Abstract
Elektrofysiologiske egenskaper av celler er ofte studert in vitro, etter dissosiering dem fra deres opprinnelige miljø. Men studien av elektrisk overføring mellom fjerne celler i en organisme krever in vivo, artefakt-free opptak av celler innebygd i sitt opprinnelige miljø. Overføring av elektriske signaler fra såret til unwounded områder i et anlegg har siden lang tid støtt interesse botanikere. Phloem, den levende del av anlegget blodkar som er spredt gjennom hele anlegget, er blitt foreslått som en viktig vev i elektrisk kraftoverføring i planter. Mangelen på egnede elektrofysiologiske metoder byr på mange utfordringer for studiet av de elektriske egenskapene til phloem celler in vivo. Her presenterer vi en ny tilnærming for intracellulære elektro av sikteelementer (SES) som bruker levende bladlus, eller andre phloem-fôring hemipteran insekter, integrert i den elektriske penetrasjon graph (EPG) krets. Allsidigheten, robustheten, og nøyaktigheten av denne fremgangsmåte gjorde det mulig å registrere og studere i detalj såret-induserte elektriske signaler i Ses av sentrale vener i modellen planten Arabidopsis thaliana 1. Her viser vi at EPG-elektroder kan lett implementeres for intracellulære elektro opptak av Ses i marginale årer, så vel som for å studere evnen til SES å reagere med elektriske signaler til flere eksterne stimuli. EPG metode anvendt på intracellulære elektro av SE kan implementeres på en rekke forskjellige plantearter, i et stort antall plante / insekt kombinasjoner, og for mange undersøkelser som mål.
Introduction
Evnen til å produsere langdistanse elektriske signaler er en fordelaktig egenskap av flercellede organismer som muliggjør en effektiv respons på ytre stimuli. Denne egenskap har utviklet seg uavhengig i planter og dyr, og er derfor en sak av konvergent evolusjon. Gitt at elektriske signaler er kombinert med viktige funksjoner i dyr så som neural overføring og muskelkontraksjon, den molekylære basis, mekanisme for overføring, og funksjon av stimuleringsinduserte elektriske signaler i dyr er fag av intensiv forskning. I kontrast, har stimulus-indusert elektriske signal i planter fikk lite forskning oppmerksomhet. Selv om plantene har ingen nerver eller muskler, synes det å være nok bevis til å anta at stimulanse-indusert elektriske signaler i planter spille en nøkkelrolle i sine svar til miljøfaktorer.
Phloem, den levende del av anlegget blodkar, har blitt foreslått som en viktig subStrate for overføring av stimulanse-indusert elektriske signaler, fra stimuleres / skadet til ikke-stimulerte / uskadde områder to. De viktigste cellene i barken er sikte elementer (SES), relativt enkle, langstrakte celler. Endene av SES er forbundet med annen SE, danner en kontinuerlig, lav motstand, sil rørsystem som er spredt gjennom hele anlegget. Det er imidlertid svært få studier på de elektriske egenskapene til disse svært spesialiserte celler. I disse tidligere studier, forskere vist SES med enten glass mikroelektroder tre eller med glass elektroder som ble koblet til plante-innsatte styleter av bladlus, etter stylectomy (kutting) 4. Glassmikroelektroder er laget av glasskapillærer som er trukket i en ende med varme i en fin spiss på mindre enn en mikrometer i diameter, og deretter fylt med en KCl-løsning. A Ag / AgCl eller platinatråd, satt inn i KCl-fylte glasselektrode blir deretter koblet til forsterkerinngangen og en referanseelektroden føres inn i badet som omgir cellen av interesse og fullfører kretsen. Dette oppsettet registrerer forskjellen i potensialet mellom det ekstracellulære referent elektroden og den intracellulære måleelektroden, det vil si, den membranpotensialet i cellen 5. Med denne metoden Umrath gjorde den første intracellulære opptaket fra en plantecelle, ved hjelp av alger Nitella 6,7. Nitella er et relativt enkelt organisme med store celler, og derfor mottagelig for intracellulære elektrofysiologiske eksperimenter. I motsetning til dette, er innsettingen av intracellulære glasselektroder i de små celler av multi-cellulære, tredimensjonale landplanter teknisk krevende, krever en meget dyktig forsker, samt sofistikerte visualisering, mikromanipulasjon, og anti-vibrasjonsutstyr. Selv om glasselektroder er egnet til å ta opp fra overfladiske celler i planter, for eksempel root epidermalceller 8, intracellulær recordings fra celler dypt forankret i anlegget vev, slik som SES, svært sannsynlig forårsake skade-indusert reaksjoner, forvirrende resultatene. I 1989 rapporterte Fromm og Eschrich bruk av en alternativ metode, som kalles den "bladlus metoden, hvor glass-elektrodene er koplet til bladlus stylets etter stylectomy 4. Aphid metoden er minimal invasiv, fordi fleksible stylets ikke forårsaker vev eller celleskade som glasselektroder gjøre. Bladlus stylets er naturens flott oppfinnelse for anleggs penetrasjon, og bladlus er betydelig mer dyktige enn mennesker med å finne SES. Dessverre er dette aphid metoden også svært krevende i form av teknisk kompetanse og utstyr. Dessuten lykkes i hvert forsøk som implementerer denne teknikken er helt avhengig av bladlus være i foringsmodus - med stilett stabilt innført i en SE, ved stylectomy. Tenker i retrospektiv, kan man se at oddsen for å lykkes med denne teknikken kunne ha vært improved ved å legge til den eksperimentelle oppsettet et instrument som gjør det mulig å identifisere hvorvidt bladlus stylet er i SE når du søker stylectomy.
