Summary
Receptor menneskehandel modulerer signalering og celle lydhørhed over for ligander og er i sig selv reagerer på celle, herunder ligand-induceret signalering. Her beskriver vi en stærk og fleksibel teknik til kvantitativ vurdering af lægemiddelinduceret receptor menneskehandel hjælp immunolabeling og colocalizational analyse.
Introduction
Receptorer, især G-protein koblede receptorer (GPCR'er), rutinemæssigt trafikerede intracellulært til og fra celleoverfladen 1. Disse komplekst orkestreret og stramt styrede processer diktere cellers tilgængelige receptor supplerer og regulere receptor tidsmæssig aktivitet, desensibilisering, og resensitization 2 - 4. Vigtigere er disse processer reagerer på cellulære miljøer, herunder lægemiddelinduceret receptor aktivitet eller inaktivitet. Det vil sige, kan handlinger ligander på receptorer ændre intracellulær handel med disse receptorer, og derved ændre celle lydhørhed. På denne måde eksterne ligander udøver endnu flere effekter på celle funktion, også ud over klassiske messenger-til-effektor kaskader 5,6.
Undersøgelse sådanne ændringer i induceret receptor handel er vanskelig. Alle tilgængelige teknikker indebærer begrænsninger. Biotin beskyttelse assays er blevet anvendt til at monitor overfladereceptorer befolkninger. Disse receptorer er biotinyleret og et tidsforløb af immunopræcipitationer udføres for at kvantificere reduktionen i biotinylerede receptorer over tid. Denne teknik væsentlige overvåger den gradvise nedbrydning af en indledende, mærket, population af receptorer 7, og er meget nyttig ved konstruktion tidsforløb for denne proces. Desværre dette assay er i stand til at overvåge enhver anden end nedbrydning af den oprindelige pulje af receptorer, såsom internalisering, genvinding eller nye receptorer proces. Desuden kan tilsætningen af et antistof i 150kDa interval til en receptor i 50 kDa området ændre receptorens handel 8,9, og denne teknik kan være vanskeligt at bruge med lave ekspression niveau receptorer.
Andre procedurer bruger forskellige metoder til at identificere rum intracellulære menneskehandel (f.eks endosomer, etc.), og vurdere deres colokalisering med receptorerne af interesse. Dette omfatter ose af heterologe systemer udtrykker fluorescerende-protein-mærkede kimære konstruktioner af receptorerne og compartment markører (f.eks Rab-familie GTPaser). Dette gør det muligt potentielt brugen af live-cell imaging, fjerne spørgsmål vedrørende fiksering og permeabilisering. Mens kraftfuld, sådan strategi lider under de samme begrænsninger for heterologe systemer generelt: tag og udtryk niveau effekter på menneskehandel adfærd og uforenelighed med mere fysiologisk repræsentative celletyper. Mere populært, er farvestoffer bruges til nemt mærke intracellulære rum (f.eks lysosomer, angiveligt) 10. Farvestoffer kan imidlertid mangle specificitet (alle sure organeller i tilfælde af farvestoffer til lysosomer) og ikke vurderer menneskehandel gennem andre rum. Alligevel disse teknikker tillader betydelig kontrol over systemet og eksperimentelle betingelser, og kan drage fordel af de colokalisering analysemetoder præsenteres her nedenfor.
Fremgangsmåden we til stede her forfiner sporing af receptor menneskehandel ved colokalisering. Anvendelse af immuncytokemi (ICC) til at mærke passende markører, er det muligt at identificere flere distinkte intracellulære rum. Dette tillader også anvendelse af fysiologisk relevante primære cellekulturer i stedet for heterologe systemer. Denne ICC-protokollen indebærer fastsættelse cellerne af interesse forud for mærkning; dette tillader mærkning på et bestemt tidspunkterne efter lægemiddelbehandling (er). Dette giver en "øjebliksbillede" af de globale receptor-rum foreninger på det tidspunkterne. Med forskellige tidspunkter, kan et tidsforløb af ændringer trafficking også konstrueres.
