Abstract
תכונות אלקטרו של תאים לעתים קרובות למדו במבחנה, לאחר מתנער מהם הסביבות האם שלהם. עם זאת, המחקר של הולכה חשמלית בין תאים מרוחקים באורגניזם דורש in vivo, הקלטות ללא ממצא של תאים המוטבעים בתוך הסביבה הטבעית שלהם. השידור של אותות חשמליים מפצועים לאזורים הלא-פצועים במפעל מאז ארוך מעורר את העניין של בוטנאים. השיפה, החלק החי של כלי דם הצמח שהתפשט ברחבי המפעל, כבר הניח כרקמה גדולה בשידור חשמל במפעלים. חוסר שיטות אלקטרו המתאימים מציב אתגרים רבים לחקר התכונות החשמליים של תאי השיפה in vivo. כאן אנו מציגים גישה חדשנית לאלקטרופיזיולוגיה תאית של אלמנטים מסננת (SES) המשתמשת בכנימות חיים, או חרקים hemipteran השיפה האכלה אחרים, משולבת בהגר"א החדירה החשמליph מעגל (EPG). צדדיות, החוסן, והדיוק של שיטה זו אפשרו להקליט וללמוד בפירוט את האותות חשמליים הנוצר על-הפצע בSEs של ורידים של thaliana ארבידופסיס צמח מודל 1 מרכזיים. כאן אנו מראים כי EPG-אלקטרודות יכולות להיות מיושמות בקלות לקלטות אלקטרו תאיות של SES בעורקים שוליים, כמו גם ללמוד את היכולת של SES להגיב באותות חשמליים לכמה גירויים חיצוניים. גישת EPG להחיל אלקטרופיזיולוגיה תאית של SES יכולה להיות מיושמת למגוון רחב של מיני צמחים, במספר רב של שילובי צמחים / חרקים, ועבור רבים מחקר המטרה.
Introduction
היכולת לייצר אותות חשמליים למרחקים ארוכים היא תכונת יתרון של אורגניזמים רב-תאיים, המאפשרת לתגובות יעילים לגירויים חיצוניים. תכונה זו התפתחה באופן עצמאי בצמחים ובעלי חיים, ובכך מייצגת מקרה של אבולוציה מתכנסת. בהתחשב בכך שאותות חשמליים בשילוב עם פונקציות חשובות בבעלי חיים כגון העברת עצבית והתכווצות שרירים, בסיס המולקולרי, מנגנון של העברת, ופונקציה של אותות חשמליים הנוצר על-גירוי בבעלי חיים הם נושאים של מחקר אינטנסיבי. בניגוד לכך, איתות חשמלית מושרה גירוי בצמחים זכתה לתשומת לב מחקרית קטנה. למרות שיש לי צמחים אין עצבים או שרירים, נראה שיש מספיק ראיות כדי להניח שאותות חשמליים הנוצר על-הגירוי בצמחים לשחק תפקיד מפתח בתגובותיהם לגורמים סביבתיים.
השיפה, מרכיב החיים של כלי דם המפעל, כבר הניח כמשנה עיקריstrate להעברת אותות חשמליים הנוצר על-גירוי, מגירוי / פגומה לאזורי מגורה שאינם / ניזוק 2. התאים העיקריים בהשיפה הם אלמנטים המסננת (SES), תאים פשוטים יחסית, מוארכים. הקצוות של SES מחוברים לSEs האחר, ויצרו נמוכה התנגדות מתמשכת,, מערכת צינור מסננת שהתפשטה ברחבי המפעל. יש, עם זאת, מעט מאוד מחקרים על התכונות חשמליות של תאים מאוד מיוחדים אלה. במחקרים הקודמים אלה, חוקרי הגישה SEs גם עם זכוכית מיקרו-אלקטרודות 3 stylets או הוכנס-לשתול עם אלקטרודות זכוכית שמצמידות את כנימות, לאחר stylectomy (חיתוך) 4. microelectrodes הזכוכית עשוי מזכוכית נימים שהם משכו בקצה אחד עם חום לקצה קנס של פחות מ 1 מיקרומטר בקוטר, ולאחר מכן מלאה עם פתרון KCl. חוט Ag / AgCl או פלטינה, מוכנס לתוך אלקטרודת הזכוכית מלאה-KCl אז מחובר לכניסת המגבר, ורפרנטאלקטרודה מוכנסת לתוך האמבטיה המקיפה את התא של עניין, השלימה המעגל. התקנה זו מתעדת את ההבדל בפוטנציאל בין האלקטרודה תאי הרפרנט ואלקטרודה המדידה תאית, כלומר, פוטנציאל הממברנה של התא 5. בשיטה זו, Umrath עשה ההקלטה תאית הראשונה מתא צמח, באמצעות Nitella אצות 6,7. Nitella הוא אורגניזם פשוט יחסית עם תאים גדולים, ולכן נוח לניסויי אלקטרופיזיולוגיה תאיים. לעומת זאת, ההכנסה של אלקטרודות זכוכית תאיות לתוך התאים הקטנים של צמחים רב-תאי, תלת-ממדיים של כדור הארץ היא תובענית מבחינה טכנית, דורשת חוקר מיומן, כמו גם להדמיה מתוחכמת, מיקרומניפולציה, וציוד נגד רעידות. למרות אלקטרודות זכוכית מתאימות כדי להקליט מהתאים שטחיים בצמחים, כגון תאי האפידרמיס שורש 8, recordin תאיתGS מהתאים מוטבע עמוק ברקמה של הצמח, כגון SES, תגובות הנגרמים נזק סיבה סבירה מאוד, מבלבל את התוצאות. בשנת 1989, פרום וEschrich דיווחו על השימוש בשיטה חלופית, שנקראו "שיטת הכנימה ', שבו אלקטרודות זכוכית הם מצמידים לstylets כנימה לאחר stylectomy 4. שיטת הכנימה היא פולשנית, כי stylets גמיש לא לגרום נזק לרקמות או תאים כאלקטרודות זכוכית לעשות. stylets הכנימה הוא ההמצאה הגדולה של הטבע לחדירת צמח, וכנימות הן הרבה יותר מאשר בני אדם מיומנות במציאת SES. למרבה הצער, שיטה זו היא גם כנימה תובענית ביותר במונחים של מומחיות וציוד טכניים. בנוסף, ההצלחה של כל ניסוי שמיישם טכניקה זו תלויה לחלוטין בלהיות במצב האכלת כנימה - עם stylet הוכנס ביציבות לSE, בעת stylectomy. חשיבה ברטרוספקטיבית, אפשר לראות שהסיכויים הצלחה של טכניקה זו היו יכולים להיות שליmproved על ידי הוספה להגדרת ניסוי מכשיר המאפשר זיהוי או לא stylet הכנימה הוא בSE בעת החלת stylectomy.
