Abstract
세포의 전기 생리 특성은 종종 자신의 네이티브 환경에서 그들을 해리 후, 시험관에서 공부하고 있습니다. 그러나 유기체 먼 세포 사이의 전기 전송의 연구는 생체 내에서 자신의 네이티브 환경에 내장 세포의 유물이없는 기록을 필요로한다. 공장에서 unwounded 지역으로 부상에서 전기 신호의 전송은 긴 있기 때문에 식물 학자의 관심을 감정을 상하게했다. 사부, 공장 전반에 걸쳐 확산되는 식물 혈관의 살아있는 부분은, 식물에서 전기 전송의 주요 조직으로 가정하고있다. 적합한 전기 생리 학적 방법의 부족은 생체 내에서 체관부 세포의 전기적 특성의 연구에 많은 문제를 야기. 여기에서 우리는 전기 침투 감에 통합 사는 진딧물, 또는 다른 사부 공급 hemipteran 곤충을 사용 체 요소의 세포 내 전기 생리학 (SES)에 대한 새로운 접근 방식을 제시산도 (EPG) 회로. 이 방법의 다양성, 안정성 및 정확성은 가능한 기록 모델 식물 애기 장대 (1)의 중심 정맥의 SE들에 상세히 상처 유발하는 전기 신호를 연구했다. 여기서 우리는 EPG 전극 용이 한계 정맥 세포의 전기 생리 SE를 레코딩을 위해 구현 될 수 있으며,뿐만 아니라, 여러 외부 자극을 전기 신호로 응답 SE의 용량을 연구하는 것을 보여준다. SE의 세포 내 전기 생리학에인가 EPG 방식은 식물 / 곤충 조합의 다수의 식물 종의 다양한 구현에 많은 연구가 목적이 될 수있다.
Introduction
장거리 전기 신호를 생성하는 기능은 외부 자극에 대한 반응을 효율적으로 허용 다세포 생물의 유리한 특성이다. 이 특성은 식물과 동물에 독립적으로 진화, 따라서 수렴 진화의 경우를 나타내고있다. 집중적 인 연구의 주제는 전기 신호가 이러한 동물에서 자극 유발 된 전기 신호의 송신 및 신경 근육 수축, 분자 단위로, 전송 메커니즘, 및 함수 등의 동물에서 중요한 기능과 결합되는 것을 감안할. 대조적으로, 식물에서 자극 유도 전기 신호는 거의 연구 주목 받고있다. 식물이 더 신경이나 근육이 없지만, 식물이 환경 적 요인에 대한 그들의 반응에 중요한 역할을에서 그 자극에 의한 전기 신호를 가정 할 수있는 충분한 증거가있을 것 같습니다.
체관부, 식물 맥관계의 생활 성분은 주요 서브으로 가정 한자극 유발 된 전기 신호의 전송을위한 strate는 자극으로부터 / 비 자극 / 손상되지 않은 부분이 손상. 체관부의 주요 세포는 체 요소 (SES), 비교적 간단한, 가늘고 긴 세포이다. SE들 중 단이 공장으로 확산되는 연속적인 저 저항, 관 자체 시스템을 형성하는 다른 SE들에 접속된다. 이러한 고도로 전문화 된 세포의 전기적 특성에 대한 연구는 거의 그러나있다. 이러한 이전의 연구에서 연구자와 함께 SE를 액세스하거나 유리 미세 전극 stylectomy (절단) 후 진딧물의 3에 결합 된 유리 전극을 심고 삽입 stylets, 4. 유리 마이크로 전극은 직경이 1 ㎛ 미만의 미세한 팁으로 열에 일단 당겨 다음의 KCl 수용액으로 채워진다 유리 모세관으로부터 만들어진다. KCl을 채워진 유리 전극 삽입 자세 / AgCl로 또는 백금 와이어는 다음 증폭기의 입력에 접속하고있다 리파전극은 회로를 완성 관심 셀을 둘러싸 욕에 삽입된다. 이 설정은 지시 대상 외 전극 및 세포 측정 전극, 즉, 셀 (5)의 막 전위 사이의 전위차를 기록한다. 이 방법은 Umrath 조류 Nitella 6,7을 사용하여, 식물 세포에서 세포 내 첫번째 기록했다. Nitella은 비교적 간단한 많은 세포와 유기체, 세포 내 전기 생리학 실험하는 것이 의무이다. 대조적으로, 다중 - 셀룰러, 입체 육상 식물의 작은 세포에 세포 내 유리 전극의 삽입은, 기술적으로 요구하고 고도로 숙련 된 연구자뿐만 아니라 복잡한 시각화, 미세 조작 및 진동 방지 장치를 필요로한다. 유리 전극은 뿌리 표피 세포 (8)과 같은 식물의 표면 세포에서 기록하기에 적합하지만, 세포 내 recordin세포에서 GS 깊이 결과를 혼란, 같은 SE를, 아주 큰 원인 손상에 의한 반응으로 식물의 조직에 포함. 1989 년 프롬과 Eschrich는 다른 방법의 사용을보고 유리 전극 stylectomy 후 4 진딧물 stylets에 결합 된 '진딧물 법'이라고. 유리 전극처럼가요 stylets은 조직 또는 세포 손상을 유발하지 않기 때문에 진딧물 방법은 침습적이다. 진딧물의 stylets 식물 침투에 대한 자연의 위대한 발명이며, 진딧물은 상당히 SE들을 찾는 인간보다 더 숙련 된입니다. 불행하게도,이 진딧물 방법은 전문 기술 및 장비의 측면에서 매우 요구하고있다. stylectomy시에 안정적으로 삽입 SE와 탐침 - 또한,이 기술을 구현하는 각 실험의 성공은 급송 모드 인 진딧물에 전적으로 의존한다. 회고전의 생각, 하나는이 기술의 성공의 확률이 난을 수 있었던 것을 알 수있다실험 장치에 적용시 stylectomy 진딧물 탐침은 SE인지 여부를 식별 허용기구를 추가하여 mproved.