Kort fortalt celler er lægemiddelbehandlede, mærket for receptoren og intracellulære rum af interesse, konfokalt afbildes, og mikrofotografierne analyseres matematisk kvantificere colokalisering af receptoren og rummet 11. I vores brug undersøgte vi colokalisering af en receptor med Rab5, Rab11 og Lysosomal-associeret membranprotein 1 (LAMP1). Disse markører identificere tidlige endosomer, genbrug endosomer og lysosomer henholdsvis. Disse co-lokaliseringstoppe foranstaltninger fungerer som stedfortrædere for de overordnede processer i internalisering, genbrug og nedbrydning 12.
Som med alle teknikker, bør visse begrænsninger overvejes. På grund af behovet for at billedet hver enkelt neuron analyseres, kan denne teknik blive ganske arbejdskrævende afhængigt af antallet af betingelser og tidspunkter involveret. Alle immunolabeling skal også kæmpe med virkningerne på cellulært ultrastruktur, protein lokalisering og epitop tilgængelighed forårsaget af fiksering og permeabilisering 13.
Selvom oprindeligt optimeret til brug med primære kulturer af primære sensoriske neuroner, er denne fremgangsmåde stort set forenelig med andre kulturmodeller monolag-belagt.
Anvendelsen af en matematisk kvantificeret measure af colokalisering er, især langt mere metodisk stringent end tidligere teknikker, der anvendes til at vurdere ændringer receptor menneskehandel, som ofte påberåbes vage, subjektive foranstaltninger såsom visuelt inspicerede multi-kanal overlays 14.
Denne teknik er særlig nyttig for sin brede kompatibilitet med in vivo interventioner (før primær generation kultur), in vitro interventioner (under væksten kultur) og diverse mærkning rettet mod 15. Som sådan kan den tilpasses til mange forskellige forskningsspørgsmål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Denne protokol er i store træk forenelig med forskellige monolag-belagte celle / vævskultur modeller, narkotika behandlingsregimer og mærkning mål. Således i den faktiske brug, vil mange specifikke parametre variere baseret på eksperimentelle design. Her henvisninger til disse brugerdefinerede parametre er generiske. Eksempelvis betingelser, som anvendes til at opnå de repræsentative resultater, er anført i kursiv.
1. Opløsninger
- Forbered vaskebuffer ved blanding 0,1M Tris-buffered Hypertonisk (300 mM) Saline og 0,05% Polysorbat 20; pH 7,4 ved stuetemperatur.
- Forbered blokerende buffer. Til 0,05 M Tris-buffered Hypertonisk (300 mM) Saline tilføje 0,05% Polysorbat 20, 3% bovint serumalbumin (BSA) og 0,1% koldt fiskehudsgelatine og pH indstilles til 7,4 ved stuetemperatur.
- Forbered antistoffortynder ved tilsætning 0,05% Polysorbat 20, 1% BSA, 0,1% koldt fiskehudsgelatine til 0,05 M Tris-buffered Hypertonisk (300 mM) Saline og pH indstilles til 7,4 ved 4 ° C.
Bemærk: pH Tris-buffere er temperaturafhængig. Dvs. en ændring i temperaturen ændrer opløsningens pH. For konsistens bør disse buffere altid være pH-justeres ved den temperatur, hvor de vil blive brugt.
2. Cellekultur
Bemærk: Passende cellekultur protokoller vil variere baseret på celletype (r), der anvendes. Disse procedurer skal være særskilt optimeres. Detaljerede cellekultur metoder er let tilgængelige, herunder 16. En lignende procedure blev anvendt til opnåelse af de repræsentative resultater med den bemærkelsesværdige forskelle:
- Kultur dorsalrodsganglier neuroner fra voksne dyr, som beskrevet 12. Brug voksen-neuron vækstmedium til kultur cellerne. Reducer gliale celletæthed ved preplating, snarere end glutamat. Dette resulterer i en blandet neuron-glia-kultur dyrket på 12-runde dækglas med mindst 30-60 neuroner per plade og ledsagende gliaceller dyrket til approximately 40% konfluens. Det skal bemærkes, at neuroner i en primær kultur ikke vil replikere og vil blive skubbet ud af pladen ved co-dyrkes glia hvis glia får lov til at vokse meget. For at undgå at påvirke neuronerne, er fysisk reduktion af gliale numre foretrække frem for kemiske / farmakologiske fremgangsmåder.