בשנת 1964, מקלין וקינסי תיארו "מערכת ניטור אלקטרונית" לחקר התנהגות ההאכלה של כנימות בזמן אמת 9,10. במערכת זו, הכנימה והצמח-חדר stylet שולבו מעגל חשמלי. מאוחר יותר, בשנת 1978, Tjallingii המציא גרסה שונה של המערכת, הנקרא מערכת "חשמל חדירה גרף" (EPG) 11,12. בעוד מערכת הניטור האלקטרונית המקורית הייתה רגישה לפוטנציאלים-מקור התנגדות בלבד, עם מערכת ה- EPG, כוח electromotive (EMF) שמקורה פוטנציאלים, כלומר, שנוצרו במפעל או בחרקים, יכולים להיות מוקלטים, בנוסף לפוטנציאל הנובע מ התנגדות (R) בחרקים. זה מייצג שיפור חשוב, משום ששניהם אות הרכיבים, EMF וR,לספק מידע רלוונטי ביולוגי על אירועים במהלך חדירת מפעל על ידי כנימות. מה עושה קדם מגבר EPG רגיש לR-הרכיבים הוא התנגדות הקלט הנמוכה יחסית של 1 GΩ, שהוא קרוב לממוצע של התנגדות צמח / כנימה. מתח היסט קטן (איור 1, V) בסך של כ +100 mV מוחל על הצמח, אשר לאחר מכן מחולק על פני צמח וחרקים בצד אחד, והתנגדות הקלט בצד השני. המתחים ושינוייהם נמדדים בנקודה (איור 1 א ', ב') בין החרקים ונגד הקלט. לכן, R-הרכיבים מייצגים אפנון התנגדות צמח-כנימה של מתח ההיסט, ואילו EMF-הרכיבים הם חלק מסוים של פוטנציאלי צמח בקצה stylet ופוטנציאלים שנגרמו בחרקים. פוטנציאלי הצמח - הרלוונטיים ביותר כאן - הם פוטנציאל בעיקר קרום של תאי הצמח ניקבו ידי stylets הכנימה. פוטנציאלי החרקים נראים בעיקרפוטנציאל הזרמה נגרמת על ידי תנועות נוזל בתוך שתי תעלות stylet, כלומר, מזון ותעלות הרוק; אין פוטנציאלי עצב או שריר פנימיים נרשמים בEPG. בפועל, פונקציות קצה stylet כקצה האלקטרודה. כל תאי הצמח טעונים שלילי בתוך ביחס למחוץ החיובי של התא. הזרם החשמלי (כלומר, התנועה של יונים טעונים בתמיסה מימית) זורמים מבפנים ללהיפך מחוץ וסגנו מאוד מוגבל בשל העמידות הגבוהה של קרום התא. בדרך כלל פוטנציאל המנוחה נשמר קבוע. עם זאת, כאשר יונים שליליים לצאת או יונים חיוביים לעבור דרך קרום התא, את פוטנציאל הקרום מופחת, כלומר, זה depolarizes '. שלילת קוטביות מתרחשת במקרה של עירור תא. יונים ולאחר מכן לעבור פנימה או החוצה כאשר תעלות יונים מסוימות בקרום נפתחות או כאשר הקרום פגום ויונים לדלוף פנימה והחוצה. כל התאים תעלות יונים ומשאבות בtהוא פלזמת קרום שיביא את פוטנציאל הממברנה לרמת המנוחה שלה על ידי שחזור הריכוז המקורי של יונים שונים בתוך התא. פוטנציאל המנוחה והשינויים שלה הם רכיבי EMF, ולכן, טכניקת EPG מתאימה למדוד אותם.
