Summary
Tráfico receptor modula a sinalização celular e a capacidade de resposta a ligandos e é, em si, que respondem a condições de células, incluindo a sinalização induzida por ligando. Aqui, descrevemos uma técnica poderosa e flexível para avaliar quantitativamente o tráfico receptor induzida por drogas utilizando imunomarcação ea análise colocalizational.
Introduction
Receptores, especialmente receptores acoplados a proteína G (GPCRs), são rotineiramente tráfico intracelularmente, de e para a superfície da célula 1. Estes processos complexamente orquestradas e rigidamente controlados ditar complementos de receptores disponíveis das células e regulam a atividade do receptor temporais, a dessensibilização, e ressensibilização 2-4. Mais importante, estes processos são sensíveis a ambientes celulares, incluindo a actividade do receptor induzida por drogas ou inactividade. Isto é, as acções de ligandos nos receptores podem alterar o tráfico intracelular desses receptores, alterando desse modo a capacidade de resposta celular. Desta forma, ligantes externos exercer ainda mais efeitos sobre a função das células, mesmo para além clássicos mensageiro-a-efetoras cascatas 5,6.
Examinando tais mudanças no tráfico receptor induzida é difícil. Todas as técnicas disponíveis envolvem limitações. Ensaios de protecção de Biotina foram usadas para monitor receptores de superfície populações. Estes receptores são biotinilados e um curso temporal de imunoprecipi tacões é realizada para quantificar a redução em receptores biotinilados ao longo do tempo. Esta técnica essencialmente monitora a degradação progressiva de um inicial, marcado, a população de receptores 7, e é muito útil na construção de campos de tempo deste processo. Infelizmente, este ensaio não é capaz de monitorar qualquer outro processo de degradação do conjunto inicial de receptores, tais como a internalização, reciclagem, ou novos receptores. Além disso, a adição de um anticorpo na gama de 150kDa para um receptor na gama de 50 kDa pode alterar o tráfico do receptor de 8,9, e esta técnica podem ser difíceis de usar com receptores de baixa nível de expressão.
Outros procedimentos usar vários métodos para identificar compartimentos de tráfego intracelular (por exemplo, endosomes, etc.) e avaliar a sua co-localização com os receptores de interesse. Isto inclui os EUAe de sistemas heterólogos que expressam a proteína fluorescente-etiquetados construções quiméricas dos receptores e marcadores compartimento (GTPases por exemplo, Rab-familiares). Isso potencialmente permite o uso de imagens ao vivo de células, removendo questões relacionadas com a fixação e permeabilização. Enquanto poderosa, tal estratégia sofre das mesmas limitações dos sistemas heterólogos em geral: tag e nível de expressão de efeitos no tráfico de comportamento e incompatibilidade com tipos de células mais fisiologicamente representativos. Mais popularmente, corantes são utilizados para marcar facilmente compartimentos intracelulares (por exemplo, lisossomos, ostensivamente) 10. Corantes, no entanto, pode faltar especificidade (todos os organelos acidicos, no caso de corantes para lisossomas) e não avaliam o tráfico através de outros compartimentos. Ainda assim, estas técnicas permitem um controle considerável sobre o sistema e as condições experimentais e podem beneficiar os métodos de análise de co-localização aqui apresentados, abaixo.
O método we presentes aqui refina o rastreamento do tráfico receptor por co-localização. Usando imunocitoquímica (ICC) para rotular os marcadores apropriados, é possível identificar os múltiplos compartimentos intracelulares distintos. Isto também permite a utilização de culturas de células primárias fisiologicamente relevantes no lugar de sistemas heterólogos. Este protocolo envolve ICC, que fixa as células de interesse antes da marcação; isso permite rotulagem em um ponto de tempo específico após o tratamento (s) droga. Isso produz um "instantâneo" das associações compartimentos receptor globais naquele ponto no tempo. Com vários momentos, um timecourse de alterações de tráfego também podem ser construídos.
Resumidamente, as células são tratadas com droga, marcado para o receptor e o compartimento intracelular de interesse, confocally fotografada, e as fotomicrografias são analisados matematicamente para quantificar a co-localização do receptor e do compartimento 11. No nosso uso, examinámos a co-localização de um receptor com Rab5, Rab11, e lisossomais-associado proteína de membrana 1 (LAMP1). Estes marcadores identificar endosomes cedo, endosomes reciclagem, e os lisossomos, respectivamente. Estas medidas co-localização atuar como proxies para os processos abrangentes de internalização, reciclagem e degradação 12.