Bemærk: I forbindelse med denne protokol, antager vi, at cellerne af interesse dyrkes til deres eksperimentelt ønskede tilstand og monolag-belagte. Vi finder, at udpladning på 12-runde dækglas i 24-brønds plader for at være mest praktisk. Alle rumfang og beskrevne procedurer er passende for en dækglas i en brønd i en plade med 24 brønde.
3. Drug Behandling af dyrkede celler
Bemærk: Multiple sekventiel eller overlappende, er mulige medicinske behandlingsmetoder. De lægemidler, doser / koncentrationer og varigheder af eksponering anvendes, vil afhænge af den specifikke eksperiment.
- Fjerne det oprindelige vækstmedium 16 Bemærk: Det er vigtigt, at hver uafhængig replikat (almindeligvis en enkelt plade med 24 brønde kultur) indeholder det samme fælles kontrol tilstand. Dette vil tillade normalisering af data på tværs af replikater, som korrigerer for variabilitet mellem retssagen.
- Inkubér cellerne i de oprindelige vækstbetingelser 16 i 48 timer.
- For efterfølgende medicinsk behandling, skal du gentage trin 3.1 og 3.2 med Deltorphin 1 uM, SNC80 1 uM, eller køretøj, og inkuberes i 60 min 12. Solubilisere deltorphin II i vand og opløse SNC80 ved 10 mM i 40 uM HCI og sonikeres, fortyndes til 1 mM i vand.
Bemærk: Denne protokol antager lægemidlet (er) er blevet solubiliseret, således at de kan opløses i den ønskede koncentration (er) i det valgte vækstmedium. Passende procedurer forsådan solubilisering vil variere afhængigt af det pågældende lægemiddel og skal særskilt optimeres. - Vask cellerne forsigtigt tre gange, med ~ 1 ml vaskebuffer per vask. Udføre hver vask ved forsigtigt opsugning af væsken fra brønden, derefter straks, og forsigtigt, genpåfyldning brønden med frisk opløsning, som ønsket (i dette tilfælde med vaskebuffer).
4. Fiksering og Immuncytokemi
Bemærk: De specifikke mål mærkning vil variere ved forsøg. I vores brug, vi mærkede delta opioid receptorer (DOR) og Rab5, Rab 11, og LAMP1, som diskuteres. De specifikke antistoffer anvendes, vil afhænge af den specifikke eksperiment. Optimale mærkningsbetingelser er afhængige af det specifikke antistof (er), der anvendes. En langt mere fyldestgørende diskussion af dette emne er under.
- Fikseres cellerne ved nedsænkning i ~ 300 pi 4% paraformaldehyd i 0,1 M phosphatbufret saltvand i 10 minutter ved 37 ºC.
Bemærk: Det er vigtigt, at 4% paraformaldehyd være frisklavet grund af autofluorescens forårsaget af brugen af tidligere frosne paraformaldehyd. - Vask cellerne forsigtigt, 3 gange, med ~ 1 ml vaskebuffer pr vask som beskrevet i 3.3.
- Inkubér cellerne i 300 pi blokeringsbuffer i 2 timer ved stuetemperatur.
- Inkubere cellerne med primære antistoffer i 300 pi antistoffortynder i 48 timer ved 4 * C. I vores brug, primære antistoffer mod DOR (kanin-anti-DOR) og en af: Rab5 (muse-anti-Rab5), Rab 11 (muse-anti-Rab11), og LAMP1 (gede-anti-LAMP1).