איור 1. EPG-אלקטרודות. EPG-אלקטרודה היא כנימת חיים משולבת במעגל חשמלי חדירה גרף (EPG), stylet שמוכנס לתוך אלמנט מסננת (SE) במצב האכלה יציב. אם SE-משופד stylet הוא במנוחה (פנל), המתח במעגל, שנרשם על ידי EPG, יציב וברמת מתח המנוחה (לוח C, מנוחה). אם SE הוא נרגש, depolarizes הקרום (לוח ב '), שהיא דמיינה בEPG כמו עלייה הדרגתית במתח (פנל C, שלילת קוטביות). כאיזון היוני בSE חוזר לנוח, כלומר, זה repolarizes, המתח נרשם על ידי EPG יורד בהדרגה לרמת פוטנציאל המנוחה (לוח C, repolarization). בפנל C, "" ו "B" מתייחסים לתרחישים המוצגים בלוחות A ו- B, בהתאמה. V = מקור מתח היסט מתכוונן. הר"י = נגד קלט. במקביל לנגד החיצוני 1 GΩ, יש המגבר 1.5 נגד TΩ (לוחות A ו- B, באפור) גבוהים פנימי (בopamp). בשלט רחוק של המתג מראש מגבר EPG יכול להיות שונה מרגיל לEMF-מצב, המאפשר קבלת ערכי מתח מדויקים ביותר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
בחלק הבא, אנו מספקים את הקורא עם פרוטוקול בסיסי לביצוע ניסויי EPG שתקף לשני מחקרים המתמקדים בחרקים וממוקדים-צמח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. בכנימות לתי-פוסקת
הערה: הבחירה של מיני צמחים וכנימה להקלטות EPG תלויה במטרת המחקר. למחקרים על thaliana ארבידופסיס, brassicae Brevicoryne הכנימה הוא מתאים.
- האחורי ב כנימות brassicae בחממה על כרוב בר. שמור את הצמחים המשמשים לגידול כנימה בכלובים, כדי למנוע זיהום צמחים אחרים. שמור צמחי גידול-כנימה וצמחים ניסיוניים (בoleracea מקרה ב 'שלנו וא thaliana) בחדרים נפרדים, כדי למנוע זיהום של מפעלים ניסיוניים עם כנימות.
- העבר את הכנימות לצמחים טריים על כל 2 שבועות, לפני שגרם נזק משמעותי צמח, או להגיע התפוצצות אוכלוסין. העבר 10-20 כנימות בוגרות למפעל גידול טרי ליזום מושבה חדשה.
- צג גידול צמחים באופן קבוע לזיהום על ידי מינים לא רצויים כנימה, אוכלי עשב חרקים אחרים, טפילי כנימה, וFungאני שעשוי להשפיע על הבריאות של המושבה הכנימה.
- לאסוף מבוגרת, כנימות כנפיים עד שבוע לאחר נשירתם הסופית להקלטת EPG.
- לאחר הניסויים, להחזיר את הצמחים הניסיוניים שלא היו רגיל לתא הצמיחה, כפי שלעתים קרובות יש להם כמה צאצאים שהופקו במהלך ההקלטה, שלא מדעת יכולה לזהם צמחים אחרים.
2. חרקים חיווט להקלטת EPG
- כדי להפוך אלקטרודות חרקים, להשיג הפינים פליז (ציפורניים, מ"מ Ø 1.2), חוטי נחושת דקים (O 0.2 מ"מ), חוט זהב דק מאוד (בערך Ø 20 מיקרומטר), דבק כסף על בסיס מים, בורג קטן הלחמה פשוטה עם נוזל הלחמה וחוט הלחמה-אבקי שרף, סטראו עם הגדלה 10X, מספריים קטנים או אזמל, שני מלקחיים עדינים, וגיליון קלקר או תיבה. הערה: מיקסר מערבולת עשוי להיות שימושי. הערה: פרוטוקול צעד-אחר-צעד כדי להפוך אלקטרודות מופיע באיור 2.
- לכנימהטיפול ויישום דבק, להשיג: מברשת צמר גמלי צבעי מים קטנה ורכה (גודל 2 או קטן יותר) וסיכות חרקים כגון אלו המשמשים לאוספים חרקים, למרות שמחט תפירה עדינה או קיסם יכולה לעבוד גם כן. שלב 4 מראה כיצד להתחיל בהקלטת EPG.
- שלב 1.
הערה: שלבי 1 ו -2 להלן מראים כיצד להכין אלקטרודות חרקים מינוס הכנימה. שלב 3 מראה כיצד להתחבר כנימה לאלקטרודה. קיבעון אבק של הכנימה מומלץ בחיווט, אבל לא תמיד נדרש למינים איטיים נעו (למשל, ב brassicae).- הפעל את בורג ההלחמה ולהמס כמה חוט הלחמה בקצה (איור 2 א) שלה. להרטיב את הראש של סיכת מחבר פליז עם כמה נוזל הלחמה (איור 2) וטובל אותו במתכת ההלחמה נמסה (איור 2 ג).
- החל נדן של מתכת מותכת הלחמה בקצה אחד של פיסה ארוכה של 1-2 סנטימטר של החוט נחושת הדק (איור2D). אז להביא את חוט הסיכה ונחושת יחד נגד הבורג החם (איור 2E) ולהעביר אותם יחד משם להתקרר ולחזק (איור 2F).
- שלב 2.
- ביסודיות לנער (או מערבולת) הבקבוקון עם דבק כסף לכמה דקות, עד שתחליב חלק מוצג. Cut (מספריים או סכין מנתחים) כמה חתיכות של חוט הזהב (בסך של כ 1.5 ס"מ אורך) על צלחת האובייקט של סטראו (איור 2G).
- קח סיכת פליז עם חוטי נחושת מולחמים (שנעשו בסעיף 2.3) ולטבול את הקצה החופשי של חוטי הנחושת לתוך מאגר הדבק הקטן הכסף שאסף בבתוך המכסה של הבקבוקון לאחר פתיחתו (איור 2H). הערה: יש צורך רק טיפה קטנה.