I 1964, McLean og Kinsey beskrevet en "elektronisk overvåkingssystem" for studiet av fôring atferd av bladlus i sanntid 9,10. I dette systemet, ble det bladlus og stilett-penetrert anlegget integrert i en elektrisk krets. Senere, i 1978, Tjallingii utviklet en modifisert versjon av systemet, kalt "Elektrisk Penetration Graph" (EPG) system 11,12. Mens det opprinnelige elektronisk overvåkingssystem var følsom for motstands-stammer potensialer bare, med EPG-systemet, den elektromotoriske kraft (EMF) stammer potensialer, dvs. generert på planten eller i insektet, kan bli registrert i tillegg til potensialer som oppstår motstand (R) i insektet. Dette utgjør en viktig forbedring, fordi begge signalkomponenter, emf og R,gi biologisk relevant informasjon om hendelser i anlegget penetrasjon av bladlus. Det som gjør EPG forforsterkeren følsom for de R-komponentene er dens forholdsvis lave inngangsmotstand av en GΩ, som ligger nær gjennomsnittet av anlegget / bladlus motstand. En liten forskyvningsspenning (figur 1, V) på ca. 100 mV påføres på planten, som deretter er delt på tvers av plante- og insekt på den ene side, og inngangsmotstanden på den andre. Spenningene og deres endringer er målt i et punkt (figur 1A, B) mellom insekt og inngangsmotstand. Derfor R-komponentene representerer plante bladlus motstand modulasjoner av offset spenningen, mens de EMF-komponenter er en viss brøkdel av plante potensialer ved stylet tips og potensialer forårsaket i insekt. Anlegget potensialer - mest relevante her - er i hovedsak membran potensialene av plantecellene punktert av bladlus stylets. Insekt potensialer ser ut til å være hovedsakeligstrømningspotensialene forårsaket av flytende bevegelser i løpet av de to stylet kanalene, dvs. mat og spytt kanalene; ingen interne nerve eller muskel potensialer føres i EPG. I praksis stilett spissen virker som en elektrodespiss. Alle planteceller er negativt ladet på innsiden i forhold til den positive utsiden av cellen. Den elektriske strøm (dvs. den bevegelse av ladede ioner i vandig oppløsning) som strømmer fra innsiden til utsiden og omvendt meget begrenset på grunn av den høye motstand av cellemembranen. Normalt hvilepotensialet holdes konstant. Imidlertid, når negative ioner beveger seg ut eller positive ioner beveger seg i gjennom cellemembranen, er membranpotensialet redusert, det vil si, det depolariserer '. Depolarisering forekommer i tilfelle av celle eksitasjon. Ioner deretter flytte inn eller ut når bestemte ionekanaler i membranen er åpnet eller når membranen er skadet og ioner lekke inn og ut. Alle celler har ionekanaler og pumper i tHan plasmamembranen som bringer membranpotensialet til sitt hvilenivå ved å gjenopprette den opprinnelige konsentrasjonen av forskjellige ioner inne i cellen. Hvilepotensialet og dens endringer er EMF komponenter, og derfor er det EPG teknikk egnet til å måle dem.