- Vask cellerne forsigtigt tre gange, med ~ 1 ml vaskebuffer pr vask som beskrevet i 3.3.
- Inkubere cellerne med sekundære antistoffer konjugeret til forskellige fluoroforer (se diskussionen nedenfor) i 300 pi antistoffortynder i 1 time ved stuetemperatur. I denne og alle efterfølgende trin, beskytter cellerne mod lys. For at opnå de repræsentative resultater ved at bruge grønne udsender fluorophor-konjugeret anti-kanin og eithbe rød-emitterende fluorofor-konjugeret anti-muse eller rød lysemitterende fluorophor-konjugeret anti-ged.
- Vask cellerne forsigtigt, 3 gange, med ~ 1 ml vaskebuffer pr vask som beskrevet i 3.3.
- Fjern de 12-runde dækglas fra plader med 24 brønde ved at efterlade ~ 1 ml vaskepuffer i hver brønd, der holder pladen på ~ 45 °, og dækglasset løftestang ud af brønden gulvet ved hjælp af fine tænger. Dækglasset vil komme til at hvile mod brøndvæggen, hvorfra det let kan fjernes med pincet.
- Montere dækglas, celle-side-down på objektglas med anti-fading monteringsmedium.
5. Mikroskop Indstillinger
- Ved hjælp af en stor forstørrelse målsætning (100X), først finde en repræsentativ celle, der skal afbildes ved hjælp epifluorescens.
- Konfigurer billedoptagelse indstillinger for at optage 8-bit ukomprimerede TIFF-billeder af hver mærket kanal (til påvisning af hver fluorophor bruges f.eks, 488 nm og 594 nm), til billedet hver kanal sekventielt (enten ved linje eller ramme), og til de gennemsnitlige 4 til 6 scanner efter det endelige billede. Optimal billedopløsning vil være mikroskop-specifik, men 1024 x 1024 typisk giver gode resultater.
- Skift til konfokal billeddannelse sti og fokus til en z-plan gennem midten af cellen.
- Optimere pinhole (typisk 1 Airy enhed), laser power, og fotomultiplikatorrør spænding (forstærkning) og offset for hver kanal. Gem / registrere disse indstillinger. Brug de samme mikroskop indstillingerne for billeddannelse alle cellerne mærket for enhver given målpar i samme gentagelse.
Bemærk: Denne proces vil normalt medføre tilstrækkelig fotoblegning, at denne celle ikke skal afbildes til analyse.
6. Imaging
- Anvendelse af en høj forstørrelse mål (f.eks 100X), først finde en celle, der skal afbildes under anvendelse af epifluorescens.
- Skift til konfokal billeddannelse sti og fokus til en z-plan gennem midten af cellen. Jegf rådighed, bruge software zoom / afgrøde at begrænse scanningsområdet til cellen af interesse.
- Tage billeder for hver mærkede kanal ved hjælp af de indstillinger, der tidligere er etableret. Gentag trin 6.1 til 6.3 omhandlede af billedet 15 eller flere celler pr betingelse per gentagelse at sikre en tilstrækkelig prøve.
7. colokalisering Analysis
- Åbn par billeder (fx "grøn" og "rødt") i en celle i ImageJ. Brug Image> Farve> Flet Kanaler ... kommando til at generere et RGB-billede.
- Tegn en markering omkring cellen af interesse. Brug ImageJ plugin "PSC colokalisering" (11; tilgængelig fra https://www.cpib.ac.uk/tools-resources/software/psc-colocalization-plugin/) at kvantificere colokalisering af målene i den markerede celle.
- Optag det ønskede colokalisering foranstaltning (typisk Pearsons r 17). Gentag trin 7,1-7,3 for hver afbildet celle. 8. data Normalisering
- Beregn gennemsnittet af de registrerede co-lokaliseringstoppe værdier af de almindelige betingelser for hver kontrol gentagelse af hver mærkning tilstand.