- הזז את הקצה טבל דבק של חוטי הנחושת לחתיכת חוט זהב, תוך הרמת קצה אחד כדי למנוע מריחה של הדבק לצלחת אובייקט סטראו. נסה חפיפה copper וחוט זהב לכמה מ"מ (איור ט 2), הפצת הדבק לאורך החפיפה של שני חוטים.
- חכה עד שהדבק כבר מיובש מספיק כדי לשמור על החוטים מאוחדים. בדוק את קשר הדבק לאחר הייבוש ולהוסיף קצת דבק טרי עם סיכה קטנה או פיסת החוט נחושת אחרת אם חלקים מסוימים של החוטים הצטרפו להראות חלקים ללא דבק.
- לאחר האלקטרודה החרקים מוכנה, לאחסן אותו, לדוגמא מוכנסת לתוך חתיכת הקלקר.
הערה: אורכו של חוט הזהב יקבע את חופש תנועה של הכנימה: אם הוא קצר מדי (פחות מ -5 מ"מ), הכנימה עלולה להרגיש מוגבלת ולא התנהג בצורה נורמלית; אם זה ארוך מדי (> 2 סנטימטר), הכנימה תהיה לנוע בחופשיות. כנימות נוטות לעבור לצד adaxial של עלים, אם מותר. אם חוט הזהב נוגע העלה, האות תהיה קצרה חשמלית.
- שלב 3.
- הכנימה עשויה להישמר במקום באמצעות יניקת אור, באמצעות ואקום; במקרה זה, לא להתקיןהוא יניקת מכשיר תחת סטראו. מניחים את פתיחת היניקה במרכז השדה.
- ביסודיות לנער את הבקבוקון עם דבק כסף לכמה דקות (או מערבולת) עד תחליב חלק נוצר. לאסוף כנימה עם המברשת הקטנה.
- הפעל את מכשיר היניקה והר הכנימה על פתיחת היניקה (איור י 2), עם החלק האחורי של הבטן הפך לנסיין. עם המברשת העדינה, להסיר כל שעוות משטח מהבטן (בשפע בכנימות כרוב).
- פתח את בקבוקון הדבק ולהרטיב סיכה עם טיפה קטנה מאוד של דבק כסף (איור 2K). החל הטיפה של דבק הכסף על הגב של הבטן של הכנימה (איור 2L-M). בואו אגל זה יבש לחלוטין במשך כמה דקות, במרץ לנער את בקבוקון הדבק שוב ולהוסיף טיפה שנייה של דבק כסף על גבי הראשון. שים לב: בעוד דבק הכסף הוא מוליך חשמלי, הוא אינו גורם משמעותינזק לציפורן של החרק.
- לאחר סגירת בקבוקון הדבק, הכנס את הקצה החופשי של חוט הזהב לתוך אגל הרטוב ולשמור על החוט עדיין תוך מתן אפשרות לדבק להתייבש לחלוטין (איור 2N). הימנע מריחת דבק על רגליים או אנטנות וזורקי כנימה אם זה קרה.
- כבה את מכשיר קיבוע היניקה ולהרים את החרק (איור 2 טו) בזהירות. במידת צורך, להשתמש במברשת עדינה כדי לסייע בהסרת הכנימה ממכשיר היניקה.
הערה: חיווט ב brassicae אינו דורש ואקום, כפי שהם יכולים להיות חוטית על פיסת רקמת מעבדה דיוק, המשטח מחוספס של שמספקת כנימה עם מספיק אחיזה, כך שזה לא יהיה הרים לאחר החלת ירידה של דבק רטוב לבטן שלה. לאחר ייבוש דבק אחד יכול להרים את הכנימה מהרקמה בעזרת מברשת עדינה. - הכנס את סיכת פליז עם החרקים קווי לקלקר ואם יש צורך, להמשיךחיווט כל חרקים האחרים שישמש להקלטת EPG.
הערה: פרוטוקולים אלה לחיווט כנימות לעבוד גם עבורנו. המשתמש יכול למצוא / שיטתו שלו לחיווט כנימות.
- שלב 4.
- לשים צמחים בכלוב פאראדיי (איור 2P) על תמיכה שאינה מוליכה: להשתמש צלחות פטרי או צלחת זכוכית או פלסטיק.
- הכנס אלקטרודה צמח באדמה של כל סיר. הכנס את סיכת הנחושת של החרקים קווי למחבר הקלט של הקדם-מגבר EPG (איור 2Q). הערה: את האלקטרודה הקרקע אינה מתאים לאלקטרודה הקרקע משמשת בטכניקות אלקטרו אחרות. יש לו את מתח היסט צורך להתאים ולפצות על מתחי קיטוב אלקטרודה.
- בממשק של התוכנה + stylet רכישה, עם תדר דגימה קבוע של 100 הרץ, הזן שם קובץ, ציין את זמן ההקלטה, ולכתוב טקסט כדי לציין את הפרטים של הניסוי (טיפול, צמח / inse מיני CT, וכו ') בשורות הערה 2 ו -3.
- מנמיכים את החרקים על אזור נחיתה מתאים של הצמח ולהתחיל בהפעלת ההקלטה על ידי לחיצה על הכפתור התחל של רכישת תוכנת ממשק (stylet +).
הערה 1: מקסימום של 8 ערוצים ניתן להשתמש בו זמנית בEPG להגדיר. ניתן להשתמש באחד EPG-אלקטרודה או כמה EPG-אלקטרודות לכל צמח.