Figur 1. EPG-elektroder. EPG-elektroden er en levende bladlus integrert inn i det elektriske Penetration Graph (EPG) krets, hvis stilett er satt inn en sikt element (SE) i stabil foringsmodus. Dersom stilett-spiddet SE er i ro (panel A), spenningen i kretsen, registrert av EPG, er stabilt og på hvilepotensial nivå (panel C, Rest). Hvis SE er spent, dets membran depolariserer (panel B), som er visualisert i EPG som en gradvis økning i spenning (panel C, depolarisering). Som ioniske balanse i SE returnerer til hvile, dvs. det repolartegner, spenningen registrert av EPG gradvis reduseres til resten potensielle nivå (Panel C, repolarisering). I panel C, "A" og "B" refererer til scenariene er vist i panel A og B, respektivt. V = Justerbar offset spenning kilde. Ri = Input motstand. Parallelt med en GΩ ekstern motstand, har en intern forsterker (i operasjonsforsterkeren) 1,5 TΩ høy motstand (panelene A og B, i grått). Med fjernkontroll av bryteren EPG pre-amp kan endres fra normal til EMF-modus, som gjør det mulig å oppnå svært nøyaktige spenningsverdier. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
I neste avsnitt, gir vi leseren en grunnleggende protokollen for å utføre EPG-eksperimenter som er gyldig for både insekt-fokusert og plante-fokuserte studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Aphid stell
Merk: Valget av plante- og bladlusarter for EPG-opptak er avhengig av forskning mål. For studier på Arabidopsis thaliana, er aphid Brevicoryne brassicae hensiktsmessig.
- Bakre B. brassicae bladlus i et drivhus på kål. Holde plantene brukes for oppdrett bladlus i bur, for å unngå kontaminering av andre planter. Hold bladlusoppdragelse planter og eksperimentelle planter (i vårt tilfelle B. oleracea og A. thaliana) i separate rom, for å unngå forurensning av eksperimentelle planter med bladlus.
- Overfør bladlus å friske planter om hver 2. uke, før forårsaker betydelig skade anlegget, eller nå overbefolkning. Overfør 10-20 voksne bladlus til en frisk oppdra anlegget for å starte en ny koloni.
- Overvåke oppdragelse planter regelmessig for forurensning av uønskede bladlusarter, annen insekt planteetere, bladlus parasitoider, og fungjeg som kan påvirke helsen til bladlus kolonien.
- Samle voksen, vingeløse bladlus opp til en uke etter deres siste molt for EPG-opptak.
- Etter forsøkene returnere eksperimentelle planter som ikke ble brukt til vekstkammeret, da de ofte har noen avkom som har blitt produsert under innspillingen, som uforvarende kan forurense andre planter.
2. Insect Kabling for EPG-opptak
- For å gjøre insekt elektroder, skaffe messing kontaktpinnene (spiker, Ø 1,2 mm), tynn kobbertråd (Ø 0,2 mm), veldig tynn gulltråd (Ø ca. 20 mikrometer), vannbasert sølv lim, en enkel liten loddebolt med lodding væske og harpiks-cored lodding wire, stereomikroskop med 10X forstørrelse, liten saks eller skalpell, to fine tang, og en isoporplate eller boks. Merk: En virvelblanderen kan være nyttig. Merk: trinn-for-trinn-protokollen for å lage elektroder er vist i figur 2.
- For aphidhåndtering og lim program, oppnå: en liten og myk akvarell camelhair pensel (størrelse 2 eller mindre) og insekt pins eksempel de som brukes for insektsamlinger, selv om en fin synål eller tannpirker kan fungere også. Trinn 4 viser hvordan du starter EPG opptak.
- Trinn 1.
Merk: Trinn 1 og 2 nedenfor viser hvordan du forbereder insekt elektroder minus bladlus. Trinn 3 viser hvordan du kobler en bladlus til elektroden. Vakuum fiksering av bladlus er anbefalt under ledninger, men ikke alltid nødvendig for saktegående art (f.eks B. brassicae).- Slå på loddebolten og smelte litt lodding tråd på spissen (Figur 2A). Fukt leder av messing konnektortappen med litt lodding væske (figur 2B) og dyppe den i smeltet loddemetall (figur 2C).
- Påfør en kappe av smeltet loddemetall på den ene enden av en 1-2 cm langt stykke av tynn kobbertråd (figur2D). Deretter ta pinnen og kobbertråd sammen mot den varme bolten (figur 2E) og flytte dem sammen bort avkjøles og stivne (figur 2F).
- Trinn 2.
- Rist (eller vortex) av flasken med sølv lim i flere minutter inntil en jevn emulsjon er vist. Cut (saks eller skalpell) et par stykker av gull wire (av ca 1,5 cm i lengde) på objektet plate av stereomikroskopet (figur 2G).
- Ta en messing pin med loddet kobbertråd (laget i avsnitt 2.3) og dypp den frie enden av kobbertråd inn i den lille sølv lim reservoaret som har samlet seg på innsiden av lokket på hetteglasset etter åpning den (figur 2 H). Merk: Bare en liten dråpe er nødvendig.
- Flytt lim-dyppet enden av kobbertråd til den del av gull wire, mens løfte den ene ende for å unngå å smøre lim på stereo gjenstanden plate. Prøv å overlappe kobbr og gull wire for noen få mm (figur 2I), fordele lim langs overlappingen av de to ledninger.
