकृति भर में डेटा को सामान्य बनाने की अनुमति देगा।
- 48 घंटे के लिए 16 मूल के विकास की स्थिति में कोशिकाओं को सेते हैं।
- बाद में दवा उपचार के लिए, दोहराने 3.1 कदम और Deltorphin 1 माइक्रोन के साथ 3.2, SNC80 1 माइक्रोन, या वाहन और 60 मिनट 12 के लिए सेते हैं। पानी में deltorphin द्वितीय solubilize और पानी में 1 मिमी पतला 40 माइक्रोन एचसीएल और sonicate, में 10 मिमी पर SNC80 solubilize।
नोट: इस प्रोटोकॉल वे चुना मध्यम विकास में वांछित एकाग्रता (ओं) को भंग किया जा सकता है कि दवा (एस) के इस तरह के solubilized किया गया है रखती है। के लिए उचित प्रक्रियाऐसे solubilization प्रश्न में नशीली दवाओं के आधार पर अलग अलग होंगे और अलग से अनुकूलित किया जाना चाहिए। - धोने के प्रति धोने बफर के ~ 1 मिलीलीटर के साथ, धीरे से तीन बार कोशिकाओं को धो लें। (धोने बफर के साथ इस मामले में) के रूप में वांछित धीरे, ताजा समाधान के साथ अच्छी तरह से refilling, अच्छी तरह से तरल aspirating, तो तुरंत, और धीरे से प्रत्येक धोने प्रदर्शन करते हैं।
4. फिक्सेशन और Immunocytochemistry
नोट: विशिष्ट लेबलिंग लक्ष्य प्रयोग द्वारा अलग अलग होंगे। चर्चा के रूप में हमारे उपयोग में, हम, डेल्टा opioid रिसेप्टर्स (कीट) और Rab5, रब 11, और LAMP1 लेबल। विशिष्ट एंटीबॉडी विशिष्ट प्रयोग पर निर्भर करेगा इस्तेमाल किया। इष्टतम लेबलिंग शर्तों विशिष्ट एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया (एँ) पर निर्भर हैं। इस विषय का एक बहुत फुलर चर्चा के नीचे है।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ~ में 0.1 एम फॉस्फेट बफर खारा में 300 μl 4% paraformaldehyde के विसर्जन के द्वारा कोशिकाओं को ठीक करें।
नोट: यह महत्वपूर्ण है कि 4% पैराformaldehyde के हौसले की वजह से पहले से जमी paraformaldehyde के उपयोग की वजह से autofluorescence के लिए तैयार रहना। - 3.3 में वर्णित के रूप में, धोने के प्रति धोने बफर के ~ 1 मिलीलीटर के साथ, धीरे से 3 बार कोशिकाओं को धो लें।
- आरटी पर 2 घंटे के लिए अवरुद्ध बफर μl 300 में कोशिकाओं को सेते हैं।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए एंटीबॉडी मंदक के 300 μl में प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को सेते हैं। हमारे प्रयोग में, प्राथमिक कीट के खिलाफ एंटीबॉडी (खरगोश विरोधी-डोर) और में से एक: Rab5 (माउस विरोधी Rab5), रब 11 (माउस विरोधी Rab11), और LAMP1 (बकरी विरोधी LAMP1)।
- 3.3 में वर्णित के रूप में, धोने के प्रति धोने बफर के ~ 1 मिलीलीटर के साथ, धीरे से तीन बार कोशिकाओं को धो लें।
- अलग fluorophores के संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को सेते आरटी पर 1 घंटे के लिए एंटीबॉडी मंदक के 300 μl में (नीचे चर्चा देखें)। यह, और बाद के सभी चरणों में, प्रकाश से कोशिकाओं की रक्षा। प्रतिनिधि परिणाम प्राप्त करने के लिए, हरी उत्सर्जक फ्लोरोफोरे संयुग्मित विरोधी खरगोश और eith का उपयोगएर एक लाल उत्सर्जक फ्लोरोफोरे संयुग्मित विरोधी माउस या लाल उत्सर्जक फ्लोरोफोरे संयुग्मित विरोधी बकरी।
- 3.3 में वर्णित के रूप में, धोने के प्रति धोने बफर के ~ 1 मिलीलीटर के साथ, धीरे से 3 बार कोशिकाओं को धो लें।