הערה 2: כאשר המוקד של המחקר הוא כנימת ההתנהגות, להתחיל את ההקלטה לפני גישת מפעל של הכנימות, כדי למנוע חסר פעילויות חדירת המפעל הראשונות. - ללימוד תגובות אלקטרו של SES לגירויים, להמתין לפחות 10 דקות לאחר הכנימה נכנסה לשלב השיפה, כדי להבטיח שהכנימה נמצאת בשלב בליעת השיפה מתמשך, וכי בסיס האות הוא יציב. רק אז, מתחיל כל ניסוי גירוי צמח.
tp_upload / 52,826 / 52826fig2.jpg "/>
איור 2. ביצוע EPG-אלקטרודות עם כנימות או חרקים אחרים לhemipteran גרף חדירה חשמלי (EPG) הקלטות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
לוחות AI, צעדים הנדרשים כדי להכין EPG-אלקטרודות מינוס הכנימה. ראשית, להמס חתיכת הלחמת מתכת על קצה בורג הלחמה (). לאחר מכן, לטבול את הראש של סיכת פליז לירידה של נוזל הלחמה (ב '), וליצור קשר עם אותו עם המתכת המותכת בקצה בורג הלחמה (C). מייד לאחר שלב זה, פנה לסוף החוט נחושת ועד לקצה של בורג ההלחמה, כדי להדביק אותו לראש של סיכת פליז (EF). עם אזמל או להב, לחתוך חתיכה של חוט הזהב (G). טובליםאת הקצה החופשי של חוטי הנחושת (הצטרפו בקצה השני לפין פליז) על דבק הכסף (H), ומהירות להצטרף חוט הזהב אליו (אני) לפני הכסף מתייבש. חוט הזהב הוא מנצח מצוין, ויכול להיות מקוטב. במציאות, ברוב המכריע של המקרים הקיטוב הוא קטן מדי כדי להיות מזוהה, ואם כן, זה יכול להיות מתוגמל עבור עם מתח ההיסט (V).
לוחות JO, צעדים הדרושים כדי להתחבר כנימה (או חרק hemipteran אחר) לאלקטרודה. ראשית, להרים בזהירות כנימה עם מברשת צבעי מים עדינה ומניח אותו על הפתיחה של מכשיר שאיבת ואקום (J). הפעל את משאבת הוואקום ולכסות את חור שסתום האוויר עם פיסת נייר ליישם יניקה. טובלים את הקצה של סיכת החרקים לדבק הכסף (K), ולשים טיפת דבק קטנה על גבי הבטן של הכנימה, תחת סטראו (LM). בתוך ה~ 20 שניות הבאות, לפני שאגל דבק כסף על מתייבש הכנימה, הכניסו את הקצה של חוט הזהב של האלקטרודה החרקים לתוך אגל הרטוב של דבק כסף, ולשמור אותו במקום 1-3 דקות, עד שדבק הכסף יש לחלוטין (N) האוויר היבש. בשלב זה, לבטל את היניקה על ידי הסרת פיסת נייר שמכסה את חור שסתום האוויר של מכשיר השאיבה ולהסיר את הכנימה בזהירות, ממכשיר היניקה: הרמת הכנימה לאחר חיווט לעתים קרובות דורש קצת עזרה על ידי מברשת עדינה (O).
לוח P מציג סקירה של כל EPG להקים בתוך כלוב פאראדיי, ולוח Q מציג סקירה של שילוב צמח-הכנימה לEPG. ראה סעיף 2 לעיל לקבלת הסבר מפורט יותר של תהליך זה.
אותיות קטנות הן תוויות המתייחסות לפריטים שצריך לעשות EPG-אלקטרודות:: בורג הלחמה; ב: נמסה הלחמת מתכת;ג: נוזל הלחמה; ד: סיכת נחושת מחבר (מסמר); דואר: חוטי נחושת; f: חוט זהב 18μm O; ז: מכשיר יניקה; שעות: כנימה; i: דבק כסף על בסיס מים; j: כלוב פאראדיי; יא: אלקטרודה צמח; l: מחבר קלט (BNC) של טרום-מגבר EPG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במחקר קודם, שיישמנו את טכניקת EPG-אלקטרודה במטרה לאפיין את האותות החשמליים המיוצרים בSEs של midvein במהלך התקפת זחל 1. Midvein הוא אתר מועדף להחדרת אלקטרודות זכוכית קונבנציונליות, כמו גם עבור אלקטרודות הזכוכית stylet, כי זה SE-צפוף, וחזק יחסית, ולכן ניתנים לקיבוע הדרוש ליישום טכניקות אלה. כאן, אנו ניצלנו את הרבגוניות של האלקטרודה EPG במטרה איסוף מידע מאלקטרו קשה יותר לגשת SES, בפרט אלה בוורידים השוליים של עלים. איור 3 מראה EPG טיפוסי הקלטה מSE בוריד שולי של א ' מפעל thaliana, המכיל אותות חשמליים הנגרמים על ידי פציעת דיסטלי. באופן שונה מSES בורידים גדולים, SES בורידים שוליים הגיב לנזק מרחוק עם גל אחד, איטי שלילת קוטביות שעשויה מתאים לגל שלילת קוטביות איטי בSEs המרכזי. בממוצע, שלילת קוטביות איטית מושרה מרחוק זה בSEs מרווח העלה היה משך זמן ממוצע של 61 ± 27 שניות, ומשרעת ממוצע של 37 ± 2 mV (n = 3, ממוצע ± SEM). נתונים אלה, השגה בקלות עם EPG-אלקטרודות, מצביעים על כך שאותות חשמליים הנוצר על-פצע בעלים הלא-פצועים אל להתפשט מהחבילה של כלי דם הגדולה להשיפה בעורקים קטנים.