Tal como acontece com todas as técnicas, algumas limitações devem ser consideradas. Devido à necessidade de imagem cada neurónio individuais analisados, esta técnica pode tornar-se bastante trabalhoso, dependendo do número de condições e pontos de tempo envolvidos. Todos imunomarcação também devem lidar com os efeitos sobre a ultra-estrutura celular, localização de proteínas, e acessibilidade epitopo causados pela fixação e permeabilização 13.
Embora originalmente otimizado para uso com culturas primárias de neurônios sensoriais primários, este método é amplamente compatível com outros modelos de cultura banhado a monocamada.
O uso de um MEASUR quantificados matematicamentee de co-localização é, nomeadamente, muito mais metodologicamente rigorosas do que as técnicas anteriores utilizados para avaliar alterações de tráfego receptor, que muitas vezes dependiam de medidas vagos, subjetivos, como visualmente inspecionados sobreposições multi-canal 14.
Esta técnica é particularmente útil devido à sua grande compatibilidade com in vivo intervenções (antes da geração de cultura primária), in vitro intervenções (durante o crescimento da cultura), e uma variedade de rotulagem como alvo 15. Como tal, ele pode ser adaptado a muitas perguntas de investigação diferentes.
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Protocol
Nota: Este protocolo é amplamente compatível com vários modelos banhados a monocamada de células / tecidos cultura, os regimes de tratamento de drogas e metas em matéria de rotulagem. Assim, em utilização real, muitos parâmetros específicos variam de acordo com delineamento experimental. Aqui, as referências a esses parâmetros definidos pelo usuário são genéricos. Condições exemplo, como utilizado para obter os resultados representativos, são incluídas em itálico.
1. Soluções
- Preparar o tampão de lavagem através da mistura de 0,1 M Tris-tamponada hipertónica (300 mM) Salino e 0,05% de polissorbato 20; pH 7,4 à temperatura ambiente.
- Preparar um tampão de bloqueio. Para a 0,05 M Tris-tamponada hipertónica (300 mM) Salino adicionar 0,05% de Polissorbato 20, 3% de albumina de soro bovino (BSA) e 0,1% de gelatina de pele de peixe fria e ajustar o pH a 7,4 à temperatura ambiente.
- Prepare diluente de anticorpo através da adição de 0,05% de Polissorbato 20, 1% de BSA, 0,1% de gelatina de pele de peixe fria a 0,05 M de Tris-tamponada hipertónica (300 mM) de solução salina e ajustar o pH para 7,4 a 4 o C.
Nota: O pH de tampões Tris é dependente da temperatura. Isto é, uma mudança na temperatura irá alterar o pH da solução. Por razões de consistência, estes tampões de pH deve ser sempre ajustada à temperatura à qual eles vão ser utilizados.
2. Cultura celular
Nota: Os protocolos de cultura de células apropriadas irão variar com base no tipo (s) de células utilizado. Estes procedimentos devem ser otimizados separadamente. Metodologias de cultura de células detalhadas estão disponíveis, incluindo 16. Um procedimento semelhante foi utilizado para obter os resultados representativos, com as diferenças notáveis:
- Cultura neurônios do gânglio dorsal raiz de animais adultos como descrito 12. Use meio de crescimento adulto-neurônio a cultura das células. Reduzir a densidade de células da glia por preplating, em vez de glutamato. Isso resulta em uma cultura neurónio-glia mista cultivadas em 12-lamelas de vidro redondas com, pelo menos, 30-60 neurónios por placa e que acompanham as células gliais cultivadas para approximately confluência de 40%. Deve notar-se que os neurónios em cultura primária não irá replicar e será empurrado para fora da placa por glia co-cultivadas se as células gliais são deixadas crescer excessivamente. A fim de evitar afectar os neurónios, redução física do número gliais é preferível a métodos farmacológicos químicas /.
Nota: Para os fins do presente protocolo, assumimos que as células de interesse são cultivadas para sua experimentalmente desejado estado e banhado a monocamada. Nós achamos que plaqueamento em 12-redondas lamelas de vidro em placas de 24 poços para ser mais conveniente. Todos os volumes e os procedimentos descritos são apropriados para uma lamela em um poço de uma placa de 24 poços.
3. Drogas Tratamento das células em cultura
Nota: seqüencial múltipla, ou sobreposição, tratamentos medicamentosos são possíveis. As drogas, as doses / concentrações, e durações de exposição utilizado dependerá da experiência específica.