Bemærk: For eksempel gennemsnittet af de co-lokaliseringstoppe værdier af neuroner i "48-hr køretøj, 60-min køretøj" drug tilstand i hver af 3 uafhængige gentagelser i hver af 3 mærkningsbetingelser (receptor og hver af 3 rum). - Multiplicer midlerne ved (-1) til opnåelse af forskydningen for hver gentagelse i hvert mærkning tilstand. Tilføj offset for hver replikere i hvert mærkning stand til hver colokalisering værdi i dette kopiere.
Bemærk: Dette vil normalisere data, således at den gennemsnitlige colokalisering foranstaltning til fælles kontrol betingelse er 0 i hver gentagelse af hver mærkning tilstand. - Samle dataene fra alle replikater af hver mærkning tilstand.
Bemærk: Ændringer i colokalisering kan nu analyseres på tværs gentagelser. Statistisk analysis vil afhænge af eksperimentelle design, men vil typisk involvere analyse-of-variansanalyse (ANOVA) efterfulgt af passende post-hoc test (f.eks Tukey). Til statistiske ressourcer, se fx 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med denne teknik er det muligt at kvantificere ændringer i receptor efter internalisering trafficking følgende både kroniske / langvarig og akutte medicinske behandlingsmetoder. Efter medicinsk behandling, fiksering og mærkning, er i høj opløsning to-kanals mikrofotografier fanget i hver celle af interesse. Repræsentative billeder kan kombineres med falske farver colokalisering at generere illustrative tal (figur 1). Efterfølgende colocalizational analyse, som beskrevet, udbytte kvantitative snesevis af target-target colokalisering (f.eks receptor-rum markør). Disse data kan derefter anvendes til at sammenligne ændringer i, i dette tilfælde, receptor handel induceret af lægemiddelbehandling (s) (figur 2).
Figur 1. Repræsentative mikrofotografier af receptor og rum-markør mærkning med false-color co-lokaliseringstoppe kort. Primære kulturer af dorsalrodsganglier sensoriske neuroner blev udsat for langvarig (48 timer) og akut (1 time) medicinsk behandling (venstre akse labels). Kun en langvarig tilstand er vist som repræsentative resultater. Cellerne blev derefter immunolabeled for delta opioid receptorer (DOR) og en markør for genanvendelse endosomer (Rab 11) med tydelig primær-sekundær (fluorophor konjugeret) antistof par (øverste akse etiketter). Cellerne blev afbildet ved to-kanals sekventiel konfokal mikroskopi (venstre kolonne, midterste kolonne). Repræsentative billeder viser de to mærkede mål i to neuroner. Et neuron blev behandlet med forlænget morfin efterfulgt af akut køretøj (øverst). Den anden neuron blev behandlet med forlænget morfin efterfulgt af akut deltorphin II (DELT, en DOR agonist, nederst). Foruden efterfølgende kvantitativ colocalizational analyse blev disse repræsentative billeder bearbejdes til at generere falske farver co-lokaliseringstoppe kort (højre kolonne). Scale barer show 10 um. Tilpasset fra 12 i henhold til CC BY-NC 3.0. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Kvantitative co-lokaliseringstoppe resultater kan anvendes til at sammenligne ændringer i receptor efter internalisering trafficking. Primære kulturer af dorsalrodsganglier sensoriske neuroner blev eksponeret for forlænget (48 timer) og akutte (1 time) lægemiddelbehandlinger (x-akse etiketter). Kun en langvarig tilstand er vist som repræsentative resultater. Cellerne blev derefter immunolabelled for DOR og markører for tidlige endosomer, genbrug endosomer og lysosomer. Efter billeddannelse co-lokaliseringstoppe scoringer blev bestemt, normaliseret, og samles på tværs 3 - 4 uafhængige gentagelser. Data blev derefter analyseret ved to-vejs variansanalyse (ANOVA) med Tukeys HSD post-hoc. Data er præsenteret som middelværdi +/- 95% konfidensinterval. * Betegner p <0,05. Som det fremgår, denne teknik tillod identifikation af ændringer i DOR post-internalisering handel induceret ved akut behandling med deltorphin II, men ikke SNC80 (to forskellige DOR-agonister). Tilpasset fra 12 i henhold til CC BY-NC 3.0. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har optimeret denne protokol til analyse af primære kulturer af voksne dorsale ganglie-neuroner (primære sensoriske neuroner). Den kan også anvendes, med ringe eller ingen ændring, for monolag-belagte dyrkede celler bredt. Den colocalizational analyse er også muligt i vævssnit og andre sådanne præparater 11, men komponenterne narkotikabehandling og vævsfiksering / forberedelse ville ikke være hensigtsmæssigt.