- ~ पर थाली पकड़े, अच्छी तरह से प्रत्येक में 45 º धोने बफर के ~ 1 मिलीलीटर छोड़ कर 24 अच्छी तरह से प्लेटों से 12 के दौर coverslips निकालें, और ठीक संदंश का उपयोग अच्छी तरह से मंजिल दूर coverslip के लीवर को। coverslip यह आसानी से संदंश का उपयोग कर हटाया जा सकता है, जहां से अच्छी तरह से दीवार के खिलाफ आराम करने के लिए आ जाएगा।
- माइक्रोस्कोप पर, coverslips, सेल साइड-डाउन माउंट बढ़ते मध्यम विरोधी लुप्त होती के साथ स्लाइड।
5. माइक्रोस्कोप सेटिंग्स
- एक उच्च वृद्धि के उद्देश्य (100x) का उपयोग करना, पहले epifluorescence के उपयोग imaged किया जा करने के लिए एक प्रतिनिधि सेल का पता लगाने।
- उदाहरण के लिए प्रयोग किया जाता प्रत्येक फ्लोरोफोरे का पता लगाने, 488 एनएम और 59 के लिए (प्रत्येक लेबल वाले चैनल के 8 बिट असम्पीडित झगड़ा छवियों रिकॉर्ड करने के लिए छवि पर कब्जा सेटिंग्स कॉन्फ़िगर करें4 एनएम), (या तो लाइन या फ्रेम से), और अंतिम छवि के लिए औसत 4 से 6 स्कैन करने के लिए छवि के लिए प्रत्येक चैनल के क्रमिक रूप से। इष्टतम छवि संकल्प माइक्रोस्कोप-विशिष्ट हो जाएगा, लेकिन एक्स 1024 1024 आम तौर पर अच्छे परिणाम अर्जित करता है।
- Confocal इमेजिंग पथ पर स्विच करें और सेल के केंद्र के माध्यम से एक Z-विमान के लिए ध्यान केंद्रित।
- पिनहोल (आम तौर पर 1 हवादार इकाई), लेजर बिजली, और photomultiplier ट्यूब वोल्टेज (लाभ) अनुकूलन और प्रत्येक चैनल के लिए ऑफसेट। इन सेटिंग्स को रिकार्ड / बचाओ। एक ही दोहराने में किसी भी लक्ष्य जोड़ी के लिए लेबल किए गए सभी कोशिकाओं इमेजिंग के लिए एक ही माइक्रोस्कोप सेटिंग्स का उपयोग करें।
नोट: यह प्रक्रिया आम तौर पर इस सेल के विश्लेषण के लिए imaged नहीं किया जाना चाहिए कि पर्याप्त photobleaching में परिणाम होगा।
6. इमेजिंग
- एक उच्च बढ़ाई उद्देश्य (जैसे, 100x) का उपयोग करना, पहले epifluorescence के उपयोग imaged किया जा करने के लिए एक सेल का पता लगाने।
- Confocal इमेजिंग पथ पर स्विच करें और सेल के केंद्र के माध्यम से एक Z-विमान के लिए ध्यान केंद्रित। मैंच उपलब्ध, उपयोग सॉफ्टवेयर ज़ूम / फसल ब्याज की सेल करने के लिए स्कैन क्षेत्र प्रतिबंधित करने के लिए।
- सेटिंग्स का उपयोग कर प्रत्येक लेबल वाले चैनल के लिए छवियों पर कब्जा पहले से स्थापित किया। दोहराएँ एक पर्याप्त नमूना सुनिश्चित करने के लिए छवि को दोहराने के प्रति हालत प्रति 15 या अधिक कोशिकाओं 6.1-6.3 कदम।
7. colocalization विश्लेषण
- छवियों की जोड़ी को खोलें (जैसे, 'हरी' और 'लाल') ImageJ में एक सेल की। > रंग> एक आरजीबी छवि को उत्पन्न करने के लिए आदेश ... चैनल मर्ज छवि का उपयोग करें।
- ब्याज की सेल के चारों ओर एक चयन ड्रा। चयनित सेल में लक्ष्य की colocalization यों के लिए, (https://www.cpib.ac.uk/tools-resources/software/psc-colocalization-plugin/ से उपलब्ध 11) "पीएससी colocalization" प्लगइन ImageJ का प्रयोग करें।
- वांछित colocalization के उपाय (आमतौर पर पियर्सन की आर 17) रिकॉर्ड। दोहराएँ प्रत्येक imaged सेल के लिए 7.1-7.3 कदम। 8. डेटा सामान्यीकरण
- प्रत्येक के सामान्य नियंत्रण की स्थिति की दर्ज की colocalization मूल्यों का मतलब की गणना प्रत्येक लेबलिंग हालत के दोहराने।
नोट: उदाहरण के लिए, में न्यूरॉन्स की colocalization मूल्यों का मतलब है "48 घंटा वाहन, 60 मिनट वाहन" 3 लेबलिंग शर्तों (रिसेप्टर और 3 डिब्बों में से प्रत्येक) में से प्रत्येक में 3 स्वतंत्र प्रतिकृति में से प्रत्येक में दवा हालत। - (-1) प्रत्येक प्रत्येक लेबलिंग हालत में दोहराने के लिए ऑफसेट करने के लिए उपज द्वारा साधन गुणा करें। प्रत्येक कि दोहराने में प्रत्येक colocalization के मूल्य के लिए प्रत्येक लेबलिंग हालत में दोहराने के लिए ऑफसेट जोड़ें।