1964 년과 클린 킨제이 실시간 9,10에서 진딧물의 급전 동작의 연구 '전자 모니터링 시스템'바와. 이 시스템에서, 진딧물과 탐침 - 관통 공장 전기 회로에 통합 하였다. 그 후, 1978 년, Tjallingii, 시스템의 수정 된 버전을 고안 한 '전기 침투 그래프'(EPG) 시스템 (11, 12)를 불렀다. 원시 전자 감시 시스템은 저항 유래 전위에 민감한 반면 단, EPG 시스템, 기전력 (EMF)의 전위, 즉, 식물 또는 곤충의 발생에서 발생하는 전위에 부가하여 기록 할 수 유래 곤충에 저항 (R). 이것은, 중요한 개선을 나타내는 두 신호 성분, EMF 및 R 때문에,진딧물에 의해 식물의 침투 동안 이벤트에 대한 생물학적 관련 정보를 제공합니다. 무엇 R-구성 요소에 EPG의 프리 앰프는 민감한 만드는 것은 공장 / 진딧물 저항의 평균에 가까운 1 GΩ의 상대적으로 낮은 입력 저항이다. 작은 오프셋 전압 (도 1은, V)의 대략 +100 MV는 한쪽면에 식물 및 곤충에 걸쳐 분할된다 식물, 및 기타의 입력 저항에인가된다. 전압 및 변경 사항은 곤충과 입력 저항 사이의 점 (그림 1A, B)로 측정하고 있습니다. EMF-구성 요소가 곤충에 의한 식물 탐침 끝에서 전위와 전위의 특정 부분 반면 따라서, R-구성 요소는 오프셋 전압의 식물 진딧물 저항 변조를 나타냅니다. 공장 전위 - 여기에 가장 관련성이 - 진딧물 stylets에 의해 구멍이 식물 세포의 주로 막 잠재력이다. 곤충 잠재력은 주로 것으로 보인다두 개의 탐침 운하 내에서 유체의 움직임에 의한 스트리밍 전위, 즉, 음식과 타액 운하; 더 내부의 신경 또는 근육 잠재력은 EPG에 기록되지 않습니다. 실제로, 전극의 끝 부분으로 탐침 팁 기능. 모든 식물 세포에 부정적인 셀의 양극 외부에 대하여 내부에 충전된다. 전기 전류는 (즉, 묽은 용액으로 하전 된 이온의 이동) 외부 그 반대로 내부에서 흐르는 매우 인해 세포막의 높은 저항으로 제한된다. 일반적으로 휴식 잠재력은 일정하게 유지된다. 음이온 퇴실이나 양이온은 세포막을 통해 이동할 때, 막 전위가 '탈분극', 즉 감소된다. 세포 탈분극 자극시 발생. 멤브레인이 손상 및 이온과 누출 될 때 막에서 특정 이온 채널을 열 때 또는 이온은 또는 밖으로 이동합니다. 모든 세포는 T에서 이온 채널과 펌프가그는 셀 안에 다양 이온의 원래 농도를 복원하여 휴면 레벨로 막 전위를 가지고 막을 플라즈마. 휴지 전위와 그 변화는 EMF 요소이며, 따라서, EPG 기법들을 측정하는데 적합하다.