כאן אנו גם ניצלנו את חוסנו של אלקטרודות EPG, לחקור האם SE יכול להגיב לגירויים מזיקים שונים, תוך פרק זמן של סדר דקות זמן. כאשר שני עלים לגזור במספריים בצומת הפטוטרת-lamina, EPG-אלקטרודה ממוקמת בעלה בשלמותה זוהתה תגובות דומות מאותה SE לפצעים אלה (איור 4 א). בניסוי אחר, זחל שימש כסוכן הפציעה. הזחל לחתוך ראשון עלה הלא השכן, ולאחר מכן, אחרי כמה דקות, זה לא עברעלה השכן OA ולחתוך אותו גם כן. ואילו הפצע הראשון בעלה לא השכן מושרה רק שלילת קוטביות איטית חולפת, הפצע השני בעלה השכן מושרה האות החשמלי המלא המכיל איטי ושלילת קוטביות מהירה, באופן עקבי עם ניסויים קודמים 1. נתונים אלה מראים כי אלמנט מסננת יכול לזהות אירועים מרובים פציעה שנגרמו לעלים אחרים, תוך דקות אחד מהשני.
איור 3. הקלטות תאיים של אותות חשמליים הנוצר על-פצע מאלמנטים מסננת (SES) בורידים שוליים עם EPG-אלקטרודות קטע אות חשמלית חדירה גרף (EPG). בשלב האכלה-השיפה של brassicae Brevicoryne הכנימה. הכנימה המוקלטת EPG האכילה מSE ממוקם בוריד שולי של (thaliana ארבידופסיס # עלה 8, סוג בר), מוצג בקריקטורה בצד השמאל. אות EPG מציגה גל שלילת קוטביות איטי בSE השולי זמן קצר לאחר חיתוך עלה הפרוקסימלי השכן (עלה # 3). הרכיבים הקצביים, קטנים, מהירים כלפי מטה האות מייצגים את פוטנציאל הזרמה הנובע מההתרוממות הקצבית של SAP לאורך תעלת המזון של stylet בשלב הבליעה (E2 צורת גל). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. תגובות מרובות חשמל לפציעתם גירויים באלמנטים מסננת (SES) רכשו עם EPG-אלקטרודות חוסנו של הכנימה-הצמח (Brevicoryne brassicae - thaliana ארבידופסיס). אינטראקציה והיציבות של stylets הכנימה הוכנס-SE הם תכונות חשובות של EPG-electrodes המאפשר רכישה של הקלטות EPG ארוכות (שעות). כאן אנו ניצלנו ממאפיינים אלה כדי לחקור האם SE יכול להגיב לשני גירויי פציעה מרחוק. לוח מראה את התגובות של SE לשני אירועים מלאכותיים פציעה (חיתוך עלים על ידי מספריים) שנגרמו ברציפות על שני שכנים שונים משאיר. יש מרווח של כ -17 דקות בין שני הגירויים. הלוח ב 'מציג את התגובות של SE לשני אירועי פציעה טבעית ברציפות. זחל instar 4 th של הפרפר כרוב (לבנין כרוב) שימש בניסוי זה. הזחל לחתוך ראשון עלה הלא השכן (ביחס עם העלה נרשם EPG), גרימת שלילת קוטביות איטית, חולפת. לאחר מכן, כ 7 דקות מאוחר יותר, הזחל לחתוך עלה אחר השכן, שהפעיל אות כפולה שלילת קוטביות (כלומר, מכיל איטי וdepolarizations חולף מהר) בSE-רשם הכנימה. חצים מצביעים על הזמן שבו הפצעיםנגרמו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט להכנת החשמל חדירה גרף הקלטות (EPG). טכניקת EPG היא מבוססת היטב, עם 100-200 משתמשים פעילים ברחבי העולם, וזה יושם למחקרים רבים בנושאים שונים, לדוגמא: א) התנגדות צמח מארח לכנימות וחרקים נושאי stylet אחרים 13; מנגנוני תמסורת ב) וירוס צמח והפתוגן 14; ג) מצב חרקים פעולה, (שינויי רעילות והתנהגות) 15; ד) אף EPGs היה שימושי על מנת להוכיח כי קרבות כנימה הם יתרון לזוכה כפי שהוא מגביר את יעילות ההזנה שלה 16.