- Vent til limet har tørket nok til å holde trådene samlet. Sjekk limet kontakt etter tørking og tilsett litt frisk lim med en liten nål eller annen del av kobbertråd hvis noen deler av de sammenkoblede ledninger viser lim frie deler.
- Etter insektet elektroden er klar, lagre det, for eksempel settes inn i et stykke isopor.
Merk: Lengden på gull wire vil avgjøre bevegelsesfrihet av bladlus: hvis det er for kort (mindre enn 5 mm), aphid kan føle begrenset, og vil ikke oppføre seg normalt; Dersom den er for lang (> 2 cm), vil den bladlus bevege seg fritt. Bladlus tendens til å flytte til adaxial siden av bladene, om lov til. Hvis gull wire berører bladet, vil signalet bli kortsluttet.
- Trinn 3.
- Den bladlus kan holdes på plass ved hjelp av lys sug, ved hjelp av et vakuum; i dette tilfellet, må du installere than sugeinnretning under stereomikroskop. Plasser sugeåpningen i midten av feltet.
- Grundig rist hetteglasset med sølv lim i flere minutter (eller vortex) inntil en jevn emulsjon dannes. Samle en bladlus med den lille børsten.
- Slå på sugeenhet og montere bladlus på sugeåpningen (figur 2J), med baksiden av magen slått til eksperimentator. Med fin pensel, fjerner enhver overflate voks fra magen (rikelig i kål bladlus).
- Åpne limet hetteglass og våte en tapp med en meget liten dråpe av sølv lim (figur 2K). Påfør dråpe av sølv lim på baksiden av bladlus mage (figur 2L-M). La denne dråpen helt tørr i flere minutter, kraftig riste limet hetteglasset igjen og legge til en annen dråpe med sølv lim på toppen av den første. Merk: Mens sølv lim er en elektrisk leder, vil det ikke medføre betydeligskade på insekt i skjellaget.
- Etter stengetid limet hetteglass, setter den frie enden av gull wire inn i den våte dråpen og hold ledningen fortsatt samtidig som limet tørke helt (figur 2 N). Unngå å smøre lim på beina eller antenner og kast en bladlus om dette har skjedd.
- Slå av sugefesteanordningen og løft insekt (figur 2o). Hvis det er nødvendig, bruker du en børste til å bistå i løfting av bladlus fra sugeenheten.
Merk: Wiring B. brassicae ikke krever et vakuum, da de kan være fastmontert på et stykke av en laboratoriepresisjons vev, den grove overflate som gir bladlus med tilstrekkelig grep, slik at det ikke vil bli løftet etter påføring av en dråpe av vått lim til buken. Etter at limet tørker kan en løfte bladlus fra vevet ved hjelp av en fin pensel. - Sett messing pin med det kablede insekt inn i isopor, og hvis nødvendig, fortsetterledningsnett alle andre insekter som skal brukes for EPG opptak.
Merk: Disse protokollene for kabling bladlus fungerer bra for oss. Brukeren kan finne hans / hennes egen metode for oppkobling bladlus.
- Trinn 4.
- Sette plantene i Faraday-bur (fig 2P) på et ikke-ledende bærer: bruk Petri-skåler eller en plate av glass eller plast.
- Sett en plante elektrode i jorden av hver pott. Sett messing pin av kablet insekt inn i inngangskontakten på EPG pre-forsterker (figur 2Q). Merk: jord elektroden ikke stemmer overens med den første elektrode som brukes i andre elektrofysiologiske teknikker. Det har offsetspenningen nødvendig for å justere og kompensere for elektrodepolariseringsspenninger.
- På grensesnittet av oppkjøpet programvare Stylet +, med fast sample frekvens på 100 Hz, skriv inn et filnavn, angi opptakstiden, og skrive tekst for å spesifisere detaljene i forsøket (behandling, anlegg / inse ct arter, etc.) i Kommentar linjene 2 og 3.
- Senk insekter på en egnet landingsplass av anlegget og starter innspillingen ved å klikke på Start-knappen for oppkjøpet programvaregrensesnitt (Stylet +).
Note 1: maksimalt 8 kanaler kan brukes samtidig i en EPG satt opp. En EPG-elektrode eller flere elektroder per EPG-anlegget kan brukes.