1. EPG 전극 그림. EPG 전극 누구 탐침 안정된 급송 모드 체 요소 (SE)에 삽입되어 전기 침투 그래프 (EPG) 회로에 통합 거실 진딧물이다. 탐침 - 찔려 죽은 SE는 나머지 (패널)에있는 경우, EPG에 의해 기록 된 회로의 전압은 안정과 휴식 전위 레벨 (패널 C, 나머지)에 있습니다. SE 흥분 경우, 전압의 점진적 증가 (패널 C, 탈분극)로 EPG 시각화 자사의 막 탈분극 (패널 B). SE의 이온 균형 즉, 그것은 repolar, 휴식을 반환으로izes, EPG에 의해 기록 된 전압이 점차적으로 나머지 전위 (패널 C, 재분극)로 감소. 패널 C에서, "A"와 "B"는 각각 패널 A 및 B에 도시 된 시나리오를 참조. V = 가변 오프셋 전압원. 리는 입력 저항 =. 1 GΩ 외부 저항에 병행하여, 앰프 (회색, 패널 A와 B) 높은 1.5 TΩ 저항 (OPAMP의) 내부 있습니다. 스위치의 원격 제어에 의해 EPG 프리 앰프는 매우 정확한 전압 값을 얻을 수있게, 모드를 EMF 보통에서 변경 될 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
다음 섹션에서, 우리는 모두 집중 곤충과 식물에 초점을 맞춘 연구를위한 유효 EPG 실험을 수행하기위한 기본 프로토콜 리더를 제공합니다.
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Protocol
1. 진딧물 양육
참고 : EPG 녹화 용 식물과 진딧물 종의 선택은 연구 목적에 따라 달라집니다. 애기 장대에 대한 연구를 들어, 진딧물 Brevicoryne의 brassicae 적합합니다.
- 후면 B. 브라 시카 올레 라 케아에 온실 brassicae 진딧물. 다른 식물 오염을 방지하기 위해, 케이지에서 사육 진딧물 사용 식물 유지. 진딧물과 실험 식물의 오염을 방지하기 위해, 진딧물 양육 식물과 별도의 방에서 (우리의 경우 B의 올레 라 케아와 A. 장대에서) 실험 설비를 유지.
- 중요한 식물의 손상을 초래하거나, 인구 과잉에 도달하기 전에, 2 주마다에 대한 신선한 식물에 진딧물을 전송합니다. 새로운 식민지를 시작하는 신선한 양육 공장에 10 ~ 20 성인 진딧물을 전송합니다.
- 원치 않는 진딧물 종, 기타 곤충 초식 동물, 진딧물 포식 기생자 및 봉에 의한 오염 정기적으로 식물을 양육 모니터나는 진딧물 식민지의 건강에 영향을 미칠 수.
- EPG 녹화에 대한 최종 탈피 후 1 주일 성인, 날개없는 진딧물을 수집합니다.
- 그들은 종종 실수로 다른 식물을 오염시킬 수 기록, 동안 생산 된 일부 자손을 가지고 실험 한 후, 성장 챔버에 사용되지 않은 실험 식물을 반환합니다.
EPG 녹화 2. 곤충 배선
- 황동 커넥터 핀 (손톱, Ø 1.2 mm), 얇은 구리 와이어 (Ø 0.2 mm), 매우 얇은 골드 와이어 (O의 약 20 μm의), 수성은 접착제, 간단한 작은 납땜 볼트를 얻을, 곤충 전극을 만들려면 납땜 유체 및 수지 코어 납땜 와이어, 10 배 배율, 작은 가위 또는 메스,이 미세 집게 및 스티로폼 시트 또는 상자 실체. 참고 : 와류 믹서 유용 할 수 있습니다. 주 : 전극을 만드는 단계별 프로토콜은도 2에 표시된다.
- 진딧물의 경우취급 및 접착제 응용 프로그램은, 구하십시오 작고 부드러운 수채화 camelhair 브러쉬 (크기 2 이하)와 같은 곤충 컬렉션에 사용되는 것과 같은 곤충 핀, 미세 재봉 바늘이나 이쑤시개가 잘 작동 수도있다. 4 단계의 EPG 녹화를 시작하는 방법을 보여줍니다.
- 1 단계.
주 : 1과 2는 아래 곤충 전극을 뺀 진딧물을 준비하는 방법을 보여 단계. 3 단계는 전극에 진딧물을 연결하는 방법을 보여줍니다. 진딧물의 진공 고정 배선시 권장하지만 항상 느린 이동 종 (예를 들면, B를 brassicae) 필요하지 않습니다.- 납땜 볼트에 전환 및 팁 (그림 2A)에서 일부 납땜 와이어 용융. 일부 납땜 유체 (그림 2B)와 황동 커넥터 핀의 머리를 적셔 녹아 납땜 금속 (그림 2C)로 찍어.
- 얇은 구리 와이어의 1-2 ㎝ 길이 부재의 일단 부에 용융 땜납의 금속 피복을 적용 (도2D). 그런 다음 뜨거운 볼트 (그림 2E)에 대해 함께 핀과 구리 와이어를 가져오고 냉각 (그림 2 층)을 응고 멀리 함께 이동합니다.