- Remover o meio de crescimento original é 16 Nota: É importante que cada repetição independente (geralmente um único de 24 poços de cultura placa) contêm a mesma condição de controlo comum. Isto irá permitir a normalização dos dados através das repetições, que corrige a variabilidade inter-julgamento.
- Incubam-se as células nas condições de crescimento original de 16 para 48 h.
- Para tratamentos com medicamentos seguintes, repita os passos 3.1 e 3.2 com deltorfina 1 PM, SNC80 1 �, ou veículo e incubar durante 60 min 12. Solubiliza-deltorfina II em água e solubilizar SNC80 a 10 mM em 40 uM HCl e sonicado, diluiu-se a 1 mM em água.
Nota: Este protocolo assume a droga (s) foram solubilizados de tal modo que eles podem ser dissolvidos na concentração (ões) desejada no meio de crescimento escolhido. Procedimentos adequados paratais solubilização variará dependendo do fármaco em causa e deve ser optimizado separadamente. - Lavam-se as células cuidadosamente, três vezes, com ~ 1 ml de tampão de lavagem por lavagem. Executar cada lavagem por aspiração suave do líquido a partir do poço, então, prontamente e suavemente, reenchendo o poço com solução fresca, como desejado (neste caso, com tampão de lavagem).
4. Fixação e Immunocytochemistry
Nota: Os objectivos específicos de rotulagem variam de acordo com experiência. Em nosso uso, nós marcado delta receptores opióides (DOR) e Rab5, Rab 11, e LAMP1, como discutido. Os anticorpos específicos utilizados dependerá da experiência específica. Condições óptimas de rotulagem são dependentes do anticorpo específico (s) utilizado. Uma discussão muito mais completa desse tópico é abaixo.
- Fixar as células por imersão em ~ 300 ul de 4% de paraformaldeído em 0,1 M de solução salina tamponada com fosfato durante 10 min a 37 ºC.
Nota: É importante que o parágrafo 4%formaldeído ser preparada devido à autofluorescência causada pelo uso de paraformaldeído previamente congelados. - Lavam-se as células cuidadosamente, três vezes, com ~ 1 ml de tampão de lavagem por lavagem, como descrito em 3.3.
- Incubar as células em 300 ul de tampão de bloqueio durante 2 horas à TA.
- Incubar as células com anticorpos primários em 300 ml de diluente de anticorpo para 48 horas a 4 ºC. Em nosso uso, os anticorpos primários contra DOR (coelho anti-dor) e um dos seguintes: Rab5 (mouse anti-Rab5), Rab 11 (mouse anti-Rab11), e LAMP1 (cabra anti-LAMP1).
- Lavam-se as células cuidadosamente, três vezes, com ~ 1 ml de tampão de lavagem por lavagem, como descrito em 3.3.
- Incubam-se as células com anticorpos secundários conjugados com fluoróforos diferentes (ver discussão abaixo) em 300 ul de diluente de anticorpo durante 1 hora à TA. Neste, e todos os passos subsequentes, proteger as células da luz. Para obter os resultados representativos, use verde-emitting anti-coelho e eith fluoróforo conjugadoer um fluoróforo-conjugado anti-ratinho-emissor de vermelho ou vermelho-emitting fluoroforo conjugado de anti-cabra.
- Lavam-se as células cuidadosamente, três vezes, com ~ 1 ml de tampão de lavagem por lavagem, como descrito em 3.3.
- Retirar as lamelas 12-redondas de placas de 24 poços, deixando ~ 1 ml de tampão de lavagem em cada poço, segurando a placa em ~ 45º, e alavancar a lamela do chão bem usando uma pinça fina. A lamela venha a assentar contra a parede do poço, de onde ele pode ser facilmente removido usando os fórceps.
- Monte o lamelas, célula-side-down, em lâminas de microscópio com anti-desbotamento meio de montagem.
5. Configurações Microscópio
- Usando um objetivo grande aumento (100X), primeiro localizar uma célula representante para ser fotografada usando epifluorescência.
- Defina as configurações de captura de imagem para gravar 8 bits imagens TIFF não comprimidos de cada canal marcado (para detecção de cada fluoróforo utilizado, por exemplo, 488 nm e 594 nm), a imagem de cada canal em seqüência (ou por linha ou frame), ea média de 4 a 6 varreduras para a imagem final. Resolução de imagem ideal será específica do microscópio, mas 1024 x 1024 normalmente produz bons resultados.
- Mudar para o caminho de imagem confocal e concentrar a um plano z através do centro da célula.