Merknad 2: når fokus for studien er den aphid atferd, starter innspillingen før anlegget tilgang av bladlus for å unngå mangler de første anlegget penetrasjon aktiviteter. - For å studere elektrofysiologiske responser fra Ses på stimuli, vente i minst 10 minutter etter at bladlus har inngått phloem fasen, for å sikre at bladlus er i en vedvarende phloem inntak fase, og at signallinjen er stabil. Først da, begynner noen plante stimulering eksperiment.
tp_upload / 52826 / 52826fig2.jpg "/>
Figur 2. Making EPG-elektroder med bladlus eller andre hemipteran insekter for elektrisk penetrasjon graf (EPG) innspillinger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Paneler AI, trinn for å forberede EPG-elektroder minus bladlus. Først smelte et stykke av loddemetall på spissen av en loddebolt (A). Deretter dypper hodet av messing pin til en dråpe lodde væske (B), og kontakt den med smeltet metall på loddebolten spissen (C). Umiddelbart etter dette trinnet, kontakter enden av en kobbertråd med spissen av loddebolten, for å lime den til hodet på messingpinnen (EF). Med en skalpell eller et blad, skjære et stykke av gulltråd (G). Dipden frie ende av kobbertråd (forbundet ved den andre enden til messing pin) på sølv limet (H), og raskt bli gullet ledningen til det (I) før sølv tørker opp. Gullet ledningen er en utmerket leder, og kan bli polarisert. I virkeligheten er i de fleste tilfellene polariseringen er for liten til å bli detektert, og hvis så, kan det kompenseres for med offsetspenningen (V).
Paneler JO, trinn for å koble til en bladlus (eller annen hemipteran insekt) til elektroden. Først løft en bladlus med en fin akvarell pensel og plasser den på åpningen av vakuumsugeenhet (J). Slå på vakuumpumpen og dekke luftventilen hullet med et stykke papir for å bruke sugekraft. Dypp tuppen av insekt pinnen inn i sølv lim (K), og sette en liten lim dråpe på toppen av bladlus underliv, under en stereomikroskop (LM). Innenneste ~ 20 sek, før sølv lim dråpen på bladlus tørker, sett enden av gulltråd av insekt elektrode inn i den våte dråpen av sølv lim, og holde det på plass for 1-3 min, til sølv limet har helt lufttørket (N). På dette punktet, deaktivere sug ved å fjerne stykke papir som dekker luftventilen hullet på sugeenheten og fjern forsiktig bladlus, fra sugeenhet: løfte bladlus etter ledningene ofte krever litt hjelp av en fin pensel (O).
Panel P viser en oversikt over hele EPG satt opp inne i Faraday bur, og Panel Q viser en oversikt over anlegget-bladlus kombinasjon for EPG. Se punkt 2 ovenfor for en mer detaljert forklaring på denne prosessen.
Små bokstaver er etiketter henviser til sakene som man trenger å gjøre EPG-elektroder: a: lodding bolt, b: smeltet loddemetall;c: lodding væsken; d: messing kontaktpinnen (spiker); e: kobbertråd, f: Ø 18μm gull wire; g: sugeenhet, h: bladlus, jeg: vannbasert sølv lim, j: Faraday bur; k: Anlegget elektrode; l: inngangen (BNC) av EPG pre-forsterker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I en tidligere studie, gjennomførte vi EPG-elektroden teknikk med det formål å karakterisere de elektriske signaler som produseres i Ses av midvein under larven angrep 1. Den midvein er en foretrukket innføringsstedet for konvensjonelle glasselektroder, samt for glass-stilett elektroder, fordi det er SE-tett, og forholdsvis robust, derav mottagelig for fiksering som er nødvendig for å implementere disse teknikkene. Her tok vi nytte av allsidigheten av EPG elektroden med det formål å samle elektro informasjon fra mer vanskelig å få tilgang SE, særlig de i de marginale årer av bladene. Figur 3 viser et typisk EPG opptak fra en SE i en marginal vene av A. thaliana anlegg, som inneholder et elektrisk signal som induseres av distal såret. Forskjellig fra SES i store vener, SES i marginale årer svart på eksterne skader med en singel, slow depolarization bølge som kan tilsvareslow depolarization bølge i sentrale SES. I gjennomsnitt, denne fjernutløst treg depolarization i SES av bladet margin hadde en gjennomsnittlig varighet på 61 ± 27 sek, og gjennomsnittlig amplitude på 37 ± 2 mV (n = 3, gjennomsnitt ± SEM). Disse data, lett oppnåelig med EPG-elektroder, tyder på at sår-indusert elektriske signaler i unwounded blader sprer fra de store vaskulære bundle til phloem i mindre årer.