- 2 단계.
- 부드러운 에멀젼이 표시 될 때까지 철저하게 몇 분 동안은 접착제와 유리 병을 흔들어 (또는 소용돌이). 컷 (가위 또는 메스) 실체 현미경 (그림 2G)의 객체 접시에 골드 와이어 (길이 약 1.5 cm)의 몇 가지.
- (2.3 절 제) 납땜 구리 와이어 황동 핀을 가지고 (그림 2H)를 연 후 유리 병의 뚜껑 내부에서 수집 한 것입니다 작은 은색 접착제 용기에 구리 와이어의 끝을 찍어. 참고 : 작은 물방울이 필요하다.
- 실체 객체 판에 접착제 번지지 않도록 한쪽 끝을 들어올 리면서, 골드 와이어의 조각에 구리 와이어의 접착제 담근 끝을 이동합니다. coppe 겹쳐보십시오두 전선의 중복을 따라 접착제를 배포하는 몇 mm (그림 2I)에 대한 R과 골드 와이어.
- 접착제가 연합 전선을 유지하기에 충분히 건조 될 때까지 기다립니다. 건조 후 접착제의 연락처를 확인하고 가입 전선의 일부는 접착제가없는 부분을 보여 주면 작은 핀 또는 구리 와이어의 다른 조각으로 신선한 풀을 추가 할 수 있습니다.
- 곤충 전극이 준비되면, 스티로폼 조각 삽입 예를 들면, 보관.
주 : 골드 와이어의 길이는 진딧물의 이동의 자유를 결정할 것이다 : 그것은 (5mm 이하) 너무 짧으면 진딧물이 구속 느낄 수 있고, 정상적으로 작동하지 않을 것이다; 그것은 (> 2cm)가 너무 긴 경우, 진딧물 자유롭게 이동한다. 진딧물이 허용하는 경우, 잎의 향축 측면으로 이동하는 경향이있다. 골드 와이어는 잎에 닿으면 신호가 단락 될 것입니다.
- 3 단계.
- 진딧물이 진공을 이용하여, 광 흡수에 의해 제자리에 유지 될 수있다; 이 경우, t를 설치그는 실체 현미경 장치를 빨아. 필드의 중앙에 흡인 개구를 놓는다.
- 철저히 부드러운 에멀젼이 형성 될 때까지 몇 분 (또는 소용돌이) 실버 접착제와 유리 병을 흔들어. 작은 브러시와 진딧물를 수집합니다.
- 복부의 뒤쪽에, 흡인 장치를 켜고 흡입구 (도 2J)에 진딧물 마운트는 실험자에게 돌렸다. 미세 브러시, (양배추 진딧물이 풍부) 복부에서 어떤 표면의 왁스를 제거합니다.
- 접착제 병을 열고 실버 접착제의 아주 작은 물방울 (그림 2K)와 핀 젖은. 진딧물의 복부 (그림 2L-M)의 뒷면에 실버 접착제의 방울을 적용합니다. 적극적으로 다시 접착제 병을 흔들 첫 위에 실버 접착제의 두 번째 방울을 추가, 몇 분 동안 완전히 건조이 방울을 보자. 주 : 실버 접착제 전기 전도체이지만, 그것은 상당한 일으키지 않는다곤충의 표피에 손상.
- 접착제 병을 닫은 후, 젖은 방울에 골드 와이어의 끝을 삽입하고 접착제가 완전히 (그림 2N)을 건조 할 수 있도록하면서 여전히 선을 유지. 다리 또는 안테나에 접착제를 바르는 피하고 이런 일 경우 진딧물을 폐기합니다.
- 흡입 고정 장치를 끄고 조심스럽게 곤충 (그림 2 O)를 들어 올립니다. 필요한 경우, 상기 흡입 장치로부터 진딧물의 리프팅을 돕기 위해 잘 브러쉬를 사용한다.
참고 : 배선 B를 그들은 그것 복부 습식 접착제의 방울을 도포 한 후에 해제되지 않도록 충분한 그립 진딧물을 제공 거친 표면이 정밀 실험실 조직편에 배선 될 수 brassicae는 진공을 필요로하지 않는다. 접착제 건조 후 하나는 미세 브러시의 도움으로 조직의 진딧물을 올릴 수있다. - 스티로폼으로 유선 곤충 황동 핀을 삽입하고 필요한 경우, 계속모든 다른 곤충을 배선하는 EPG 기록 세션을 위해 사용된다.
참고 : 진딧물 배선에 대한 이러한 프로토콜은 우리를 위해 잘 작동합니다. 사용자는 진딧물을 배선 그 / 그녀의 자신의 방법을 찾을 수 있습니다.