नोट: यह आम नियंत्रण हालत के लिए मतलब colocalization के उपाय प्रत्येक लेबलिंग हालत में से प्रत्येक को दोहराने में 0 है कि इस तरह के डेटा मानक के अनुसार होगा। - प्रत्येक लेबलिंग हालत के सभी प्रतिकृति से डेटा पूल।
नोट: colocalization में परिवर्तन अब प्रतिकृति भर में विश्लेषण किया जा सकता है। सांख्यिकीय गुदाysis प्रयोगात्मक डिजाइन पर निर्भर करेगा, लेकिन आम तौर पर विश्लेषण के-विचरण शामिल होगी (एनोवा) (जैसे, Tukey) उपयुक्त पद-हॉक परीक्षण द्वारा पीछा किया। सांख्यिकीय संसाधनों के लिए, 18, जैसे देखते हैं।
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Representative Results
इस तकनीक का उपयोग करना, यह लंबे समय तक / पुराने और तीव्र दवा उपचार दोनों निम्न रिसेप्टर के बाद internalization के अवैध व्यापार में परिवर्तन यों के लिए संभव है। दवा उपचार, निर्धारण, और लेबलिंग के बाद, उच्च संकल्प दो चैनल photomicrographs ब्याज की प्रत्येक कोशिका के कब्जा कर रहे हैं। छवियों प्रतिनिधि उदाहरण आंकड़े (चित्रा 1) उत्पन्न करने के लिए झूठी रंग colocalization के साथ जोड़ा जा सकता है। इसके बाद colocalizational विश्लेषण, के रूप में वर्णित है, लक्ष्य लक्ष्य colocalization (जैसे, रिसेप्टर डिब्बे मार्कर) के मात्रात्मक स्कोर निकलेगा। ये आंकड़े तो इस मामले में, परिवर्तन में तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, नशीली दवाओं के उपचार (एस) (चित्रा 2) द्वारा प्रेरित रिसेप्टर की तस्करी।
FAL साथ रिसेप्टर और डिब्बे-मार्कर लेबलिंग की चित्रा 1. प्रतिनिधि photomicrographsएसई रंग colocalization के नक्शे। पृष्ठीय रूट ganglia संवेदी न्यूरॉन्स के प्राथमिक संस्कृतियों लंबे समय तक (48 घंटे) और तीव्र (1 घंटा) दवा उपचार (बाएं अक्ष लेबल) से अवगत कराया गया। केवल एक लंबे समय तक हालत प्रतिनिधि परिणाम के रूप में दिखाया गया है। कोशिकाओं तो डेल्टा opioid रिसेप्टर्स (कीट) और (संयुग्मित फ्लोरोफोरे) अलग प्राथमिक-माध्यमिक साथ रीसाइक्लिंग endosomes के एक मार्कर (रब 11) प्रतिरक्षी जोड़े (शीर्ष अक्ष लेबल) के लिए immunolabeled गया। कोशिकाओं दो चैनल अनुक्रमिक confocal माइक्रोस्कोपी (बाएं स्तंभ, केंद्र स्तंभ) ने उतारी गया। छवियों प्रतिनिधि दो न्यूरॉन्स में दो लेबल वाले लक्ष्यों को दिखाते हैं। एक न्यूरॉन तीव्र वाहन (ऊपर) के द्वारा पीछा किया लंबे समय तक अफ़ीम के साथ इलाज किया गया था। अन्य न्यूरॉन तीव्र deltorphin द्वितीय (; नीचे Delt, एक कीट एगोनिस्ट) के बाद लंबे समय तक अफ़ीम के साथ इलाज किया गया था। बाद में मात्रात्मक colocalizational विश्लेषण करने के लिए इसके अलावा, इन प्रतिनिधि छवियों झूठी रंग colocalization के नक्शे (सही कॉलम) उत्पन्न करने के लिए प्रोसेस किया गया। स्केल सलाखों थानेदार10 माइक्रोन डब्ल्यू। 3.0-नेकां द्वारा सीसी के प्रावधानों के तहत 12 से अनुकूलित। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2. मात्रात्मक colocalization स्कोर। रिसेप्टर के बाद internalization के अवैध व्यापार में परिवर्तन तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता पृष्ठीय रूट ganglia संवेदी न्यूरॉन्स के प्राथमिक संस्कृतियों लंबे समय तक (48 घंटे) और तीव्र (1 घंटा) दवा उपचार (एक्स अक्ष लेबल) से अवगत कराया गया। केवल एक लंबे समय तक हालत प्रतिनिधि परिणाम के रूप में दिखाया गया है। कोशिकाओं तो कीट और जल्दी endosomes, रीसाइक्लिंग endosomes, और लाइसोसोम के मार्कर के लिए immunolabelled गया। 4 स्वतंत्र प्रतिकृति - इमेजिंग colocalization के स्कोर को निर्धारित किया गया है के बाद, सामान्यीकृत, और 3 भर में जमा। डाटा तो विचरण के दो तरह से विश्लेषण (द्वारा विश्लेषण किया गयाTukey के एचएसडी के बाद हॉक के साथ एनोवा)। डाटा मतलब +/- 95% विश्वास अंतराल के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं। * पी <0.05 अर्थ। जैसा कि स्पष्ट है, इस तकनीक deltorphin द्वितीय के साथ तीव्र उपचार द्वारा प्रेरित कीट के बाद internalization के अवैध व्यापार में परिवर्तन की पहचान के लिए अनुमति दी है, लेकिन नहीं SNC80 (दो अलग कीट एगोनिस्ट)। 3.0-नेकां द्वारा सीसी के प्रावधानों के तहत 12 से अनुकूलित। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
हम वयस्क पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स (प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स) के प्राथमिक संस्कृतियों के विश्लेषण के लिए इस प्रोटोकॉल अनुकूलित है। यह भी मोटे तौर पर monolayer चढ़ाया संवर्धित कोशिकाओं के लिए, कम या कोई संशोधन के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है। colocalizational विश्लेषण हालांकि दवा उपचार और ऊतक निर्धारण / तैयारी घटकों उचित नहीं होगा, यह भी ऊतक स्लाइस और अन्य इस तरह की तैयारी 11 में ही संभव है।
ब्याज की, यहाँ प्रस्तुत आईसीसी तरीकों में भी, ऊतक स्लाइस में डबल लेबल वाले immunohistochemistry के प्रदर्शन करने के लिए, उचित निर्धारण और ऊतक तैयारी के साथ इस्तेमाल किया जा सकता चाहे वह किसी बाद के विश्लेषण के (जैसे, 19)।
इस प्रोटोकॉल के विभिन्न लेबलिंग लक्ष्य के साथ मोटे तौर पर संगत है। चढ़ाया कोशिकाओं के प्रत्येक coverslip डबल लेबल किया जाएगा। सामान्यतया, यह ब्याज की रिसेप्टर और ब्याज के डिब्बों में से एक के एक मार्कर के लिए किया जाएगा। क्या आप वहां मौजूद हैंआम तौर पर कई अलग अलग डिब्बों के साथ रिसेप्टर colocalization की जांच के क्रम में कई लेबलिंग स्थितियों किया जाएगा।
एंटीबॉडी स्वाभाविक चर रहे हैं। उचित लेबलिंग प्रोटोकॉल अलग एंटीबॉडी के बीच अलग अलग होंगे। यह उचित एंटीबॉडी सांद्रता, बफर व्यंजनों, और timepoints भी शामिल है। यह भी एक ही एंटीबॉडी के विभिन्न बहुत सारी सबसे अच्छा अलग एंटीबॉडी माना जाता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए। जैसे, लेबलिंग तरीकों और एंटीबॉडी विशिष्टता मान्य किया जाना चाहिए, और यदि आवश्यक हो तो एंटीबॉडी और लक्ष्य ऊतक के प्रत्येक संयोजन के लिए अनुकूलित। यहां इस्तेमाल किया तरीकों के लिए एक उपयोगी शुरुआती बिंदु हैं। इस माध्यमिक एंटीबॉडी (autofluorescence के लिए नियंत्रित करने के लिए) के अलावा बिना और प्राथमिक एंटीबॉडी (गैर विशिष्ट माध्यमिक लेबलिंग के लिए नियंत्रित करने के लिए) के बिना संसाधित नमूने शामिल हैं: लेबलिंग को मान्य करते हैं, तो यह उचित नियंत्रण प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण है।