למידת חוט חרקים להקלטת EPG לא קשה אבל דורש סבלנות וניסיון מעשי להורים. מהפיכת אלקטרודות לחרקי קווי הסופיים, תקופת אימון של שבוע או שבועות מומלצת. במהלך תקופה זו, החוקר קראתי את עצמה / את עצמו בטיפול בנבחרמינים וחרקים כדי להמשיך דרך כל השלבים בהצלחה. צעדים קריטיים: הלחמה כראוי, לוחצים את בקבוקון דבק כסף ביסודיות לפני שלקחתי טיפת דבק בגודל הנכון - לא קטן מדי ולא גדול מדי - הבטחת חיבור חשמלי ומכאני תקין, והצבת חוט הזהב בתוך טיפת הכסף על הבטן של החרקים באופן שלא להגביל את תנועות החרק. אי לבצע את הפעולות הבאות בצורה נכונה יגרום לקישוריות חשמל עניה, אשר תגרום לנתונים באיכות ירודה או בלתי מתקבלת על הדעת. בעת מתן גישת החרקים קווית למפעל, חשוב לפקח עליהם באופן חזותי במהלך חצי השעה הראשונה של ההקלטה. במהלך תקופה זו, כנימות הם להתרגל לחוט, ועשויים להתרחק ממקום ההקלטה הרצוי, או להשיל את הצמח. לכן, אחד ייתכן שיהיה צורך למקם מחדש הכנימות בתקופה זו. במקרה של מטרות התנהגותיות, לא מחדש מיצוב צריך להיעשות לאחר שעות הראשונותאלף שעות כדי למנוע הבדלים גדולים בין משכפל. גרוע ממוקם או צריכים להיות מושלכים אנשים ירדו פעמית.
בנוסף לאספקת פרוטוקול להקלטת EPG, מאמר זה מסכם את התכונות של מעגל EPG שרלוונטיים ליישומה כשיטת באלקטרופיזיולוגיה תאית צמח (איור 1). התכונה העיקרית של EPG-אלקטרודות היא שהם מאוד אלקטרודות תא ספציפי המאפשרות להקלטות תאיות מדויקות מSES. במגבר EPG הרגיל, התנגדות הקלט היא נמוכה יחסית, GΩ 1 (10 9 Ω). בפועל, זה אומר שהתנגדות השינויים במהלך ההקלטה להשפיע על הפוטנציאל שנמדד. זה לא נושא באלקטרופיזיולוגיה תאית הקונבנציונלית עם אלקטרודות זכוכית, אשר בדרך כלל להשתמש במגברי התנגדות קלט גבוהים יותר. אפשר לתקן את השינויים בהתנגדות נובעים מקרום הפלזמה וממקורות אחרים באמצעות calibrפולסים ני, כמו באח סלבדור-Recatalà אל. 1. אפשרות נוספת היא להגדיל את התנגדות הקלט של מגבר קדם EPG הרגיל, מGΩ 1 עד 1.5 TΩ (1.5 x 10 12 Ω) או PΩ אפילו עד 1 (10 15 Ω, בהתאם opamp של הקדם-המגבר), אשר תואם את התנגדות הקלט במגברים רגילים להקלטה תאית. מגבר EPG עם התנגדות קלט גבוהה נקרא כאן כמערכת "EMF מצב EPG". במגבר הזה, מתג משבית מגבר EPG הנורמלי במצב (ראה איור 1). בEMF-מצב, שיטת EPG-אלקטרודה רושמת את פוטנציאל תא צמח בצורה מדויקת ככל מגברים הרגילים המשמשים באלקטרופיזיולוגיה תאית. ההפרעה היחידה שנותרה בEPG בEMF מצב נובעת ממרכיבי EMF של הכנימה במהלך האכלת SE, אבל אלה הם נמוכים למדי ולא מתפשרים הדיוק של המדידות. אם החוקר מבקש שיא בו זמניתתגובה של הכנימה לגורמי לחץ סביבתיים (למשל, שינויים בהפרשת ריר ובליעה) והמידע של פוטנציאל הממברנה SE, אז הנורמלי במצב של EPG מומלץ. במקרה זה, יישום הדופק המכויל מספק ערכים מקובלים, משוערים של פוטנציאל הממברנה.
חוסר השיטות המתאימות לרכישת תגובות חשמליות של כלי דם השיפה in vivo כיום מגביל את הסוג ומספר השאלות הקשורות לתגובות לחץ סביבתיות של צמחים. חוקרים יישמו אלקטרודות זכוכית 3 ואלקטרודות זכוכית stylet 4 לרכישת הקלטות תאיות בSES בmidvein. בניגוד לאלה שני סוגים של אלקטרודות, ניתן למקם EPG-אלקטרודות כמעט על כל חלק אווירי של הצמח (ואפילו על שורשים, באמצעות כנימות שורש). לכן, EPG-אלקטרודות יקלו מחקרים מקיפים יותר באלקטרופיזיולוגיה צמח. Anotיתרונה של EPG-אלקטרודות על אלקטרודות מקובלות הוא כי לשעבר תאפשר לתקופות הקלטה מורחבות, אשר מאפשרת לחקור את התגובות של SES יחיד לגירויים שונים. זוהי תכונה חשובה biophysical, ועשויה לספק מידע מעניין על איך לשלב SEs מידע מגירויים סביבתיים שונים. ואכן, הנתונים המוצגים כאן מוכיחים כי SES מגיבות לגירויים שונים מזיקים (איור 4), המצדיק מחקר נוסף על תכונת biophysical חשובה זה של SES.
מספר מחקרי אלקטרו של SES הוא קטן מדי כדי לערוך השוואות בין נתונים שנרכשו עם EPG-אלקטרודות ונתונים שהושגו עם אלקטרודות זכוכית מסורתיות. למעשה, למיטב ידיעתנו אין נתונים בספרות על אותות מושרה גירוי חשמליים בSEs של ארבידופסיס, רכשו עם שיטה מסורתית, להיות אלקטרודות זכוכית או אלקטרודות זכוכית stylet. אלקטרודות זכוכית באמצעות, רודוס ומשתפי פעולה 3 מצאו שחום גורם לקוצים כמו פוטנציאל פעולה בSEs של צמחי עגבניות. שלילת קוטביות מהירה שהם הראו לי גודל של כ -70 mV, המתרחשת על גבי שלילת קוטביות קטנה, איטית יותר. זה עולה בקנה אחד עם האותות החשמליים שלנו נרכשו על ידי EPG-אלקטרודות 1, אם כי יש להיזהר בהשוואת אותות חשמליים משני מיני צמחים שונים, ונגרם על ידי סוגים שונים של גירויים.