- Otimizar pinhole (tipicamente uma unidade de Airy), potência de laser, e tensão de tubo fotomultiplicador (ganho) e deslocamento para cada canal. Salvar / gravar essas configurações. Use as mesmas configurações de microscópio para imagiologia todas as células marcadas para qualquer par alvo dada na mesma repetição.
Nota: Este processo geralmente resultam em fotodegradação suficientes de que este celular não deve ser trabalhada para análise.
6. Criação de Imagens
- Utilizando uma objectiva de ampliação elevada (por exemplo, 100x), primeiro localizar uma célula a ser trabalhada utilizando epifluorescência.
- Mudar para o caminho de imagem confocal e concentrar a um plano z através do centro da célula. EUf disponível, zoom software uso / safra para restringir a área de digitalização para a célula de interesse.
- Capturar imagens para cada canal marcado usando as configurações previamente estabelecido. Repita os passos 6.1 a 6.3 para a imagem 15 ou mais células por condição por repetição para assegurar uma amostra suficiente.
7. Análise de co-localização
- Abra o par de imagens (por exemplo, 'verde' e 'vermelho') de uma célula em ImageJ. Use a Imagem> Cor> Mesclar Canais ... comando para gerar uma imagem RGB.
- Desenhe uma seleção em torno da célula de interesse. Use o ImageJ plugin "PSC co-localização" (11; disponível a partir de https://www.cpib.ac.uk/tools-resources/software/psc-colocalization-plugin/) para quantificar as metas de co-localização na célula selecionada.
- Grave a medida co-localização desejada (tipicamente r de Pearson 17). Repita os passos de 7,1-7,3 para cada célula fotografada. 8. Normalização de dados
- Calcula-se a média dos valores registados de colocalização as condições de controlo comuns de cada réplica de cada condição de rotulagem.
Nota: Por exemplo, a média dos valores de co-localização de neurónios no "veículo de 48 horas, veículo de 60 min" condição da droga em cada uma das três repetições independentes em cada uma das três condições de rotulagem (receptor e cada um dos compartimentos 3). - Multiplicar os meios por (-1), para se obter o deslocamento para cada replicado em cada condição de rotulagem. Adicione o deslocamento para cada replicar em cada condição de rotulagem para cada valor de co-localização em que replicar.
Nota: Isto irá normalizar os dados de tal forma que a medida co-localização média para a condição de controlo comum é 0 em cada repetição de cada condição de rotulagem. - Reúnem-se os dados de todas as repetições de cada condição de rotulagem.
Nota: Alterações na co-localização podem agora ser analisado em repetições. Anal estatísticaysis dependerá de concepção experimental, mas tipicamente envolverá a análise de variância (ANOVA) seguido por testes post-hoc apropriados (por exemplo, teste de Tukey). Para obter recursos estatísticos, ver, por exemplo, 18.
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Representative Results
Usando esta técnica, é possível quantificar mudanças no receptor tráfico de pós-interiorização seguintes ambos os tratamentos com drogas crônicas / prolongada e agudas. Após os tratamentos de drogas, fixação e rotulagem, de alta resolução microfotografias de dois canais são capturados de cada célula de interesse. Imagens representativas podem ser combinadas com co-localização de cores falsas para gerar figuras ilustrativas (Figura 1). Colocalizational análise subsequente, conforme descrito, deu contagens quantitativas de co-localização de destino-alvo (por exemplo, receptor-marcador compartimento). Estes dados podem então ser utilizados para comparar mudanças na, neste caso, o tráfico do receptor induzida pelo tratamento (s) droga (Figura 2).