Af interesse, kan også anvendes ICC metoder præsenteres her med passende fiksering og forberedelse væv, til at udføre dobbelt-mærket immunhistokemi i vævssnit, uanset efterfølgende analyse (fx 19).
Denne protokol er i store træk forenelig med forskellige mål mærkning. Hvert dækglas af udpladede celler vil være dobbelt-mærket. Typisk vil dette være for receptoren af interesse og en markør for en af rummene af interesse. Dervil typisk være flere mærkningsbetingelser for at undersøge receptor colokalisering med flere forskellige rum.
Antistoffer er i sagens natur variabel. Passende mærkning protokoller vil variere mellem forskellige antistoffer. Dette omfatter passende antistofkoncentrationer, buffer opskrifter og tidspunkter. Det skal også bemærkes, at forskellige partier af det samme antistof er bedst som forskellige antistoffer. Som sådan bør mærkningsmetoder og antistofspecificitet valideres, og om nødvendigt optimeret, for hver kombination af antistof og målvæv. De metoder, der anvendes her er et nyttigt udgangspunkt. Når validering mærkning, er det vigtigt at udføre passende kontrol: dette omfatter prøver behandlet uden tilsætning af sekundære antistoffer (for at kontrollere for autofluorescens) og uden primære antistoffer (til kontrol for ikke-specifik sekundær mærkning).
Der er mange faktorer, der påvirkerudformning af mærkningsmetoder. Nogle betragtninger af note påvirker metoderne præsenteret her omfatter anvendelse af Tris-buffere, hypertonisk saltvand, Polysorbat, BSA og koldt fiskehudsgelatine. Phosphatpuffere kan forårsage højere uspecifik mærkning og kan interagere med nogle mindre anvendte antistofkonjugater. Men Tris-buffere er, som bemærket, temperaturfølsomt. Hypertoniske saltkoncentrationer reducerer uspecifik mærkning ved at afbryde ioniske interaktioner. Det er muligt at øge saltkoncentrationer over, hvad der er specificeret i denne protokol, hvis det ønskes. Polysorbat 20 anvendes som en relativt mild tensid / detergent. Dette foretrækkes frem for Triton X-100, som er blevet rapporteret at væsentligt forstyrre eller endog opløses, membraner og derved forvride subcellulær struktur. Medtagelsen af lav-koncentration Polysorbat 20 i alle bufferne er nyttig til reduktion af ikke-specifik mærkning, da det forbedrer grundigheden af vaske. BSA er en almindeligt anvendt blokeringsmiddel bestemtat besætte ikke-specifikke proteinbindingssteder i målvævet. Nogle har rapporteret, at BSA kan aggregere og føre til ikke-specifik punktformet mærkning. Hvis dette problem opstår, er det muligt at erstatte BSA med fedtfri tørmælk eller yderligere kold fiskehudsgelatine. Kold fiskehudsgelatine er et ikke-pattedyr proteinkilde også til formål at besætte ikke-specifikke proteinbindingssteder mens det viser lav reaktivitet til antistoffer rettet mod pattedyrproteiner 20.