प्रभावित करती है जो कई कारक हैंलेबलिंग तरीकों की डिजाइन। यहाँ प्रस्तुत तरीकों को प्रभावित करने नोट के कुछ विचार Tris बफ़र्स, अतिपरासारी खारा, Polysorbate, बीएसए, और ठंड मछली त्वचा जिलेटिन का उपयोग शामिल है। फास्फेट बफ़र्स उच्चतर गैर विशिष्ट लेबलिंग पैदा कर सकता है और कुछ कम से इस्तेमाल किया एंटीबॉडी conjugates के साथ बातचीत कर सकते हैं। हालांकि, Tris बफ़र्स कर रहे हैं, के रूप में विख्यात, तापमान संवेदनशील। Hypertonic नमक सांद्रता आयनिक बातचीत में खलल न डालें द्वारा गैर विशिष्ट लेबलिंग कम। इसे आगे भी अगर वांछित, इस प्रोटोकॉल में निर्दिष्ट किया जाता है परे नमक सांद्रता में वृद्धि संभव है। Polysorbate 20 एक अपेक्षाकृत सौम्य पृष्ठसक्रियाकारक / डिटर्जेंट के रूप में प्रयोग किया जाता है। इस ट्राइटन X-100, काफी, जिससे झिल्ली और subcellular संरचना बिगाड़ना, बाधित, या भी भंग करने के लिए सूचित किया गया है जो अधिक पसंद है। यह washes की पूर्णता सुधार के रूप में सभी buffers पर कम एकाग्रता के शामिल किए जाने Polysorbate 20, गैर विशिष्ट लेबलिंग को कम करने में उपयोगी है। बीएसए आमतौर पर इस्तेमाल किया अवरुद्ध एजेंट का इरादा हैलक्ष्य ऊतकों में गैर विशिष्ट प्रोटीन बाध्यकारी साइटों पर कब्जा करने के लिए। कुछ बीएसए समग्र और गैर विशिष्ट कबरा लेबलिंग को जन्म दे सकती है कि सूचना दी है। इस समस्या को पैदा होती है, यह गैर वसा शुष्क दूध या अतिरिक्त ठंड मछली त्वचा जिलेटिन के साथ बीएसए को बदलने के लिए संभव है। ठंडी मछली त्वचा जिलेटिन भी स्तनधारी प्रोटीन 20 के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी के लिए कम क्रियाशीलता पेश करते हुए गैर विशिष्ट प्रोटीन बाध्यकारी साइटों पर कब्जा करने के इरादे से एक गैर स्तनधारी प्रोटीन स्रोत है।
इस प्रोटोकॉल में निर्दिष्ट नहीं है, यह माध्यमिक एंटीबॉडी उठाया गया था जिसमें प्रजातियों से अवरुद्ध बफर, सामान्य सीरम के लिए, जोड़ने के लिए विशिष्ट है। 3% - ठेठ सांद्रता 1 हैं। नीचे चर्चा की, प्रजातियों के चयन में देखभाल पार reactivities से बचने के लिए प्रयोग किया जाना चाहिए।
दो या दो से अधिक fluorescently लेबल लक्ष्य का पता लगाने करते हैं, तो उपयुक्त फ्लोरोफोरे संयोजनों की पसंद विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। यह अच्छा वर्णक्रमीय SEPA पास करने के लिए आवश्यक हैcrosstalk से बचने के क्रम में राशन। इसके अलावा, fluorophores के विकल्प का इस्तेमाल किया जा करने के लिए माइक्रोस्कोप के विन्यास (उपलब्ध फिल्टर, लेजर लाइनों, आदि) पर निर्भर करेगा। Fluorophore संयुग्मित एंटीबॉडी आपूर्तिकर्ताओं के लिए अपने उत्पादों का सबसे अच्छा संयोजन (जैसे, 21) के बारे में सलाह की पेशकश करेगा। हम डबल-लेबलिंग और colocalizational विश्लेषण के लिए सबसे अच्छी जोड़ी होने के लिए 488 nm- और 594 एनएम उत्साहित fluorophores पाते हैं।
माध्यमिक एंटीबॉडी आम तौर पर प्रजातियों प्रतिक्रियाशील रहे हैं। यही है, वे लक्ष्य प्रजातियों द्वारा निर्मित किसी भी एंटीबॉडी लेबल होगा। डबल-लेबलिंग आईसीसी इसलिए देखभाल पार जेट से बचने के क्रम में प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के मेजबान प्रजातियों के चयन में लिया जाना आवश्यक है। प्राइमरी खरगोश और बकरी में उठाए गए हैं, तो उदाहरण के लिए, यह उपयोग करने के लिए उचित नहीं होगा एक बकरी उठाया माध्यमिक। एंटीबॉडी उपलब्धता ऐसी प्रजातियों के अलग होने के लिए अनुमति नहीं देता है, तो multip के साथ लेबलिंग पूरा करने के लिए उपलब्ध प्रोटोकॉल रहे हैंLe एक ही मेजबान प्राथमिक एंटीबॉडी (जैसे, 22), काफी अधिक अनुकूलन और सत्यापन उम्मीद की जानी चाहिए, हालांकि।