Figura 1. microfotografias representativos de rotulagem receptor eo compartimento marcador com falMapas de co-localização se-cor. culturas primárias de gânglios da raiz dorsal neurônios sensoriais foram expostas a prolongada (48 horas) e aguda (1 hr) tratamentos com medicamentos (etiquetas eixo esquerdo). Apenas uma condição prolongada é mostrado como resultados representativos. As células foram então immunolabeled para receptores opióides delta (DOR) e um marcador de endossomas de reciclagem (11 Rab) com distintos primário-secundário (conjugado fluoróforo) pares de anticorpos (etiquetas eixo superior). As células foram fotografadas por microscopia de dois canais sequencial confocal (coluna da esquerda, coluna central). Imagens representativas mostrar os dois alvos marcados em dois neurônios. Um neurônio foi tratado com morfina prolongada seguida de veículo aguda (superior). O outro neurónio foi tratado com morfina prolongada seguida de deltorfina aguda II (DELT, um agonista DOR; parte inferior). Além da análise quantitativa colocalizational posterior, estas imagens representativas foram processados para gerar mapas de co-localização de cores falsas (coluna da direita). Barras de escala shoW 10 um. Adaptado a partir de 12 de acordo com as disposições do CC BY-NC 3.0. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. pontuações co-localização quantitativas pode ser usado para comparar as alterações no tráfico de receptores pós-interiorização. Culturas primárias de gânglios da raiz dorsal neurônios sensoriais foram expostas a prolongada (48 h) e (1 hr) tratamentos com drogas agudas (rótulos do eixo x). Apenas uma condição prolongada é mostrado como resultados representativos. As células foram depois imunomarcadas para DOR e marcadores de endossomas precoces, endossomas e lisossomas, reciclagem. Depois de pontuação co-localização de imagem foram determinadas, normalizada, e partilhados com 3-4 repetições independentes. Os dados foram então analisados por análise de duas vias da variância (ANOVA) com HSD post-hoc de Tukey. Os dados são apresentados como média +/- intervalo de confiança de 95%. * Indica p <0,05. Como é evidente, esta técnica permitiu a identificação de alterações em Dor pós-tráfico internalização induzidas pelo tratamento agudo com deltorfina II, mas não SNC80 (dois agonistas diferentes DOR). Adaptado a partir de 12 de acordo com as disposições do CC BY-NC 3.0. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Nós otimizamos este protocolo para a análise de culturas primárias de adultos neurônios do gânglio da raiz dorsal (neurônios sensoriais primários). Ele também pode ser usado, com pouca ou nenhuma modificação, para células de cultura em monocamada banhado a amplamente. A análise colocalizational também é possível em fatias de tecido e outras preparações 11, no entanto os componentes de tratamento de droga e a fixação do tecido / de preparação não seria adequado.
De interesse, os métodos ICC apresentados aqui também pode ser usado, com fixação adequada e preparação do tecido, para realizar imunohistoquímica de marcação dupla em fatias de tecido, independentemente da análise subsequente (por exemplo, 19).
Este protocolo é amplamente compatível com diferentes metas de rotulagem. Cada lamela de células plaqueadas será duplamente marcada. Tipicamente, este será para o receptor de interesse e um marcador de um dos compartimentos de interesse. Látipicamente serão múltiplas condições de marcação, a fim de examinar uma co-localização do receptor com múltiplos compartimentos diferentes.
Os anticorpos são inerentemente variável. Protocolos de rotulagem adequadas irão variar entre diferentes anticorpos. Isto inclui as concentrações apropriadas de anticorpo, receitas, e intervalos de tempo de amortecimento. Deve também ser notado que diferentes lotes da mesma são melhor anticorpo considerado para ser anticorpos diferentes. Como tal, os métodos de rotulagem e a especificidade do anticorpo deve ser validado, e, se necessário optimizada, para cada combinação de anticorpo e de tecido alvo. Os métodos usados aqui são um ponto de partida útil. Ao validar a rotulagem, é importante para realizar os controlos adequados: isso inclui amostras processadas sem a adição de anticorpos secundários (para controlar autofluorescência) e sem anticorpos primários (para controlar a rotulagem secundária, não específica).
Existem muitos factores que influenciam oconcepção de métodos de marcação. Algumas considerações de nota que afecta os métodos aqui apresentados incluem o uso de tampões Tris, solução salina hipertónica, Polissorbato, BSA e gelatina de pele de peixe fria. Tampões de fosfato pode causar rotulagem superior não-específica e pode interagir com alguns conjugados de anticorpos menos utilizadas. No entanto, os tampões Tris são, como se referiu, sensível à temperatura. Hypertonic concentrações de sal reduzir a rotulagem não específica por perturbar interacções iónicas. É possível aumentar ainda mais as concentrações de sal para além do que é especificado neste protocolo, se desejado. Polissorbato 20 é utilizado como um agente tensioactivo relativamente suave / detergente. Isto é preferível a Triton X-100, o que tem sido relatado para perturbar significativamente, ou mesmo dissolvem, membranas, distorcendo assim a estrutura subcelular. A inclusão de baixa concentração de Polissorbato 20 em todos os buffers é útil na redução da marcação não-específica, uma vez que melhora o rigor de lavagens. A BSA é um agente de bloqueio utilizada destinapara ocupar locais de ligação não específica de proteína no tecido alvo. Alguns têm relatado que a BSA podem agregar e conduzir a rotulagem ponteada não específica. Se este problema surgir, é possível substituir BSA com leite seco não gordo ou gelatina de pele de peixe frio adicional. Gelatina de pele de peixe fria é uma fonte de proteínas de não-mamíferos também se destina a ocupar os locais de ligação de proteína não específica, enquanto que apresenta baixa reactividade a anticorpos dirigidos contra proteínas de mamífero 20.