Selv om det ikke er specificeret i denne protokol, er det typisk at tilføje, at det blokerende buffer, normalt serum fra de arter, hvor det sekundære antistof blev rejst. Typiske koncentrationer er 1 - 3 ud%. Som omtalt nedenfor, skal omhu i udvælgelsen arter udnyttes for at undgå krydsreaktiviteter.
Når der detekteres to eller flere fluorescens-mærkede mål, valget af passende fluoroforen kombinationer er særlig vigtig. Det er vigtigt at have en god spektral SEPAration for at undgå krydstale. Yderligere vil valget af fluoroforer afhænge af konfigurationen af mikroskopet skal anvendes (tilgængelige filtre, laserlinier, etc.). Fluorophor-konjugeret antistof leverandører vil tilbyde rådgivning om de bedste kombinationer af deres produkter (f.eks 21). Vi finder 488 nm- og 594 nm-begejstrede fluoroforer at være bedst par til double-mærkning og colocalizational analyse.
Sekundære antistoffer typisk arter-reaktive. Det vil sige, de vil mærke nogen antistoffer produceret af målarterne. Dobbelt-mærkning ICC kræver derfor, at man være omhyggelig med at vælge værten arter af de primære og sekundære antistoffer for at undgå krydsreaktivitet. For eksempel, hvis primærvalgene er rejst i kaniner og geder, ville det ikke være hensigtsmæssigt at anvende en ged-hævet sekundært. Hvis antistof tilgængelighed ikke tillader en sådan art separation, er der protokoller til rådighed til at udføre mærkning med multiple samme-værten primære antistoffer (fx 22), bør dog kunne forventes væsentligt mere optimering og validering.
Da denne metode kvantificerer colokalisering i mikrofotografier, er det fundamentalt nødvendigt, at alle mikroskopi være konsekvent, af høj kvalitet, og nøjagtigt repræsentative for de afbildede prøver. Dette omfatter både den anvendte hardware (optik kvalitet, etc.) og de særlige procedurer og parametre valgt. Der er gode ressourcer til rådighed for vejledning i passende mikroskopi 23,24, herunder mikroskopi specielt til colocalizational analyse 11,17,25.
Skønt af betydelig metodologisk overlegenhed til visuelle overlay metoder, behøver kvantitative mål for colokalisering ikke så pænt egner sig til generering af illustrative tal for offentliggørelse. Sådanne illustrative tal er ofte nyttige for læserne og deres fravær kan kritiseret af reviewers. Vi har fundet, at optagelsen af falske farver "heatmaps 'visualisere colokalisering at være nyttige i at konstruere figurer. Den ImageJ plugin "colokalisering farvekort" (tilgængelig fra https://sites.google.com/site/colocalizationcolormap/) er nyttig i at generere disse billeder. Det er vigtigt at bemærke, at disse billeder ville være strengt illustrative i forbindelse med den her beskrevne teknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra CIHR (MOP394808) og en Canada Research Chair til CMCEWO var modtageren af en Post-Graduate Scholarship fra NSERC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503-500G | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888-500G | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 258148 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma Aldrich | G7041-100G | |
| Corning Costar Cell Culture Plates: 24-well | Fisher Scientific | 720084 | |
| 12 circle Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 1254580 | |
| Aqua/Poly-Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | S9638-500G | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | S9763-500G | |
| Paraformaldehyde | Polysciences | 00380-1 | |
| Dumont #5 Forceps - Standard/Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Rabbit anti-DOR antibody | MyBioSource | MBS316175 | Used at 1:1,500 |
| Mouse anti-Rab5 antibody | Sigma Aldrich | R7904 | Used at 1:750 |
| Mouse anti-Rab11 antibody | Millipore | 05-853 | Used at 1:500 |
| Goat anti-LAMP1 antibody | Santa Cruz | SC8098 | Used at 1:750 |
| Donkey anti-rabbit Alexa 488 conjugated antibody | Life Technologies | A-21206 | Used at 1:200 to 1:2,000 |
| Goat anti-mouse Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11005 | Used at 1:200 to 1:2,000 |
| Donkey anti-goat Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11058 | Used at 1:200 to 1:2,000 |
References
- Drake, M. T., Shenoy, S. K., Lefkowitz, R. J.