- 4 단계.
- 비전 도성 지원에 패러데이 케이지 (그림 2P)에 식물을 넣어 : 페트리 접시 또는 유리 또는 플라스틱 접시를 사용합니다.
- 각 포트의 토양에 식물 전극을 삽입합니다. EPG 프리 앰프 (그림 2 분기)의 입력 커넥터에 유선 곤충의 황동 핀을 삽입합니다. 주 : 토양 전극은 다른 전기 생리 학적 기술에서 사용되는 접지 전극에 대응하지 않는다. 그것은 조정 전극 분극 전압을 보상하기 위해 필요한 전압 오프셋을 갖는다.
- 100 Hz에서의 고정 된 샘플 주파수와 수집 소프트웨어 탐침의 +의 인터페이스에서, 파일 이름을 입력 녹화 시간을 지정하고, 실험의 세부 사항을 지정하는 텍스트를 작성 (처리, 공장 / INSE 주석 행 2 및 3 종의 CT 등)를 포함한다.
- 식물의 적절한 착륙 지점에 곤충을 내리고 수집 소프트웨어 (탐침 +) 인터페이스의 시작 버튼을 클릭하여 레코딩 세션을 시작합니다.
주 1 : 8 채널의 최대가 설정 EPG에서 동시에 사용할 수 있습니다. 한 EPG 전극 또는 식물 당 여러 EPG 전극이 사용될 수있다.
주 2 :이 연구의 초점은 진딧물 문제가있을 때, 제 식물 침투 활동 누락 방지하기 진딧물의 식물 액세스하기 전에 녹화를 시작한다. - 자극에 SE들의 전기 생리 학적 반응을 연구, 진딧물는 진딧물이 지속 체관부 섭취 상에 있는지 확인하기 위해, 사부 상에 입력 된 후 적어도 10 분간 기다린 신호 기준선은 안정된다. 그런 다음에야, 모든 식물 자극 실험을 시작합니다.
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그림 2. 전기 침투 그래프 (EPG) 레코딩을위한 진딧물이나 다른 hemipteran 곤충과 EPG 전극을 만들기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
패널 AI, 공정을 EPG 전극 마이너스 진딧물을 제조 하였다. 먼저, 납땜 볼트 (A)의 선단부에 납땜 금속 조각을 용융. 그리고, 납땜 유체 (B)의 저하에 황동 핀의 헤드를 담그고, 및 인두 팁 볼트 (C)에 용융 금속으로 문의. 이 단계 후에 즉시, 황동 핀 (EF)의 헤드에 접착제를 위해, 납땜 볼트의 선단에 구리 와이어의 단부에 문의. 메스 또는 블레이드, 골드 와이어 (G)의 조각을 잘라. 딥실버가 건조하기 전에 프리 실버 접착제 (H)에 대한 (황동 핀 타단에 결합) 구리 와이어의 단부, 신속는 (I)에 금선 가입. 금선이 우수한 도체이고, 편파 될 수있다. 실제로, 대부분의 경우에, 편광을 검출하기에는 너무 작고, 그래서 경우, 오프셋 전압 (V)로 보상 될 수있다.
패널 조, 전극에 진딧물 (또는 다른 hemipteran 곤충)를 연결하는 데 필요한 단계. 첫째, 신중하게 잘 수채화 브러시와 진딧물을 들어 올려 진공 흡입 장치 (J)의 개통에 놓습니다. 진공 펌프를 켜고 흡입을 적용 할 종이와 공기 밸브 구멍을 커버합니다. 실버 접착제 (K)에 곤충 핀의 끝을 찍어, 및 실체 현미경 (LM)에서, 진딧물의 복부 위에 작은 접착제 방울을 넣어. 내실버 접착제가 될 때까지 다음 ~ 20 초, 진딧물 마를에 실버 접착제 방울 전에, 실버 접착제의 젖은 방울에 곤충 전극의 골드 와이어의 끝을 넣고 1-3 분 동안 장소에 보관 완전히 공기 건조 (N). 이때, 흡인 장치에서, 흡입 장치의 공기 밸브 구멍을 덮는 신중 진딧물 제거 종이 조각을 제거하여 흡인을 해제 : 배선 후 진딧물 리프팅 종종 미세 브러쉬에 의해 도움을 필요 (O).
패널 P는 전체 EPG의 개요는 패러데이 케이지 내부 설정을 보여줍니다, 그리고 패널 Q는 EPG의 식물 진딧물 조합의 개요를 보여줍니다. 이 과정에 대한 자세한 설명은 위의 3 항을 참조 할 것.