Her har vi også utnyttet robustheten EPG elektroder, for å undersøke om en SE kan svare på ulike skadelige stimuli, levert innen et tidsintervall i størrelsesorden minutter. Når to bladene ble kuttet med saks på bladstilken-lamina krysset, en EPG-elektrode plassert i en intakt blad oppdaget lignende svar fra samme SE til disse sårene (Figur 4A). I et annet eksperiment ble en gravemaskin anvendt som såret middel. Larven første kuttet en ikke-nabo blad, og så, etter noen minutter, det flyttet toa nabo blad og skjær den i tillegg. Mens den første såret i den ikke-nabo blad induserte bare en langsom forbigående depolarisering, den andre sår i naboblad indusert komplett elektrisk signal som inneholder en langsom og rask depolarisering, i overensstemmelse med tidligere forsøk 1. Disse dataene viser at en sil element kan oppdage flere såret hendelser påført til andre blader, levert i løpet av minutter fra hverandre.
Figur 3. Intracellulær opptak av sår-indusert elektriske signaler fra sikteelementer (SES) i marginale vener med EPG-elektroder. Elektrisk Penetration Graf (EPG) signal segment av phloem-fôring fase av bladlus Brevicoryne brassicae. EPG-innspilte bladlus ble det mates fra en SE ligger i en marginal vene av bladet # 8 (Arabidopsis thaliana, Vill type), vist i tegneserien til venstre. EPG signal viser en langsom depolarization bølge i marginal SE kort tid etter klipping en proksimal nabo blad (blad # 3). De rytmiske, små, nedover raske signalkomponenter representerer strømningspotensialene som kommer fra rytmisk himmelfart sap langs mat kanalen av stylet under inntak fasen (bølgeform E2). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Flere elektriske reaksjoner på såret stimuli i sikte elementer (SES) ervervet med EPG-elektroder Robust av bladlus-anlegg (Brevicoryne brassicae - Arabidopsis thaliana). Samhandling og stabiliteten i SE-innsatte bladlus stylets er viktige egenskaper for EPG-electrodes som tillater kjøp av lange EPG opptak (timer). Her tok vi nytte av disse egenskapene for å undersøke om en SE kan svare på to eksterne såret stimuli. Panel A viser svarene av et SE til to kunstige såret hendelser (blad skjæring av saks) fortløpende påført to forskjellige nabo blader. Det er et intervall på omtrent 17 min mellom de to stimuli. Panel B viser svarene av et SE til to påfølgende naturlig såret hendelser. En 4. stadium larve av kål butterfly (Pieris brassicae) ble brukt i dette eksperimentet. Larven første kuttet en ikke-nabo blad (i forhold til EPG registrert blad), indusere en langsom, forbigående depolarisering. Så, ca 7 min senere, larven kutte en annen nabo blad, noe som utløste en dobbel depolarization signal (dvs. inneholder en langsom og en rask forbigående depolariseringer) i bladlus-innspilte SE. Pilene viser tid hvor såreneble påført. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikkelen gir en detaljert protokoll for å lage elektrisk Penetration Graf (EPG) innspillinger. EPG teknikken er godt etablert, med 100-200 aktive brukere over hele verden, og det har vært gjennomført i mange studier på ulike temaer, for eksempel: a) vertsplanten motstand mot bladlus og andre stylet bærende insekter 13; b) plante virus og patogen transmisjonsmekanismer 14; c) insektmiddel virknings (giftighet og atferdsendringer) 15; d) EPG har selv vært nyttig å vise at bladlus kamper er en fordel for vinneren som det øker sin fôring effektivitet 16.
Lære å koble insekter for EPG-opptak er ikke vanskelig, men krever tålmodighet og praktisk erfaring å mestre. Fra å gjøre elektroder til finalen kablet insekt, er en praksisperiode på en eller to uker anbefales. I løpet av denne tiden, vil forskeren lest seg / seg med håndteringen av den valgteinsektarter og å gå gjennom alle trinnene vellykket. Kritiske trinn: lodding skikkelig, grundig risting sølv lim hetteglasset før du tar et lim dråpe av riktig størrelse - verken for liten eller for stor - og sikrer riktig elektrisk og mekanisk forbindelse, og plassere gull wire i sølv dråpe på insekt mage på en måte som ikke vil begrense insekt bevegelser. Unnlate å utføre disse trinnene riktig vil føre til dårlig elektrisk tilkobling, noe som vil resultere i data av dårlig eller uakseptabel kvalitet. Når gir kablet insekter tilgang til anlegget, er det viktig å visuelt overvåke dem under den første halvtimen av opptaket. I denne perioden er bladlus bli vant til ledningen, og kan gå bort fra ønsket opptaks sted, eller slippe av anlegget. Derfor kan man trenger å re-posisjonere bladlus i denne perioden. Ved atferds mål, bør ingen re-posisjonering gjøres etter første hAlf time for å hindre at store forskjeller mellom replikater. Dårlig plassert eller droppet-off individer skal kastes.