- Hanyaloglu, A. C., von Zastrow, M. Regulation of GPCRs by endocytic membrane trafficking and its potential implications. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48, 537-568 (2008).
- Hislop, J. N., von Zastrow, M. Role of ubiquitination in endocytic trafficking of G-protein-coupled receptors. Traffic. 12 (2), 137-148 (2011).
- Nagi, K., Piñeyro, G. Regulation of opioid receptor signalling: implications for the development of analgesic tolerance. Mol. Brain. 4 (1), 25 (2011).
- Whistler, J. L., Enquist, J., et al. Modulation of postendocytic sorting of G protein-coupled receptors. Science. 297 (5581), 615-620 (2002).
- Von Zastrow, M. Regulation of opioid receptors by endocytic membrane traffic: mechanisms and translational implications. Drug Alcohol Depend. 108 (3), 166-171 (2010).
- Milan-Lobo, L., Whistler, J. L. Heteromerization of the µ- and δ-opioid receptors produces ligand-biased antagonism and alters µ-receptor trafficking. J. Pharmacol. Exp. Ther. 337 (3), 868-875 (2011).
- Wang, H. -B., Guan, J. -S., Bao, L., Zhang, X. Distinct subcellular distribution of delta-opioid receptor fused with various tags in PC12 cells. Neurochem. Res. 33 (10), 2028-2034 (2008).
- Scherrer, G., Tryoen-Tóth, P., et al. Knockin mice expressing fluorescent delta-opioid receptors uncover G protein-coupled receptor dynamics in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (25), 9691-9696 (2006).
- He, S. -Q., Zhang, Z. -N., et al. Facilitation of µ-opioid receptor activity by preventing δ-opioid receptor-mediated codegradation. Neuron. 69 (1), 120-131 (2011).
- French, A. P., Mills, S., Swarup, R., Bennett, M. J., Pridmore, T. P. Colocalization of fluorescent markers in confocal microscope images of plant cells. Nat. Protoc. 3 (4), 619-628 (2008).
- Ong, E. W., Xue, L., Olmstead, M. C., Cahill, C. M. Prolonged morphine treatment alters δ opioid receptor post-internalization trafficking. Br. J. Pharmacol. 172 (2), 615-629 (2014).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. a Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
- Rozenfeld, R., Gupta, A., Devi, L. A. Cell surface targeting of mu-delta opioid receptor heterodimers by RTP4. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (41), 16045-16050 (2008).
- Gupta, A., Mulder, J., et al. Increased abundance of opioid receptor heteromers after chronic morphine administration. Sci. Signal. 3 (131), ra54 (2010).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J. Vis. Exp. (65), 1-7 (2012).
- Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
- Field, A., Miles, J., Field, Z. Discovering Statistics Using R. , SAGE Publications. Los Angeles, CA. (2012).
- Mattioli, T. -A. M., Milne, B., Cahill, C. M. Ultra-low dose naltrexone attenuates chronic morphine-induced gliosis in rats. Mol. Pain. 6, 22 (2010).
- Vogt, R. F., Phillips, D. L., Henderson, L. O., Whitfield, W., Spierto, F. W. Quantitative differences among various proteins as blocking agents for ELISA microtiter plates. J. Immunol. Methods. 101 (1), 43-50 (1987).
- The Molecular Probes Handbook. Johnson, I., Spence, M. , Life Technologies. Carlsbad, CA. (2010).
- Morris, T. J., Stanley, E. F. A simple method for immunocytochemical staining with multiple rabbit polyclonal antibodies. J. Neurosci. Methods. 127 (2), 149-155 (2003).
- Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. , Springer. New York, NY. (2006).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. J. Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena. Acta Histochem. Cytochem. 40 (4), 101-111 (2007).