: : 작은 글자 하나 EPG 전극을 만들 필요가있는 항목을 참조하는 레이블 납땜 볼트를, B : 납땜 금속을 용융;C : 납땜 유체를, D : 황동 커넥터 핀 (못) E : 구리 와이어, F : 오 18μm 골드 와이어; G : 흡입 장치, H : 진딧물, I : 수성은 접착제를, J : 패러데이 케이지, K : 식물 전극; L : EPG 프리 앰프의 입력 커넥터 (BNC).
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Representative Results
이전의 연구에서는 발작 애벌레 일 동안 midvein의 SE들에서 생성 된 전기 신호의 특성의 목적 EPG 전극 기술을 구현 하였다. 그것은 이러한 기술을 구현하기 위해 필요에 따라서 고정 의무, SE-조밀하고 비교적 견고하므로 midvein는, 종래의 유리 전극 용뿐만 아니라, 유리 탐침 전극 용 바람직한 삽입 부위이다. 여기, 우리는 잎의 가장자리 정맥에 그 특히, SE들에 액세스하는 것이 더 어려운에서 전기 생리 정보를 수집의 목적 EPG 전극의 다양성을 이용했다. 그림 3은 일반적인 EPG는 한계 정맥 SE에서 기록을 보여줍니다 A의 원위 상처에 의해 유도 된 전기 신호가 포함 장대 식물. 다르게 주요 정맥의 SE들에서, 한계 정맥에서 SE들은에 대응할 수있다 하나, 느린 탈분극 웨이브와 원격 손상에 반응중앙 SE들에 느린 탈분극 파도입니다. 평균적으로, 잎 가장자리의 SE들에서이 원격으로 유도 느린 탈분극이 61 ± 27 초 평균 시간, 37 ± 2 MV의 평균 진폭을했다 (N = 3, ± SEM을 의미). EPG 전극으로 쉽게 얻을 수 이러한 데이터는 unwounded 잎에 상처 유도 전기 신호가 작은 혈관에 체관부에 주요 혈관 번들에서 확산 않는 것이 좋습니다.
여기에서 우리는 또한 SE 분 정도의 시간 간격 이내에 다양한 해로운 자극에 응답 할 수 있는지 여부를 조사하기 위하여, EPG 전극의 견고성을 악용. 두 잎은 잎자루 - 얇은 접합에서 가위로 잘라 때, 그대로 잎에 배치 EPG 전극은 이러한 상처 (그림 4A)에 같은 SE에서 유사한 응답을 발견했습니다. 또 다른 실험에서, 애벌레 상처 링제로서 사용 하였다. 애벌레는 먼저 비 인접 잎을 절단하고, 몇 분 후에는 t 이동OA 이웃 잎뿐만 아니라 그것을 잘라. 비 이웃 잎의 첫 번째 상처는 이전 실험 1 지속적 만 느린 과도 탈분극, 느리고 빠른 탈분극을 포함하는 완전한 전기 신호를 유도 이웃 잎에서 두 번째로 상처를 유도하는 반면. 이러한 데이터는 체 소자 서로 분 이내에 다른 잎에 상처 입은 여러 이벤트를 감지 할 수 있음을 보여준다.
그림 3. EPG 전극 진딧물 Brevicoryne의 brassicae의 사부 공급 단계. 전기 침투 그래프 (EPG) 신호 세그먼트와 한계 정맥에 체 요소 (SES)에서 상처에 의한 전기 신호의 세포 내 녹음. EPG 기록 진딧물은 잎 # 8 (애기 장대의 한계 정맥에있는 SE에서 먹이좌측에 도시 된 만화, 야생형). EPG 신호는 곧 근위 이웃 잎 (잎 # 3)를 절단 한 후 한계 SE에서 느린 탈분극 파를 보여줍니다. 리듬, 작은, 아래로 빠른 신호 성분이 섭취 단계 (파형 E2) 동안 탐침의 식품 운하를 따라 수액의 리듬 상승에서 발생하는 스트리밍 잠재력을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
EPG 전극으로 얻은 체 요소의 자극 (SES)를 부상으로 그림 4. 여러 전기 응답 진딧물 플랜트 (Brevicoryne brassicae - 애기 장대)의 견고성. 상호 작용과 SE-삽입 진딧물 stylets의 안정성의 중요한 특성이다 EPG-ELE긴 EPG 녹화 (시간)의 취득을 허용 ctrodes. 여기서 우리는 SE는 두 개의 원격 상처 자극에 응답 할 수 있는지 여부를 조사하기 위해 이러한 특성을 이용했다. 패널은 연속적으로 두 개의 서로 다른 이웃 잎에 입은 두 인공 상처 이벤트 (가위로 잎 절단)에 SE의 응답을 보여줍니다. 두 자극 사이에 약 17 분의 간격이있다. 패널 B는 두 개의 연속적인 자연의 상처 이벤트에 SE의 응답을 보여줍니다. 배추 흰나비 (Pieris brassicae)의 4 번째 령 애벌레는이 실험에 사용되었다. 애벌레는 처음 느린, 과도 탈분극을 유도, (EPG 기록 리프와 관련하여)이 아닌 이웃 잎을 잘라. 그런 다음, 약 7 분 후, 애벌레 이중 탈분극 신호를 트리거 다른 이웃 잎을 잘라 (즉, 느리고 빠른 과도 depolarizations를 포함) 진딧물 기록 SE에. 화살표는 시간을 표시 함 상처가해졌다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 문서에서는 전기 침투 그래프 (EPG) 녹음을 만들기위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. EPG 기술은 물론 전 세계적으로 100 ~ 200 활성 사용자와, 설립하고, 예를 들어 서로 다른 주제에 대한 많은 연구, 구현되었습니다) 진딧물과 다른 탐침 베어링 곤충 (13)에 대한 호스트 공장 저항; b)는 식물 바이러스 및 병원균 전송 메커니즘 (14); 행동의 C) 살충제 모드 (독성과 행동의 변화) (15); D) 전자 프로그램 가이드 (EPG)도 그것의 먹이 효율 16 증가로 그 진딧물 싸움은 승자에 대한 유리한 입증 유용했다.