I tillegg til å gi en protokoll for EPG-opptak, rekapitulerer denne artikkelen funksjonene i EPG krets som er relevante for sin søknad som metode i anlegget intracellulære elektrofysiologi (figur 1). Den viktigste funksjonen av EPG-elektroder er at de er meget celle-spesifikke elektroder som gjør det mulig for nøyaktig intracellulære opptak fra SES. I den vanlige EPG forsterkeren, er inngangsmotstanden relativt lav, en GΩ (10 9. Ω). I praksis betyr dette at motstanden endres under opptak påvirke målt potensialet. Dette er ikke et problem i konvensjonell intracellulære elektro med glasselektroder, som vanligvis bruker høyere inngangsmotstand forsterkere. Man kan korrigere for endringene i motstanden som følge av plasmamembranen og fra andre kilder ved hjelp calibrasjon pulser, som i Salvador-Recatalà et al. 1. Et annet alternativ er å øke den vanlige EPG forforsterkeren inngangsmotstand, fra en GΩ til 1,5 TΩ (1,5 x 10 12 Ω) eller til og med til en PΩ (10 15 Ω, avhengig av pre-forsterkerens operasjonsforsterker), som tilsvarer inngangsmotstand i vanlige forsterkere for intracellulære opptaket. EPG-forsterker med høyere inngangsmotstand er referert til her som "EMF-mode EPG" system. I denne forsterker, deaktiverer en bryter normal-modus EPG forsterkeren (se figur 1). I EMF-modus registrerer EPG-elektrode metoden plantecellen potensialer så nøyaktig som vanlige forsterkere som brukes i intracellulære elektrofysiologi. Den eneste forstyrrelse igjen i EPG i emf-modus oppstår fra EMF komponentene av bladlus under SE foring, men disse er forholdsvis lave og ikke gå på akkord med nøyaktigheten av målingene. Dersom forskeren ønsker å samtidig rekordreaksjon av bladlus mot miljøbetinget spenningsfaktorer (for eksempel endringer i spytt og inntak), og informasjonen om SE membranpotensialet, deretter normal-modus på EPG anbefales. I så fall, å påføre den kalibrerte puls gir akseptable, tilnærmede verdier av membranpotensialet.
Mangelen på egnede metoder for kjøp av elektriske reaksjoner fra phloem blodkar in vivo er i dag begrensende type og antall spørsmål knyttet til miljømessige stressresponser av planter. Forskere har implementert glasselektroder tre og glass-stylet elektroder 4 for kjøp av intracellulære opptak i SE-selskaper i midvein. I motsetning til disse to typer av elektroder, kan EPG-elektroder anbringes på nesten alle antenne del av anlegget (og til og med på røtter, ved hjelp av rot bladlus). Derfor vil ikke EPG-elektroder til rette for mer omfattende studier i planteelektrofysiologi. Anothennes fordel av EPG-elektroder fremfor konvensjonelle elektroder er at det tidligere tillate utvidet opptaksperioder, noe som gjør mulig å undersøke svarene av enkelt SES til ulike stimuli. Dette er et viktig biofysiske funksjon, og kan gi interessant informasjon om hvordan SES integrere informasjon fra ulike miljømessige stimuli. Ja, de data som vises her beviser at SES reagerer på ulike skadelige stimuli (figur 4), som rettferdiggjør videre forskning på dette viktige biofysiske funksjon av SES.
Antallet elektrofysiologiske studier av SE-selskaper er for liten til å gjøre sammenligninger mellom data innhentet med EPG-elektroder og data innhentet med tradisjonelle glasselektroder. Faktisk er det ingen data i litteraturen om stimulanse-indusert elektriske signaler i SES av Arabidopsis, anskaffet med en tradisjonell metode til vår kunnskap, være glasselektroder eller glass-stylet elektroder. Ved hjelp av glasselektroder, Rhodos ogsamarbeidspartnere 3 fant at varme induserer aksjonspotensial-lignende toppene i SES av tomatplanter. Den raske depolarization at de viste hadde en størrelse på omkring 70 mV, som forekommer på toppen av en liten, langsommere depolarisering. Dette er i tråd med våre elektriske signaler som overtas av EPG-elektroder 1, selv om forsiktighet bør utvises når man sammenligner elektriske signaler fra to forskjellige plantearter, og indusert av ulike typer stimuli.