אלקטרודה EPG היא כלי רב-תכליתי ואלגנטי ללימוד תגובות אלקטרו של תאי השיפה לסוגים שונים של גירויים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
VSR נתמכה על ידי IIF מארי קירי גרנט (פצע באדמה, ראשי התיבות של: פצע מושרה אותות חשמליים בthaliana ארבידופסיס).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brass connector pins | EPG Systems/hardw.shop | Φ 1.2 mm | |
| Thin copper wire | EPG Systems/hardw.shop | approx. Φ 0.2 mm | |
| Thin gold wire | EPG Systems | Φ 18 µm | |
| Soldering fluid | hardware shop | matching the soldering wire | |
| Resin-cored soldering wire | hardware shop | ||
| Styrofoam | any | ||
| Water-based silver glue | EPG Systems | recipe in: www.epgsystems.eu | |
| Paper wipes | Kimberly-Clark | 5511 | |
| Soldering bolt | any | ||
| Stereomicroscope | Hund Wetzlar | minimum magnification is 10X | |
| Small scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10050-00 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Vortex | A. Hartenstein | L46 | |
| Watercolor brushes | any | Number 1 or 2 | |
| Air suction device | see description in: www.epgsystems.eu | ||
| Insect pins | any | No. 1 or 2 | |
| Solid table | |||
| Faraday cage | Hand made | ||
| Computer | Fujitsu Siemens | ||
| Data acquisition software | EPG Systems | Stylet+d | |
| Giga-4 (-8) Complete System | EPG Systems | ||
| includes the following: | |||
| Main control box with USB output | Di155/Di710 | 12/14 bit, rate 100 Hz (softw. fixed) | |
| EPG probes 4 (8) | 50x DC pre-amplifier | ||
| Swivel clamps on rod | |||
| DC power adaptor | bipolar, 230/115 VAC to -/+8 VDC | ||
| Plant electrodes and cables | |||
| Additional test and ground cables |
References
- Salvador-Recatalà, V., Tjallingii, W. F., Farmer, E. E. Real-time, in vivo. intracellular recordings of caterpillar-induced depolarization waves in sieve elements using aphid electrodes. New Phytologist. 203 (2), 674-684 (2014).
- Van Bel, A. J., Knoblauch, M., Furch, A. C., Hafke, J. B. (Questions)n on phloem biology. 1. Electropotential waves, Ca2+ fluxes and cellular cascades along the propagation pathway. Plant Science. 181 (3), 210-218 (2011).
- Rhodes, J. D., Thain, J. F., Wildon, D. C. The pathway for electrical signal conduction in the wounded tomato plant. Planta. 200, 50-57 (1996).
- Fromm, J., Eschrich, W. Correlation of ionic movements with phloem unloading and loading in barley leaves. Plant Physiology and Biochemistry. 27, 577-585 (1989).
- Brette, R., Destexhe, A.
- Umrath, K. Untersuchungen über Plasma und Plasamstromung an Characeen. IV. Potentialmessungen an Nitella mucronata. mit besonderer Berücksichtingung der Erregungserscheinungen. Protoplasma. 9, 576-597 (1930).
- Umrath, K. Der Erregungsvorgang bei Nitella mucronata. Protoplasma. 17, 258-300 (1932).
- Carden, D. E., Walker, D. J., Flowers, T. J., Miller, A. J. Single-cell measurements of the contribution of cytosolic Na+ and K+ to salt tolerance. Plant Physiology. 131 (2), 676-683 (2003).
- Miles, P. W., McLean, D. L., Kinsey, M. G. Evidence that two species of aphid ingest food through an open stylet sheath. Experientia. 20 (10), 582 (1964).
- McLean, D. L., Kinsey, M. G. A technique for electronically recording aphid feeding and salivation. Nature. 202, 1358-1359 (1965).
- Tjallingii, W. F. Electronic recording of penetration behaviour by aphids. Entomologia Experimentalis et Applicata. 24, 721-730 (1978).
- Tjallingii, W. F. Membrane potentials as an indication for plant cell penetration by aphid stylets. Entomologia Experimentalis et Applicata. 38, 187-193 (1985).
- Alvarez, E. E., et al. Comparative analysis of Solanum stoloniferum. responses to probing by the green peach aphid Myzus persicae. and the potato aphid Macrosiphum euphorbiae. Insect Science. 20 (2), 207-227 (2013).
- Carmo-Sousa, M., Moreno, A., Garzo, E., Fereres, A. A non-persistently transmitted virus induces a pull-push strategy in its aphid vector to optimize transmission and spread. Virus Research. 186, 38-46 (2014).
- Jacobson, A. L., Kennedy, G. G. Electrical Penetration Graph studies to investigate the effects of cyantraniliprole on feeding behavior of Myzus persicae. (Hemiptera: Aphididae) on Capsicum annuum. Pest Management Science. 70 (5), 836-840 (2014).
- Morris, G., Foster, W. A. Duelling aphids: electrical penetration graphs reveal the value of fighting for a feeding site. Journal of Experimental Biology. 211 (9), 1490-1494 (2008).