EPG 녹화 곤충를 연결하는 배우는 것은 어려운 것이 아니라 인내와 마스터 실무 경험을 필요로한다. 최종 유선 곤충에 전극을 만들기에서, 하나 또는 2 주 연습 기간을 권장합니다. 이 시간 동안, 연구원은 선택의 처리에 / 자신을 자신을했습니다 것곤충 종은 성공적으로 모든 단계를 진행합니다. 중요한 단계는 다음과 같습니다 철저하게 적당한 크기의 접착제 방울을 복용하기 전에 실버 접착제 병을 흔들어, 제대로 납땜 - 어느 쪽도없는 너무 작은도 너무 큰 - 적절한 전기적, 기계적 연결을 보장하고, 곤충의 복부에 실버 방울 내에서 골드 와이어를 배치 방식으로 즉, 곤충의 움직임을 제한하지 않습니다. 이들 과정을 올바르게 수행하기 위해 실패하는 것은 가난한 또는 허용 할 수없는 품질의 데이터가 발생합니다 가난한 전기 연결, 발생합니다. 공장 곤충 유선 액세스를 제공 할 때, 육안으로 기록 전반 시간 동안 이들을 감시하는 것이 중요하다. 이 기간 동안, 진딧물은 와이어에 익숙해되고있다, 멀리 원하는 녹화 장소에서 도보로, 또는 공장을 떨어질 수 있습니다. 그러므로, 사람은이 기간 동안 진디 다시 위치 할 수있다. 행동 목표 인 경우, 어떠한 재 위치는 제 시간 후에 수행되지 않아야ALF 시간은 복제 사이의 큰 차이를 방지합니다. 저조한 위치 또는 떨어 오프 개인은 폐기해야합니다.
EPG 녹화를위한 프로토콜을 제공하는 것 외에도,이 문서는 식물 세포 내 전기 생리학의 방법으로 그 적용 (그림 1)에 대한 관련이있는 EPG 회로의 기능을 되풀이되었습니다. EPG 전극의 주요 특징은 SE를 세포 내에서 정확한 기록을 허용 고도로 셀 고유 전극된다는 것이다. 일반 EPG 증폭기에서, 입력 저항이 상대적으로 낮은 1 GΩ (10 9 Ω). 실제로,이 기록시의 저항 변화가 측정에 영향을 미칠 가능성이 있다는 것을 의미한다. 이것은 일반적으로 높은 입력 저항 증폭기를 사용하는 유리 전극과 종래의 세포 내 전기 생리학에 문제가되지 않는다. 하나는 세포막에서 발생하는 저항의 변화와 캘리 브레이션을 사용하여 다른 소스에서 수정할 수 있습니다엘살바도르-Recatalà 외. 1과 ATION 펄스. 또 다른 옵션은 입력 저항에 대응 1.5 TΩ (1.5 × 10 12 Ω) 또는 1 PΩ (1015 Ω, 프리 앰프의 OPAMP)에 따라, 1 GΩ에서, 일반 EPG 전치 증폭기의 입력 저항을 증가시키는 세포 내 기록을 위해 일반 앰프에. 높은 입력 저항 증폭기는 EPG "EMF 모드 EPG"시스템으로서 여기에 언급된다. 이 앰프에서, 스위치는 일반 모드 EPG 증폭기 (그림 1 참조) 비활성화합니다. EMF 모드에서는, EPG 전극법는 식물 세포 전위 정확하게 같은 세포 내 전기 생리학에 사용되는 일반적인 증폭기를 기록한다. EMF 모드에서 EPG에 남아 만 교란 SE 수유 동안 진딧물의 EMF 구성 요소에서 발생하지만, 이는 매우 낮고 측정의 정확성을 손상시키지 않는다. 연구원은 동시에 기록하고자하는 경우환경 스트레스 요인에 진딧물의 반응 (예를 들어, 타액의 분비 및 섭취의 변화) 및 SE 막 전위의 정보는 다음 EPG의 정상 모드를 권장합니다. 그 경우, 교정 펄스를인가하여 막 전위의 허용 가능한 추정 값을 제공한다.