Embora não seja especificado no presente protocolo, é típico para adicionar, para o tampão de bloqueio, soro normal das espécies em que o anticorpo secundário foi levantada. As concentrações típicas são de 1 - 3%. Como discutido abaixo, cuidado na seleção das espécies deve ser exercido para evitar reacções cruzadas.
Quando a detecção de dois ou mais alvos marcados fluorescentemente, a escolha das combinações apropriadas fluoróforo é particularmente importante. É essencial ter boa sepa espectralração, a fim de evitar a interferência. Além disso, a escolha dos fluoróforos irá depender da configuração do microscópio para ser usado (filtros disponíveis, linhas de laser, etc). Fluoróforos fornecedores de anticorpos irá oferecer conselhos sobre as melhores combinações de seus produtos (por exemplo, 21). Encontramos 488 NM- e 594 nm-fluorophores animado para ser o melhor par para a rotulagem de casal e análise colocalizational.
Anticorpos secundários são tipicamente espécies reactivas. Ou seja, eles vão rotular quaisquer anticorpos produzidos pelas espécies-alvo. Portanto, duas vezes rotulagem ICC exige que ser tomado cuidado na escolha das espécies hospedeiras dos anticorpos primários e secundários, a fim de evitar a reatividade cruzada. Por exemplo, se as primárias são produzidos em coelho e cabra, não seria apropriado usar um secundário levantou-cabra. Se a disponibilidade de anticorpos não permite essa separação espécies, existem protocolos disponíveis para realizar a rotulagem com multipos anticorpos primários do mesmo hospedeiras le (por exemplo, 22), que deve ser esperado substancialmente mais optimização e validação.
Como este método quantifica colocalização nas fotomicrografias, é fundamentalmente necessário que todos microscopia ser consistente e de alta qualidade, e com precisão representativos das amostras de imagens. Isto inclui tanto o hardware utilizado (qualidade óptica, etc.) e os procedimentos e os parâmetros específicos escolhidos. Existem excelentes recursos disponíveis para orientação sobre microscopia apropriado 23,24, incluindo microscopia especificamente para análise colocalizational 11,17,25.
Apesar da superioridade metodológica considerável de métodos de sobreposição visuais, medidas quantitativas de co-localização não tão bem se prestam à geração de figuras ilustrativas para publicação. Tais figuras ilustrativas são muitas vezes útil para os leitores e sua ausência pode ser criticado por reviewers. Descobrimos que a inclusão de falso-cor visualizando co-localização 'heatmaps' para ser útil na construção de figuras. O plugin ImageJ "co-localização mapa de cores" (disponível a partir de https://sites.google.com/site/colocalizationcolormap/) é útil para gerar estas imagens. É importante notar, no entanto, que estas imagens seria estritamente ilustrativos no contexto da técnica aqui descrita.
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Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por uma concessão do CIHR (MOP394808) e um Research Chair Canadá para CMCEWO foi o destinatário de uma Bolsa de Pós-Graduação do NSERC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503-500G | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888-500G | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 258148 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma Aldrich | G7041-100G | |
| Corning Costar Cell Culture Plates: 24-well | Fisher Scientific | 720084 | |
| 12 circle Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 1254580 | |
| Aqua/Poly-Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | S9638-500G | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | S9763-500G | |
| Paraformaldehyde | Polysciences | 00380-1 | |
| Dumont #5 Forceps - Standard/Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Rabbit anti-DOR antibody | MyBioSource | MBS316175 | Used at 1:1,500 |
| Mouse anti-Rab5 antibody | Sigma Aldrich | R7904 | Used at 1:750 |
| Mouse anti-Rab11 antibody | Millipore | 05-853 | Used at 1:500 |
| Goat anti-LAMP1 antibody | Santa Cruz | SC8098 | Used at 1:750 |
| Donkey anti-rabbit Alexa 488 conjugated antibody | Life Technologies | A-21206 | Used at 1:200 to 1:2,000 |
| Goat anti-mouse Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11005 | Used at 1:200 to 1:2,000 |
| Donkey anti-goat Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11058 | Used at 1:200 to 1:2,000 |
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