इस विधि photomicrographs में colocalization quantifies के रूप में, यह सब माइक्रोस्कोपी उच्च गुणवत्ता के अनुरूप है, और imaged नमूनों की सही-सही प्रतिनिधि हो कि मूलरूप में आवश्यक है। यह प्रयोग किया जाता हार्डवेयर (प्रकाशिकी गुणवत्ता, आदि) और चुने हुए विशेष प्रक्रियाओं और मापदंडों दोनों शामिल हैं। Colocalizational विश्लेषण 11,17,25 के लिए विशेष रूप से माइक्रोस्कोपी सहित उपयुक्त माइक्रोस्कोपी 23,24 पर मार्गदर्शन के लिए उपलब्ध उत्कृष्ट संसाधन नहीं हैं।
दृश्य ओवरले के तरीकों को काफी पद्धति श्रेष्ठता की है, colocalization की मात्रात्मक उपायों के रूप में अच्छी तरह से प्रकाशन के लिए उदाहरण के आंकड़े की पीढ़ी के लिए खुद को उधार नहीं है। इस तरह के उदाहरण आंकड़े पाठकों के लिए अक्सर मददगार होते हैं और उनकी अनुपस्थिति reviewe ने आलोचना की जा सकती हैआर एस। हम झूठे रंग 'heatmaps' visualizing colocalization के शामिल किए जाने के आंकड़े के निर्माण में सहायक हो पाया है। ImageJ प्लगइन (https://sites.google.com/site/colocalizationcolormap/ से उपलब्ध है) "colocalization रंग मैप" इन छवियों को पैदा करने में उपयोगी है। यह इन छवियों यहाँ वर्णित तकनीक के संदर्भ में सख्ती से उदाहरण होगा कि ध्यान दें, लेकिन करने के लिए महत्वपूर्ण है।
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Acknowledgments
इस काम CIHR (MOP394808) और CMCEWO करने के लिए एक कनाडा अनुसंधान चेयर से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था NSERC से एक पोस्ट-ग्रेजुएट छात्रवृत्ति के प्राप्तकर्ता था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503-500G | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888-500G | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 258148 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma Aldrich | G7041-100G | |
| Corning Costar Cell Culture Plates: 24-well | Fisher Scientific | 720084 | |
| 12 circle Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 1254580 | |
| Aqua/Poly-Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | S9638-500G | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | S9763-500G | |
| Paraformaldehyde | Polysciences | 00380-1 | |
| Dumont #5 Forceps - Standard/Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Rabbit anti-DOR antibody | MyBioSource | MBS316175 | Used at 1:1,500 |
| Mouse anti-Rab5 antibody | Sigma Aldrich | R7904 | Used at 1:750 |
| Mouse anti-Rab11 antibody | Millipore | 05-853 | Used at 1:500 |
| Goat anti-LAMP1 antibody | Santa Cruz | SC8098 | Used at 1:750 |
| Donkey anti-rabbit Alexa 488 conjugated antibody | Life Technologies | A-21206 | Used at 1:200 to 1:2,000 |
| Goat anti-mouse Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11005 | Used at 1:200 to 1:2,000 |
| Donkey anti-goat Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11058 | Used at 1:200 to 1:2,000 |
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