생체 내에서 혈관의 체관부 전기 응답의 수집을위한 적절한 방법의 결여는 현재 식물의 환경 스트레스 반응과 관련된 질문의 종류와 수를 제한한다. 연구진은 midvein에서 SE를 세포 내 기록의 수집 용 유리 전극 (3)과 유리 탐침 전극 (4)을 구현했다. 전극의 두 가지 유형과는 대조적으로, EPG는 전극 (뿌리 진딧물을 사용하고, 심지어 뿌리) 식물의 거의 모든 부분이 공중에 배치 될 수있다. 따라서, EPG 전극 식물 전기 생리학에서보다 포괄적 인 연구를 촉진 할 것이다. Anot기존의 전극을 통해 EPG 전극의 그녀의 장점은 전자가 다양한 자극에 대한 하나의 SE들의 반응을 조사 가능하게 확장 기록 기간을 허용한다는 것입니다. 이것은 중요한 생물 리 학적 특징이며, SE의 자극이 다른 환경에서 정보를 통합하는 방법에 관한 흥미있는 정보를 제공 할 수있다. 사실, 여기에 표시된 데이터는 SE를이 SE를이 중요한 생물 물리학 적 기능에 대한 추가 연구를 정당화 다양한 손상 자극 (그림 4)에 응답 할 것을 증명한다.
SE들의 전기 생리 학적 연구의 수는 EPG 전극으로 얻은 데이터와 전통적인 유리 전극 얻어진 데이터와의 비교를 위해 너무 작다. 사실, 우리의 지식에 유리 전극 또는 유리 탐침 전극 수, 전통적인 방법으로 획득 한 애기 장대의 SE들에 자극에 의한 전기 신호에 문헌에 데이터가 없습니다. 사용 유리 전극, 로즈와공동 작업자 3 열 토마토 식물의 SE들에 활동 전위와 같은 스파이크를 유도하는 것으로 나타났습니다. 이들이 보여 빠른 탈분극이 작고 느린 탈분극 위에 발생하는 약 70 MV의 크기를 가졌다. 이 치료는 다음의 두가지 상이한 식물 종으로부터 전기 신호를 비교하는 경우 촬영과 다른 유형의 자극에 의해 유도해야되지만, EPG 전극 (1)에 의해 취득 된 우리의 전기 신호와 일치한다.
EPG 전극은 자극의 여러 유형에 체관부 세포의 전기 생리 학적 반응을 연구하기위한 다양한 기능과 고급 툴이다.
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Acknowledgments
VSR은 IIF 마리 퀴리 그랜트에 의해 지원되었다 (지구 상처, 약어에 대한 : 상처 애기 장대에서 전기 신호를 유도).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brass connector pins | EPG Systems/hardw.shop | Φ 1.2 mm | |
| Thin copper wire | EPG Systems/hardw.shop | approx. Φ 0.2 mm | |
| Thin gold wire | EPG Systems | Φ 18 µm | |
| Soldering fluid | hardware shop | matching the soldering wire | |
| Resin-cored soldering wire | hardware shop | ||
| Styrofoam | any | ||
| Water-based silver glue | EPG Systems | recipe in: www.epgsystems.eu | |
| Paper wipes | Kimberly-Clark | 5511 | |
| Soldering bolt | any | ||
| Stereomicroscope | Hund Wetzlar | minimum magnification is 10X | |
| Small scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10050-00 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Vortex | A. Hartenstein | L46 | |
| Watercolor brushes | any | Number 1 or 2 | |
| Air suction device | see description in: www.epgsystems.eu | ||
| Insect pins | any | No. 1 or 2 | |
| Solid table | |||
| Faraday cage | Hand made | ||
| Computer | Fujitsu Siemens | ||
| Data acquisition software | EPG Systems | Stylet+d | |
| Giga-4 (-8) Complete System | EPG Systems | ||
| includes the following: | |||
| Main control box with USB output | Di155/Di710 | 12/14 bit, rate 100 Hz (softw. fixed) | |
| EPG probes 4 (8) | 50x DC pre-amplifier | ||
| Swivel clamps on rod | |||
| DC power adaptor | bipolar, 230/115 VAC to -/+8 VDC | ||
| Plant electrodes and cables | |||
| Additional test and ground cables |
References
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