EPG-elektroden er en allsidig og elegant verktøy for å studere de elektrofysiologiske responser av barken celler til forskjellige typer stimuli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
VSR ble støttet av en IIF Marie Curie Grant (sår i EARTH, akronym for: Sår indusert elektriske signaler i Arabidopsis thaliana).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brass connector pins | EPG Systems/hardw.shop | Φ 1.2 mm | |
| Thin copper wire | EPG Systems/hardw.shop | approx. Φ 0.2 mm | |
| Thin gold wire | EPG Systems | Φ 18 µm | |
| Soldering fluid | hardware shop | matching the soldering wire | |
| Resin-cored soldering wire | hardware shop | ||
| Styrofoam | any | ||
| Water-based silver glue | EPG Systems | recipe in: www.epgsystems.eu | |
| Paper wipes | Kimberly-Clark | 5511 | |
| Soldering bolt | any | ||
| Stereomicroscope | Hund Wetzlar | minimum magnification is 10X | |
| Small scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10050-00 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Vortex | A. Hartenstein | L46 | |
| Watercolor brushes | any | Number 1 or 2 | |
| Air suction device | see description in: www.epgsystems.eu | ||
| Insect pins | any | No. 1 or 2 | |
| Solid table | |||
| Faraday cage | Hand made | ||
| Computer | Fujitsu Siemens | ||
| Data acquisition software | EPG Systems | Stylet+d | |
| Giga-4 (-8) Complete System | EPG Systems | ||
| includes the following: | |||
| Main control box with USB output | Di155/Di710 | 12/14 bit, rate 100 Hz (softw. fixed) | |
| EPG probes 4 (8) | 50x DC pre-amplifier | ||
| Swivel clamps on rod | |||
| DC power adaptor | bipolar, 230/115 VAC to -/+8 VDC | ||
| Plant electrodes and cables | |||
| Additional test and ground cables |
References
- Salvador-Recatalà, V., Tjallingii, W. F., Farmer, E. E. Real-time, in vivo. intracellular recordings of caterpillar-induced depolarization waves in sieve elements using aphid electrodes. New Phytologist. 203 (2), 674-684 (2014).
- Van Bel, A. J., Knoblauch, M., Furch, A. C., Hafke, J. B. (Questions)n on phloem biology. 1. Electropotential waves, Ca2+ fluxes and cellular cascades along the propagation pathway. Plant Science. 181 (3), 210-218 (2011).
- Rhodes, J. D., Thain, J. F., Wildon, D. C. The pathway for electrical signal conduction in the wounded tomato plant. Planta. 200, 50-57 (1996).
- Fromm, J., Eschrich, W. Correlation of ionic movements with phloem unloading and loading in barley leaves. Plant Physiology and Biochemistry. 27, 577-585 (1989).
- Brette, R., Destexhe, A.
- Umrath, K. Untersuchungen über Plasma und Plasamstromung an Characeen. IV. Potentialmessungen an Nitella mucronata. mit besonderer Berücksichtingung der Erregungserscheinungen. Protoplasma. 9, 576-597 (1930).
- Umrath, K. Der Erregungsvorgang bei Nitella mucronata. Protoplasma. 17, 258-300 (1932).
- Carden, D. E., Walker, D. J., Flowers, T. J., Miller, A. J. Single-cell measurements of the contribution of cytosolic Na+ and K+ to salt tolerance. Plant Physiology. 131 (2), 676-683 (2003).
- Miles, P. W., McLean, D. L., Kinsey, M. G. Evidence that two species of aphid ingest food through an open stylet sheath. Experientia. 20 (10), 582 (1964).
- McLean, D. L., Kinsey, M. G. A technique for electronically recording aphid feeding and salivation. Nature. 202, 1358-1359 (1965).
- Tjallingii, W. F. Electronic recording of penetration behaviour by aphids. Entomologia Experimentalis et Applicata. 24, 721-730 (1978).
- Tjallingii, W. F. Membrane potentials as an indication for plant cell penetration by aphid stylets. Entomologia Experimentalis et Applicata. 38, 187-193 (1985).
- Alvarez, E. E., et al. Comparative analysis of Solanum stoloniferum. responses to probing by the green peach aphid Myzus persicae. and the potato aphid Macrosiphum euphorbiae. Insect Science. 20 (2), 207-227 (2013).
- Carmo-Sousa, M., Moreno, A., Garzo, E., Fereres, A. A non-persistently transmitted virus induces a pull-push strategy in its aphid vector to optimize transmission and spread. Virus Research. 186, 38-46 (2014).
- Jacobson, A. L., Kennedy, G. G. Electrical Penetration Graph studies to investigate the effects of cyantraniliprole on feeding behavior of Myzus persicae. (Hemiptera: Aphididae) on Capsicum annuum. Pest Management Science. 70 (5), 836-840 (2014).
- Morris, G., Foster, W. A. Duelling aphids: electrical penetration graphs reveal the value of fighting for a feeding site. Journal of Experimental Biology. 211 (9), 1490-1494 (2008).
